Summary
Dit protocol biedt een workflow op hoe te combineren met kunstmatige microRNA-gemedieerde RNA-interferentie met optogenetics te stimuleren specifiek presynaptische los met verminderde expressie van selectieve gene(s) binnen intact neuronale circuits.
Abstract
Het doel van dit protocol is te karakteriseren van het effect van gene knockdown op presynaptische functie binnen intact neuronale circuits. We beschrijven een werkstroom op hoe te combineren met kunstmatige microRNA (miR)-gemedieerde van RNA-interferentie met optogenetics tot selectieve stimulatie van gemanipuleerde presynaptische los in acute hersenen plakjes. De experimentele aanpak impliceert het gebruik van een enkele virale constructie en een enkel neuron-specific promotor te rijden van de uitdrukking van zowel een optogenetic-sonde en kunstmatige miR(s) tegen presynaptische gene(s). Wanneer stereotactically geïnjecteerd in de regio van de hersenen van belang, maakt de uitgesproken constructie het mogelijk om te stimuleren met licht uitsluitend de neuronen met verminderde expressie van de gene(s) onderzochte. Deze strategie vereist geen ontwikkeling en onderhoud van genetisch gemodificeerde muis lijnen en kan in principe worden toegepast op andere organismen en op elke neuronale gen van keuze. Wij hebben onlangs toegepast om te onderzoeken hoe het knockdown van alternatieve splice isoforms van exocytose P/Q-type spanning-gated calcium kanalen (VGCCs) op korte termijn synaptische plasticiteit op CA3 aan CA1 excitatory synapsen in acute hippocampal plakjes regelt. Een soortgelijke aanpak kan ook worden gebruikt om te manipuleren en sonde van de neuronale circuit in vivo.
Introduction
Dit protocol beschrijft een nieuwe aanpak het effect van gene knockdown op presynaptische functie binnen intact neuronale schakelingen te karakteriseren. Onderzoeken van de presynaptische functie in intact neuronale circuit is uitdagend omdat vele presynaptische los te klein zijn en ver weg van het soma dat gecombineerde moleculaire en elektrofysiologische interventies. Hoewel de interferentie van RNA biedt een krachtig en flexibel middel om vechtpartij synaptic eiwitten1, is deze aanpak gebruikt spaarzaam te onderzoeken van exocytose functie, want het is moeilijk op te sporen van de effecten van knockdown met behulp van traditionele elektrische stimulaties, die geen onderscheid tussen maken gemanipuleerd en naïef presynaptische los2. Hier beschrijven we hoe te combineren met kunstmatige microRNA (miR)-gemedieerde van RNA-interferentie met onlangs ontwikkelde optogenetic-technologie om het bereiken van selectieve stimulatie van gemanipuleerde presynaptische los in acute hersenen plakjes.
Hoewel voorwaardelijke knock-out muizen in combinatie met electrofysiologie kunnen ook worden gebruikt voor het onderzoeken van de functie van de presynaptische eiwitten3,4, nodig onze strategie niet de ontwikkeling en het onderhoud van genetisch gemodificeerde muis lijnen en ook gemakkelijk kan worden gebruikt om het neerhalen van specifieke isoforms van een gen. Ten opzichte van meer algemeen gebruikte korte haarspeld RNAs (shRNAs), kunstmatige miRs, die we hier gebruiken, bieden belangrijke voordelen voor knockdown in neuronen. In tegenstelling tot shRNAs, kunnen ze onder de controle van een polymerase II promotor1worden uitgedrukt. Dus, een enkele promotor kan worden gebruikt om te rijden de expressie van miR zowel een optogenetic-sonde, samen met een fluorescerende verslaggever. Op deze manier kan de grootte van de constructie worden gehouden binnen de grenzen van de verpakking van recombinante virussen adeno-geassocieerde (rAAV, figuur 1A). Ook vermindert het gebruik van een interne constructie en een enkele promotor experimentele variabiliteit omdat het zorgt voor de uitdrukking van de miR, de optogenetic sonde en de fluorescerende verslaggever in een vaste verhouding.
Wij hebben onlangs deze technologie te onderzoeken van de rol van alternatief afgesplitste isoforms van exocytose calcium kanalen in de hippocampus5toegepast. Een dergelijke strategie geldt over het algemeen aan het bestuderen van de fysiologische relevantie van andere presynaptically uitgedrukte proteïnen in een circuit van de hersenen van belang.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren die zijn vastgelegd door de Europese Gemeenschappen-Raad (richtlijn 2010/63/EU van 4 maart 2014) en zijn goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van gezondheid.
1. ontwerp van microRNAs voor de interferentie van RNA en de evaluatie van hun efficiëntie in heterologe expressiesystemen
Opmerking: Dit protocol vereist kennis van de volgende gevestigde methoden: moleculaire klonen, DNA sequencing, onderhoud van cellijnen, transfectie van het calciumfosfaat, kwantitatieve real time PCR (qRT-PCR), voorbereiding van cel lysates van cellijnen en westelijke bevlekken.
- Bepalen of het gen van belang onderworpen aan alternatieve splicing is. Voor een algemene knockdown van het gen, selecteert u uitsluitend constitutieve exons; voor een knockdown van een specifieke alternatief afgesplitste isovorm, selecteert u de relevante alternatief afgesplitste exon.
- Speciale software (bv https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) gebruiken om te ontwerpen van kunstmatige miRs voor RNA-interferentie tegen de opeenvolging van belang.
Opmerking: Het is belangrijk dat een fundamentele lokale Alignment Search Tool (BLAST) gebruiken om te controleren voor mogelijk af-doelen binnen dezelfde soort. - Selecteer de bovenste drie gerangschikte miRs voor het target-gen.
- De onderdelen van het boven- en onderkant van de geselecteerde miRs van een geschikt bedrijf bestellen Negatieve controle, gebruiken een gecodeerde versie van een het geselecteerde miRs of een miR voorspeld niet te richten op alle bekende gen van de soort gebruikt in de experiment (bijv. gewervelde genen, de miR aanwezig in pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg).
- Ontharden van de respectieve strengen van de boven- en onderkant van de geselecteerde miRs en klonen van hen in een plasmide ontworpen voor expressie van miRs (bijvoorbeeld pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR) met behulp van standaard klonen strategieën.
Opmerking: Het doel is het creëren van een miR expressie cassette die bestaat uit een 5' miR begeleidende regio, de volgorde van de geselecteerde miR en een 3' miR begeleidende regio dat uit de 3-' UTR van een verslaggever gen onder de controle van een RNA polymerase type II promotor kan worden uitgedrukt. - Gebruik DNA rangschikkend om te valideren de juiste invoeging van de geselecteerde miRs.
- Groeien HEK293 cellen in een bevochtigde cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2) met behulp van DMEM medium aangevuld met 10% foetale runderserum, 1 mM NaPyruvate, 10 mM HEPES (pH 7.39) en 1 x penicilline/streptomycine (Pen/Strep).
- Wanneer HEK293 cellen ~ 70% heuvels, transfect hen samen met elk van de miR-expressievectoren en een vector die het beoogde gen uitdrukt in een verhouding van 1:1 DNA met behulp van het calciumfosfaat methode6. Zijn de volgende besturingselementen: (i) untransfected cellen, (ii) cellen transfected met de vector die de gerichte-gen uitdrukt samen met beide drager DNA (bv pBluescript II SK(+)) of (iii) miR controle.
Opmerking: (i) het uitgesproken gerichte gen moeten van dezelfde soorten waarnaar de miRs werden ontworpen, tenzij de sequenties die zijn gericht door de miRs absoluut op het niveau van de nucleotide tussen de twee soorten behouden zijn. (ii) cellijnen dan HEK293 kunnen worden gebruikt. (iii) alternatieve methoden van transfectie, zoals electroporation of liposomen gebaseerde methoden, kunnen worden gebruikt. -
48u na transfectie, lyse de cellen, eiwit gel worden uitgevoerd, westelijke vlek uitvoeren en analyseren van eiwit genoegen nemen met een antilichaam herkennen het doel eiwit. Streven naar een vechtpartij efficiëntie van ≥50%.
Opmerking: Knockdown efficiëntie kan als alternatief of Bovendien worden geëvalueerd (i) door ELISA analyse, (ii) door het meten van de activiteit van het eiwit van de doelstelling, indien van toepassing (bijvoorbeeld huidige dichtheden voor ionenkanalen) of (iii) door qRT-PCR op het niveau van de mRNA als geschikt antilichamen zijn niet beschikbaar (protocol stap 3).- De gerechten van de cultuur plaats op ijs en wassen van de cellen een keer met ijskoude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Gecombineerd de PBS, voeg dan een ijskoude RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP40, 0,1% natrium dodecyl sulfaat (SDS), die protease en phosphatase inhibitors; 1 mL voor een schotel van Ø 100 mm, 0,5 mL voor een schotel van Ø 60 mm).
- Adherente cellen Schraap de schotel met behulp van een cel schraper en zachtjes het overdragen van de celsuspensie in een vooraf gekoelde microcentrifuge buis.
- Centrifugeer de buis bij 15.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C, breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe vooraf gekoelde microcentrifuge buis en negeren de pellet.
- Bepaal de concentratie van de eiwitten met behulp van de BCA eiwit Assay kit of andere geschikte methode (bijvoorbeeld analyse van Bradford).
Opmerking: Monsters kunnen worden bevroren bij-20 ° C of -80 ° C voor later gebruik of onmiddellijk verwerkt. - Overbrengen in een passende hoeveelheid lysates microcentrifuge buizen zodat alle monsters dezelfde eiwitconcentratie hebben en voldoende ijskoude lysis-buffermengsel te halen alle de lysates met hetzelfde volume toevoegen.
Opmerking: 30 tot 50 µg totaal eiwit moet voldoende zijn voor de meeste eiwitten, maar de juiste hoeveelheid worden geladen moet worden bepaald volgens de overvloed van de proteïne van belang. - Toevoegen van een passend bedrag van 2 x Laemmli buffer (4% SDS 10% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.004% bromophenol blauw, 0,125 M Tris-HCl, pH 6.8) en kook de monsters bij 95 ° C gedurende 5 min.
- Laden van de monsters op een acrylamide gel samen met een molecuulgewicht marker. De gel op 100 V voor 1-2 h uitvoeren.
Opmerking: De gel-percentage hangt af van de grootte van de proteïne van belang. - Assembleer de overdracht sandwich en overdracht van de eiwitten van de gel op een membraan bij 100 V voor 2 h. Het membraan kunnen nitrocellulose of PVDF. Activeren van PVDF met methanol voor 1 min en spoel het met overdracht buffer vóór de voorbereiding van de stack.
- Blokkeren van het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met behulp van de buffer met blokkerend (5% melk in PBST (PBS + 0,1% Tween-20)), vervolgens het membraan 's nachts bij 4 ° C incuberen met primair antilichaam verdund in blokkeerbuffer.
- Spoel het membraan gedurende 10 minuten in PBST driemaal en Incubeer het met HRP-geconjugeerde secundair antilichaam in blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Wassen het membraan gedurende 10 minuten in PBS viermaal, dan gelden de chemiluminescentie substraat voor het membraan en de chemiluminescentie signalen met behulp van een CCD camera gebaseerde imager vastleggen.
- Gebruik de software van de analyse van de afbeelding te kwantificeren van de vechtpartij efficiëntie.
- Selecteer de twee meest efficiënte miRs gericht op niet-overlappende sequenties voor verdere functionele testen.
Opmerking: Off-doelstellingen effecten kunnen nooit volledig uit te sluiten voor eventuele miR. Als twee onafhankelijke miRs een soortgelijk effect hebben, is het echter uiterst onwaarschijnlijk dat dit door een dezelfde off-target knockdown komt. - Als de vechtpartij efficiëntie van de geselecteerde miRs niet bevredigend is (< 50%), scherm voor andere miRs. Als alternatief, uiten de meest efficiënte miR(s) in tandem, d.w.z. express hen in meerdere exemplaren van de dezelfde expressie cassette, die leiden grotere efficiëntie van de vechtpartij7 tot kan.
2. bouw van Recombinant Adeno-geassocieerde vectoren voor gecombineerd expressie van Optogenetic-sondes en microRNAs
Opmerking: Dit protocol vereist kennis van de volgende gevestigde methoden: moleculaire klonen, DNA rangschikkend en rAAV productie.
- Kloon, elk van de meest efficiënte miR expressie cassettes in de 3-' UTR van constructies die zijn ontworpen voor de productie van recombinante rAAVs en expressie van excitatory optogenetic probes, zoals pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (figuur 1A), waar de neuron-specific synapsin promotor rijdt uitdrukking van de ultrasnelle channelrhodopsin ChETA, rode fluorescerende verslaggever TdTomato en miR(s) tussen de NheI en EcoRI sites5ingevoegd.
Opmerking: (i) niet overtreffen de limiet van de verpakking van rAAVs, die is ongeveer 4,7 Kb in lengte van ITR (omgekeerde terminal herhalen) tot ITR (figuur 1A, oranje). (ii) de miR expressie cassette moet worden ingevoegd tussen de stop codon en WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional regelgevende Element; Figuur 1A). (iii) integratie van een fluorescente proteïne, zoals TdTomato, is uiterst nuttig, omdat het zorgt voor gemakkelijk toezicht op de lokalisatie en de intensiteit van infectie (protocol stap 4). - Gebruik DNA rangschikkend om te valideren de juiste invoeging van de miR-cassettes.
- Produceren en titer rAAV1/2 volgens de eerder gepubliceerde protocol8, één rAAV1/2 voor elke geselecteerde miR. Een typisch experiment voor de knockdown van één gen zou omvatten twee onafhankelijke miRs tegen de hetzelfde gen en één miR controle. Streven naar een virus-titer van ≥109 virale genoom (vg) / µL.
Let op: rAAVs moeten worden behandeld in een faciliteit Biosafety Level 1 (BSL-1). Neem contact op met institutionele bioveiligheid Comité voor gedetailleerde informatie.
Opmerking: Als het laboratorium beschikt niet over een virale faciliteit of als virale titers niet bevredigend zijn, kan er rAAV productie worden uitbesteed. Bijvoorbeeld, bezoek https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ of https://vcf.charite.de/en/metas/.
3. extractie van RNA van primaire neuronale culturen voor beoordeling van miR Knockdown efficiëntie van endogene genen door qRT-PCR
Opmerking: (i) dit protocol vereist kennis van de volgende gevestigde methoden: voorbereiding en onderhoud van primaire neuronale culturen en qRT-PCR. (ii) de kwantificering van de vechtpartij efficiëntie (stappen 3.1 – 3.14) ten minste 3 keer herhalen (biologische wordt gerepliceerd). (iii) schatting van vechtpartij efficiëntie op het niveau van de mRNA door qRT-PCR is geschikt als een analyse van het eiwitgehalte is uitgesloten, zoals wanneer u neerhalend verbinding aan de randen isoforms waarvoor specifieke antilichamen niet beschikbaar5 zijn.
-
Het bereiden van primaire neuronale culturen uit de regio van de hersenen van belang. Volg het protocol voor corticale culturen gegeven in vorige publicatie9, met de volgende wijzigingen:
- Plaat neuronen in 6 goed platen bij een dichtheid van 500.000 neuronen per putje. 2,5 mL/putje van bijlage medium en 3,3 mL/goed van onderhoud medium gebruiken.
- Indien Astrocyt begroeiing wordt waargenomen, Voeg 0,5 mL per putje van onderhoud medium aangevuld met 7,5 µM van cytosine β-D-arabinofuranoside (voor een eindconcentratie van 1 µM) 3-4 dagen in vitro (DIV).
-
Drie putten per miR (technische wordt gerepliceerd) infecteren op 5-6 DIV. Gebruik de laagste infectieuze dosis, die zal infecteren ≥99% van de neuronen.
- Verwijder van 2 mL van medium uit elk putje en verzamelen in een tube van 50 mL falcon.
- Virus rechtstreeks toevoegen aan de neuronen, meng zachtjes en plaats van de platen terug in de incubator bij 37 ° C.
- Bewaar het verzamelde medium in de incubator. Los van het GLB van de falcon buis dat gas evenwichtsinstelling.
- Na 24u, door de verwijderde middellange weer toe te voegen in elk putje (1.9 mL/putje).
-
Op 17-18 DIV, lyse van de neuronen voor RNA extractie.
Let op: Lysis reagens en chloroform zijn zeer giftig. Werken onder een chemische motorkap en dragen van beschermende kleding; verwijdering van afval volgens uw institutionele en nationale richtlijnen.
Opmerking: Voor stappen 3.3 – 3.13, werken in RNAse-vrij voorwaarden. Draag handschoenen en gebruik RNAse-vrije glaswerk en wegwerp plasticware. Raadpleeg voor meer algemene voorzorgsmaatregelen op hoe te verwerken RNA, bijvoorbeeld bijlage A van het RNeasy Micro handboek beschikbaar online.- Incubeer glas die Pasteur pipettes's nachts in een oven op 180 ° C.
- Kantelen van de platen en het medium volledig uit elk goed met een glazen pipet van Pasteur met een vacuümpomp verbonden gecombineerd.
- Voeg onmiddellijk 700 µL van Lysis reagens toe aan elk putje.
- De oplossing gelijkmatig gespreid door rocken en schudden van de plaat, zorgvuldig en kort met de hand.
- Pipetteer van de oplossing op en neer 4-5 keer of totdat een homogene suspensie wordt verkregen.
- De oplossing van elk putje overboeken naar een aparte 1,5 mL Eppendorf buis.
Opmerking: De cel lysates kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C of onmiddellijk verwerkt.
- Indien nodig, ontdooien cel de lysates op RT, en ga meteen naar stap 3.5.
- 140 µL van chloroform aan elk monster van cel lysates toevoegen.
Opmerking: Chloroform is volatiel en moeilijk te Pipetteer, sluit de Eppendorf buizen zo spoedig mogelijk. - Schud de Eppendorf buizen krachtig gedurende 15 s of totdat de monsters zijn volledig geëmulgeerd.
- Houd het monster op RT gedurende 1-2 minuten, of tot de vloeibare fasen beginnen te scheiden.
- Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Breng de bovenste waterfase (~ 320 µL) met RNA aan een nieuwe Eppendorf buis, en negeren de resterende vloeistof.
Opmerking: Raak niet de lagere roze organische fase of de witte ring tussen de twee fasen met het uiteinde van de pipet. - 1.5 volumes van 100% ethanol (480 µL) toevoegen aan de waterfase en Pipetteer de oplossing langzaam op en neer 3 keer te mengen.
- Zuiveren van RNA met behulp van een commercieel beschikbare kit ontworpen voor zuivering van RNA van kleine steekproeven.
- Concentratie en monster zuiverheid van RNA te kwantificeren met een spectrofotometer.
Opmerking: (i) verwachten opbrengst van ≥3.5 µg per putje; de 260/280 en 260/230 ratio's voor zuiverheid over eiwitten en organische stoffen moet beide worden ≥1.9. (ii) de RNA-monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C of onmiddellijk verwerkt. - Retrotranscribe 250, 500 of 1000 ng van RNA met een commercieel beschikbare kit.
- Kwantificeren van de vechtpartij efficiëntie voor de endogene gen van belang door qRT-PCR. Zie voor een gedetailleerde protocol, referentie10. Streven naar een vechtpartij rendement van ≥60% (Figuur 2). Normaliseren van de gegevens aan ≥2 huishouding genen (bv. GAPDH, ACTB, TUBB3, PPIA) met behulp van de meerdere interne controle gene methode11.
Opmerking: Als werkt in rat, gebruiken de volgende PCR inleidingen voor de huishouding genen: GAPDH-fwd: 5' GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3' en GAPDH-rev: 5' GATGATGACCCTTTTGGC 3'; ACTB-fwd: 5' CATCACTATCGGCAATGAGC 3' en ACTB-rev: 5' TCATGGATGCCACAGGATT 3'; TUBB3-fwd: 5' GCCTTTGGACACCTATTCAG 3' en TUBB3-rev: 5' TCACATTCTTTCCTCACGAC 3'; PPIA-fwd: 5' CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3' en PPIA-rev 5' CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3'.
4. beoordeling van de rol van exocytose eiwitten in Intact neuronale Circuits door gerichte stimulatie van knock-down neuronen met Optogenetics
Opmerking: Het volgende protocol vereist ervaring met elektrofysiologische opnames bij acute hersenen segmenten en toegang tot een elektrofysiologische setup.
- Stereotactically rAAV1/2 te injecteren in de hersenen na een gedetailleerde protocol in eerdere publicatie12. Bepaal de stereotactische coördinaten voor de regio van de hersenen van belang met behulp van stereotactische atlassen voor muis13 of rat hersenen14.
- Gebruik een micropipet trekker te trekken injectie micropipetten met lank van Ø 7 – 9 µm; klem de injectie micropipetten op de schenkels met een schaar. Gebruik een dun marker en grafiek papier kalibreren merken brengen de injectie micropipetten elke 2 mm.
- Anesthetize van het dier met Isofluraan en repareren in het stereotactische apparaat.
- Houd het dier warm gedurende de operatie met een verwarming pad ingesteld bij 37 ° C.
- Bescherm de ogen met oogbeschadigingen en/of glijmiddel.
- Scheren van de vacht op de kop met een elektrisch scheerapparaat.
- Verspreid Povidon jodium op de geschoren hoofd met behulp van een wattenstaafje.
- Controleer onder een ontleden Microscoop, een middellijn incisie.
- Reinig het oppervlak van de schedel met een wattenstaafje, dus de bregma en de lambda om zichtbaar te maken.
- Plaats de injectie micropipet in de houder. Sluit de houder aan de stereotactische arm.
- Bepalen van de x- en y-coördinaten van de plaats van injectie ten opzichte van de bregma en/of de lambda.
- Gebruik een boor dunne de schedel over het doelgebied.
Opmerking: Gebruik zachte rondgaande bewegingen en Vermijd boren door de schedel aangezien dit zal het oppervlak van de hersenen beschadigen. - Als er is bloeden, absorberen buitensporige bloed met handdoek papier.
Opmerking: Overdreven bloed zal het moeilijk maken om correct de z-coördinaat. - ≤2 µL van het virus in de injectie micropipet laden door capillaire werking.
- De injectie micropipet brengen met de x- en y-coördinaten van de plaats van injectie.
- Berekenen van de z-coördinaat van de dura en lagere de pipet langzaam in de hersenen.
- Wanneer de z-coördinaat wordt bereikt, wacht 3 min om weefsel aanpassing mogelijk te maken.
- Lage positieve druk met behulp van een spuit van 1 mL aangesloten via een flexibele buis aan de achterkant van de micropipet van de injectie van toepassing. Visueel controleren de snelheid van het uitwerpen van het virus van de injectie micropipet door middel van de dissectie-Microscoop en gebruik van de kalibreren merken als referentiepunten.
Opmerking: Virus moet worden geïnjecteerd in traag tempo (< 100 nL/min) om weefselschade te voorkomen. - Wanneer injectie is voltooid, wacht 5 minuten, trekken de micropipet injectie van 0,2 mm, een andere 5 min, wachten om te voorkomen dat de terugvoer van het virus.
- Trekken de injectie micropipet langzaam en volledig uit de hersenen en de afzet daarvan in een container gevuld met bleekmiddel.
- De schedel met fysiologische oplossing NAT en suture van de huid met 3-4 steken.
- Toepassing gentamicine zalf op de wond.
- Single-huis het dier in een schone kooi met voedsel pellets en onder een warmte lamp tot het volledig herstelt.
- ≥15 dagen na injectie, decapitate dieren onder diepe Isofluraan verdoving.
- Bereiden van acute hersenen segmenten van de regio van de hersenen van belang met een Vibratome met vergast (95% O2, 5% CO2) ijskoude aCSF oplossing, met (in mM): 123 NaCl, 1,25 KCl 1,25 KH2PO4, 1.5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, 2 NaPyruvate en 18 glucose (osmolariteit aangepast aan 300 mOsm). Bijvoorbeeld, als het doel is om te analyseren van synaptische transmissie van CA3 aan CA1 piramidale neuronen, voorbereiden Sagittaal segmenten van de hippocampal formatie (350 µm dik).
Opmerking: Deze stap vanaf werkt onder low-light voorwaarden ter voorkoming van de activering van de optogenetic sonde door omgevingslicht. - Laat de plakjes herstellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C in de dezelfde aCSF in een kamer die is ontworpen voor het houden van de hersenen segmenten. Houd de plakjes in de dezelfde hersenen segment kamer bij kamertemperatuur tot opname.
Opmerking: Het gebruik van deze voorwaarden, kunnen segmenten gezond voor maximaal 6-8 uur worden gehandhaafd. - Overdracht een schijfje aan een verzonken opname kamer en de superfuse met 2 mL/min van de dezelfde aCSF gebruikt voor herstel aangevuld met 1,5 mM CaCl2 (total Ca2 +: 2.5 mM) en zonder NaPyruvate.
Opmerking: Segmenten worden voorbereid en onderhouden in lage concentratie van Ca2 + (1 mM) tot een minimum beperken van toxiciteit. Opnames worden uitgevoerd in 2.5 mM Ca2 + om de gunst van vesikel release. - Controleer kort het signaal van de geuite fluorescerende verslaggever (bv. TdTomato; Figuur 3B) om na te gaan van de lokalisatie en de intensiteit van infectie.
- Vul een patch-elektrode met een intracellulair oplossing, bevattende (in mM): 110 K-gluconaat, 22 5 NaCl, KCl, 0.5 EGTA, 3 MgCl2, 4 Mg-ATP, 0.5 NB3-GTP, 20 K2-creatine fosfaat, 10 HEPES-KOH (pH 7.28, 290 mΩ).
Opmerking: Gebruik patch elektrode met een pipet weerstand van 5 tot en met 6 mΩ. - Bereiken onder Infrarood verlichting, goede-afdichting geheel-cel configuratie van een neuron ontvangen van synaptic ingangen van de besmette neuronen. Bijvoorbeeld, als CA3 piramidale neuronen waren geïnfecteerd, patch piramidale neuronen in de proximale aan mediale tract CA1 regio (Figuur 3 c).
Opmerking: Serie weerstand kan worden overgelaten aan niet-gecompenseerde, maar het moet constant en laag (≤20 MΩ). - Farmacologie te isoleren van de synaptische stromingen onderzochte gebruiken Bijvoorbeeld, als het doel is om te onderzoeken excitatory synaptische transmissie, blokkeren remmende synaptische transmissie met 10 µM bicuculline.
- Oproepen van synaptic stromingen, bijvoorbeeld excitatory postsynaptisch stromingen (EPSCs), met behulp van een 473 nm blauwe laser gekoppeld aan een optische vezel (Ø ≤250 µm) geplaatst op de waarin van de besmette neuronen (bv. CA3 piramidale neuronen).
- Stel de lengte van de stimulatie tot een minimum, om de mogelijkheid om meer dan één actiepotentiaal per lichte puls. Als gebruikt ChETA, zet hem op 2 ms15.
- Aanpassen van de kracht van de stimulatie van de laser aan opbrengst kleine maar duidelijk aantoonbaar synaptic stromingen (≤50 pA maximale amplitude voor EPSCs opgenomen in een bedrijf potentieel van-70 mV tussen CA3 en CA1 piramidale neuronen; Figuur 3D). Als met behulp van ChETA en een optische vezel van 250 µm in diameter, moet stimulatie sterke punten van 1 – 3 mW op vezel-afsluiten geschikt zijn.
Opmerking: als de kracht van de laser kan niet worden geregeld, gebruik neutrale-opaciteitsfilters. - De 473 nm laserlicht schijnen op de waarin van de besmette neuronen, maar niet op hun axonen. Bijvoorbeeld, het licht schijnen op CA3 waarin, en weg van de collaterals Schaffer, om te voorkomen dat directe depolarisatie van de axonen.
- Tetrodotoxine (TTX; 0,5 µM) van toepassing, een Bloqueur van natrium kanalen, te bevestigen de kanalen van de steekproef zijn actiepotentiaal-gedreven.
- In de verschillende opnames, een selectieve blocker van toepassing op de synaptische huidige onderzochte te bevestigen dat de stimulatie is selectief.
Let op: aanvragen voor bijvoorbeeld NBQX (10 µM) naar AMPA-type glutamaat receptor-gemedieerde EPSCs. - Vergelijk optisch en elektrisch evoked synaptic stromingen in hetzelfde segment acute hersenen in antwoord op herhaalde stimulatie (≥2 prikkels bij ≤20 Hz). Een vergelijkbare mate van synaptic versoepeling of depressie moet worden geobserveerd tussen elektrische en optische stimulatie bij het gebruik van een besturingselement miR, zo suggereert dat soortgelijke cellulaire mechanismen worden geactiveerd door de twee soorten stimulaties.
Opmerking: De bovenstaande stappen zijn nodig om ervoor te zorgen dat optische stimulatie niet toe een directe depolarisatie van exocytose los brengt er, dus het omzeilen van sommige mechanismen van synaptische transmissie.
- Synaptische transmissie in reactie op interne en repetitief stimulaties (≥2 prikkels bij ≤20 Hz) tussen een besturingselement miR en miRs gericht op de presynaptische eiwitten onderzochte vergelijken.
Representative Results
De hierboven beschreven procedures bieden een robuuste methode om te beoordelen hoe synaptische transmissie wordt beïnvloed door de knockdown van synaptic eiwitten in de presynaptische neuronen. Representatieve resultaten op hoe het knockdown alternatief isoforms van exocytose Cav2.1 splice (P/Q-type) VGCCs regelt op korte termijn synaptische plasticiteit op CA3 aan CA1 excitatory synapsen hieronder als voorbeeld gegeven worden.
CAv2.1 (P/Q-type) kanalen zijn de overheersende presynaptische VGCCs op de meest snelle synapsen in het centrale zenuwstelsel. Alternatieve splicing van de wederzijds exclusieve exons 37a en 37b van de porie-vormende α1 subeenheid van Cav2.1 (α1A) produceert twee grote varianten, Cav2.1 [Eva] en Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. Om te bepalen of Cav2.1 [Eva] en Cav2.1 [EFb] differentieel synaptische transmissie en plasticiteit in rat hippocampal piramidale neuronen regelen, we voor het eerst ontwikkeld isovorm-specifieke miRs aan knockdown selectief Cav 2.1 [Eva] of Cav2.1 [EFb]5. Ondanks het korte formaat (97 bp) en hoge gelijkenis (61.86% identiteit op het niveau van de nucleotide) tussen exons 37a en 37b, we drie miR sequenties tegen kon ontwerpen rat Cav2.1 [Eva] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) en twee tegen rat Cav2.1 [EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) met voorspelde hoogrenderende vechtpartij. Als negatieve controle (miR controle), hebben we de pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg plasmide met een reeks die de enige bekende gewervelde gen niet richt gebruikt. Gebaseerd op een eerste scherm in cuvetten van het HEK 293 tegen heterologe kanalen, we geselecteerd miR EFa1, miR EFa3 en miR EFb2 en hun expressie cassettes gekloond in de 3-' UTR van de vector pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, die is ontworpen voor de productie van rAAVs en waar de synapsin promotor rijdt uitdrukking van de ultrasnelle channelrhodopsin ChETA, het rood fluorescerende eiwit TdTomato en de ingevoegde miR (Figuur 1). Wij ook gedupliceerd de cassette van de expressie van miR EFb2 de vechtpartij efficiëntie van deze miR te verhogen.
Vervolgens wij bereid rAAV1/2 voor de bovenstaande vier constructies en gekwantificeerd hun vechtpartij efficiëntie en selectiviteit in primaire rat neuronale culturen met behulp van isovorm-specifieke qRT-PCR. miR EFa1 en miR EFa3 verminderd mRNA van inheemse Cav2.1 [Eva] met ~ 70% maar niet die van Cav2.1 [EFb], terwijl miR EFb verminderd mRNA van inheemse Cav2.1 [EFb] door ~ 60%, maar niet die van Cav2.1 [Eva] (Figuur 2).
Wij vervolgens stereotactically elk van de vier rAAV1/2 in het CA3 gebied ingespoten van de hippocampus voor P18 rats (figuur 3A-C), met de coördinaten van de (A-P/M-L/D-V van Bregma) −2.6 / ± 2,9 / −2.9. Vijftien tot twintig-vier dagen na injectie, we bereid van acute hippocampal segmenten uit rAAV1/2-geïnjecteerd ratten en TdTomato fluorescentie gebruikt om te bevestigen de expressie en de localisatie van rAAVs (figuur 3B). Om te onderzoeken of presynaptische knockdown Cav2.1 [Eva] of Cav2.1 [EFb] beïnvloed op korte termijn synaptische plasticiteit op CA3 aan CA1 synapsen, we selectief besmette CA3 neuronen met korte 473 nm lichte laserpulsen (2 ms durende gestimuleerd ; Figuur 3 c), en de resulterende EPSCs geregistreerd door het patchen piramidale neuronen in de proximale aan mediale tract CA1 regio (Figuur 3 c). We vonden dat het knockdown van Cav2.1 splice isoforms beïnvloed reacties op gepaarde-pulse stimulatie in tegengestelde richtingen: knockdown van Cav2.1 [Eva] (miR EFa1 of miR EFa3) gestimuleerd gekoppeld-pulse versoepeling (PPF) Overwegende dat de vechtpartij van Ca v2.1 [EFb] (miR EFb2) afgeschaft (figuur 3D, E).
Figuur 1: Schema van de constructies voor gecombineerde expressie van de ultrasnelle optogenetic sonde ChETA en isovorm-specifieke miRs tegen Cav2.1 [Eva] en Cav2.1 [EFb]. (A) kaart van de rAAV bouwen pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, met een synapsin promotor (Syn), de ultrasnelle channelrhodopsin ChETA geanelleerd tot TdTomato, en in de proximale 3' UTR, een Cav2.1 splice isovorm-specifieke miR. Restrictie-enzymen getoond zijn enkele scharen. (B) Top, regeling van de expressie-cassette. De synapsin promotor rijdt uitdrukking van zowel ChETA-TdTomato en een isovorm-specifieke miR. Bodem, omgekeerde aanvulling van de target 21-nucleotide sequences, die deel van de miR-cassette uitmaken. Voor miR EFb2 werden twee identieke miR cassettes uitgedrukt in tandem een na de andere. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Evaluatie van de vechtpartij efficiëntie en selectiviteit van isovorm-specifieke miRs voor Cav2.1 [Eva] en Cav2.1 [EFb]. Isovorm-specifieke qRT-PCR analyse op RNA van 17-18 DIV primaire culturen besmet op 6 DIV met rAAVs uitdrukken miRs gericht op beide Cav2.1 [Eva] (miR EFa1 en miR EFa3) dat werd geïsoleerd of Cav2.1 [EFb] (miR EFb2). Gegevens worden genormaliseerd naar de negatieve controle (miR controle). miR EFa1 en miR EFa3 aanzienlijk en selectief verminderen mRNA van Cav2.1 [Eva] (n = 8 en 7 culturen, respectievelijk), terwijl miR EFb aanzienlijk en selectief mRNA van Cav2.1 [EFb vermindert] (n = 4 culturen; *** p < 0,001; one-way analyse van variantie test gevolgd door na detest Tukey-Kramer). Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SEM. Dit percentage is aangepast van Thalhammer, A. et al. 5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Beoordeling van de rol van Cav2.1 [Eva] en Cav2.1 [EFb] in de inheemse hippocampus door gerichte stimulatie van knock-down neuronen met optogenetics. (A) regeling van de cassette van de expressie van de constructies van de rAAV gebruikt voor in-vivo -infectie. (B) Hippocampal deel toont de fluorescentie van dat TdTomato is beperkt tot de regio CA3 en haar prognoses. (C) experimentele configuratie: laserstraal op CA3 waarin werd geregisseerd en patch klem opnames werden uitgevoerd vanaf CA1 piramidale neuronen. (D) 2 ms durende blauw (473 nm) lichte laserpulsen scheen bij 20 Hz roepen EPSCs waarvan PPF is miRs gericht op Cav2.1 [Eva] stegen en afgeschaft door miR voor Cav2.1 [EFb]. Samenvatting van de (E) van gepaarde-pulse verhouding voor experimenten zoals in (D), tonen een toename in PPF voor miR EFa1 miR EFa3 en een afname van miR EFb2, ten opzichte van miR controle (n = 9-11 opnamen; * p = 0,02; ** p = 0,01; *** p < 0.0004; analyse van covariantie). Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SEM. Dit percentage is aangepast van Thalhammer, A. et al. 5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Co uitdrukking van een optogenetic-sonde en een miR tegen een presynaptische gen van belang biedt een krachtige aanpak karakteriseren van het effect van gene knockdown op presynaptische functie binnen intact neuronale circuits. Voor deze experimentele aanpak is het belangrijk om te identificeren en te karakteriseren miRs die zeer doelmatig en selectief in het kloppen van het gen van belang in native systemen. Indien mogelijk, moeten twee of meer onafhankelijke miRs tegen de dezelfde mRNA van belang te controleren voor eventuele af-target effecten worden gebruikt. Redding-experimenten, waarin een miR-resistente gen is opnieuw in het systeem, kunnen worden gebruikt als een besturingselement voor specificiteit.
Met behulp van de dezelfde constructie wil een optogenetic voorziet sonde en een miR stimuleren optisch alleen de presynaptische neuronen die zijn gemanipuleerd. Dit is niet mogelijk met elektrische stimulaties omdat zij geen onderscheid tussen besmette en niet-besmette neuronen maken, waardoor de productie van gemengd en verdunde resultaten. Omdat optische stimulaties meerdere actie potentials15veroorzaken kunnen, is het belangrijk om te kiezen voor alleen de snelste optogenetic sondes, onder een groeiende palet15,19,20,21. Daarnaast is het essentieel om ervoor te zorgen dat optische stimulatie er niet toe brengt een directe depolarisatie van exocytose los, om te voorkomen dat het omzeilen van enkele van de stappen van synaptische transmissie die men wenst te onderzoeken van22.
De experimentele aanpak beschrijven we hier, maakt het mogelijk om te evalueren in parallel de fysiologische relevantie van meerdere presynaptische genen van belang binnen een bepaald tijdsbestek (4-6 maanden). Het is echter belangrijk om te onthouden dat knockdowns zelden 100% bereiken. RAAVs moeten bovendien worden uitgedrukt voor ten minste twee weken te voorzien in maximale vechtpartij en vol expressie van de optogenetic sonde, die een beperking van de tijd vertegenwoordigen kan, bij het onderzoeken van de vroege ontwikkelings processen. Hoewel meer tijd in beslag, voorwaardelijke knock-out muizen beperkt tot presynaptische neuronen, over het algemeen leiden tot volledige verwijdering van het gen van belang en bieden daarom een geldig complementaire aanpak.
Een specifieke voordeel van de miR-technologie is dat hierdoor de uitdrukking van meerdere miRs van de dezelfde promotor. Deze eigenschap is vooral gebruikt om vechtpartij efficiënter door het invoegen van meerdere exemplaren van dezelfde miR of verschillende miRs tegen hetzelfde target gen. Het kan echter ook gebruikt om knockdown meerdere genen met het uitspreken van miRs tegen7,23van de genen van de verschillende doelgroepen. Deze eigenschap kan worden gebruikt om meerdere presynaptische eiwitten om te ontleden presynaptische signaalroutes stilte.
We hebben hier optogenetics gecombineerd met kunstmatige miRs te karakteriseren van de effecten van gene knockdown op presynaptische functie in acute hippocampal plakjes. Een soortgelijke aanpak kan ook worden gebruikt om te manipuleren en sonde neuronale circuit in vivo. Bovendien, zouden kunstmatige miRs combineren met chemogenetic benaderingen een ondervragen neuronale circuit op langere tijd schalen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) voor ondersteuning en Carmela Vitale voor het helpen met de demonstratie. Dit werk werd gefinancierd door IIT en de Compagnia San Paolo (subsidie no. 9734 voor LAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Sigma | Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution | Toxic |
| Animal Temperature Controller with heat pad | WPI | ATC2000 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit | ThermoFisher Scientific | K4936-00 | |
| Brain slices Prechamber | Harvard Apparatus | BSC-PC | |
| CCD camera-based imager | Bio-Rad | ChemiDoc™ MP | |
| Cell Culture reagents | Life Technologies | ||
| Chemiluminescent substrate | GE Helthcare | ECL Western Blotting Reagents, RPN2106 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Toxic |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma | C6645 | |
| Drill | Foredom | K.1030 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gentamicin ointment | Local pharmacy | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Hepes | Sigma | 54459 | |
| Injection micropipettes | Narishige | GD1 | |
| Inorganic salts & detergents | Sigma | ||
| K2-creatine phosphate | Calbiochem | 237911 | |
| KGluconate | Fluka | 60245 | |
| Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-GFM-00100-03 | |
| Membrane | Amersham | Protran™ 0.2 µm NC | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| Micropipette holder | Narishige | IM-H1 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-100 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaPyruvate | Sigma | P5280 | |
| Ocular lubricant | Local pharmacy | Lacrigel | |
| Phosphate inhibitors | Sigma | P0044, P5726 | |
| Protease inhibitors | Sigma | cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | |
| Protein gel electrophoresis and blotting devices | Bio-Rad | Mini-Protean III Cell | |
| Providone iodine | Local pharmacy | Betadine | |
| Qiazol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Toxic |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit |
Qiagen | 205311 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Stereotactic apparatus | WPI | ||
| Tetrodotoxin | Tocris | 1069 | Toxic |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
- Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252 (2015).
- Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
- Maejima, T., et al. Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice. J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).
- Mark, M. D., et al. Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations. J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).
- Thalhammer, A., et al. Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity. Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Chung, K. H., et al. Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155. Nucleic Acids Res. 34 (7), e53 (2006).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Cingolani, L. A., et al. Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins. Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).
- Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition. J Vis Exp. (92), e51845 (2014).
- Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), (2002).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
- Gunaydin, L. A., et al.
- Bourinet, E., et al. Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels. Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).
- Chaudhuri, D., et al. Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels. J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).
- Soong, T. W., et al. Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation. J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi. Nucleic Acids Res. 44 (5), e48 (2016).
