Summary
In questo studio, descriviamo un sistema in-ovo come un promettente strumento per testare composti insulino-mimetici in un organismo vivente. I principali vantaggi includono un'adeguata velocità di trasferimento e costi accettabili, che consentano l'identificazione di sostanze fitochimiche con proprietà insulino-mimetici.
Abstract
I livelli elevati della glicemia nel diabete mellito di tipo 2 (T2DM), una malattia metabolica complessa e multifattoriale, sono causati da errori della β-cellula e resistenza di insulina. Varie strategie, tra cui l'iniezione di insulina o l'utilizzo di farmaci insulino-sensibilizzanti, sono state perseguite per trattare T2DM o almeno ridurre i sintomi. Inoltre, l'applicazione di composti a base di erbe ha attirato l'attenzione aumentante. Pertanto, è necessario trovare sistemi di test efficiente di identificare e caratterizzare composti insulino-mimetici. Qui abbiamo sviluppato un modello di embrione di pulcino modificate, che consente il test di composti sintetici ed estratti di erbe con proprietà insulino-mimetici. Utilizzando un fluorescenza basati su microscopia schermo primario, che quantifica la traslocazione del trasportatore del glucosio (Glut4) 4 alla membrana plasmatica, siamo stati in grado di identificare i composti, principalmente estratti di erbe, che conducono ad un aumento di glucosio intracellulare concentrazioni nei adipocytes. Tuttavia, l'efficacia di queste sostanze richiede ulteriore verifica in un organismo vivente. Così, abbiamo usato un approccio in-ovo per identificare le proprietà di riduzione del glucosio nel sangue. L'approvazione di un comitato etico non è necessaria poiché l'utilizzo di embrioni di pollo durante i primi due terzi dello sviluppo embrionale non è considerato un esperimento sugli animali. Qui, l'applicazione di questo modello è descritto in dettaglio.
Introduction
Diabete mellito è una malattia metabolica caratterizzata da iperglicemia ed è causato da difetti nella secrezione dell'insulina o insulina azione1. Novanta per cento di tutti i casi di diabete sono categoria diabete mellito di tipo 2 (T2DM), dove gli individui dimostrano l'insulino-resistenza e per lo più insulina carenza2. Parecchi fattori sono conosciuti per aumentare l'incidenza globale di T2DM, compreso i cambiamenti nello stile di vita, specialmente quelle relative alla sovranutrizione, l'invecchiamento e l'inattività fisica. Circa 400 milioni di persone hanno il diabete mellito in tutto il mondo secondo l'International Diabetes Federation (IDF). Questo numero è destinato a raggiungere 600 milioni entro i prossimi 20 anni3.
Complicazioni diabetiche causate da iperglicemia ed insulino-resistenza, quali ipertensione, dislipidemia, intolleranza al glucosio, malattia coronarica e malattia vascolare cerebrale, portano ad una significativamente ridotta aspettativa di vita e qualità4. Gli individui commoventi richiedono abbassamento farmacoterapia; Tuttavia, l'utilizzo di farmaci, come la metformina5 spesso è associato con drammatici effetti collaterali6,7,8. Pertanto, sono necessari ulteriori approcci antidiabetici che sono sicura, ampiamente disponibile ed economica.
Nutraceuticals, estratti, piante e diversi composti a base di erbe sono state attribuite alla proprietà insulino-mimetici di funzione modulando varie funzioni cellulari. Una caratteristica importante è la stimolazione della traslocazione del trasportatore del glucosio (GLUT4) 4 alla membrana plasmatica da scompartimenti di immagazzinaggio intracellulare, risultante in un maggiore assorbimento del glucosio in muscolo e tessuto adiposo in assenza di insulina, noto come Proprietà insulino-mimetici9. In precedenza, abbiamo implementato un approccio di base di microscopia di fluorescenza per quantificare il processo di traslocazione di GLUT410. Analisi di numerosi estratti vegetali da un Estratto di libreria11 usando questa analisi ha portato alla identificazione di candidati promettenti. Tuttavia, ulteriori prove negli organismi viventi sono necessari. L'approccio descritto in dettaglio in questa carta, un modello di embrione di pulcino modificate, ha dimostrato di essere un modello promettente per l'identificazione di sostanze con proprietà insulino-mimetici. Esso rappresenta uno strumento attraente l'ampio divario fra gli studi in vitro e in vivo di riempimento e offre diversi vantaggi rispetto ai sistemi esistenti quali costi accettabili, le procedure di movimentazione semplice e adeguata velocità di trasferimento. Inoltre, l'autorizzazione da un comitato etico non è necessaria.
Protocol
Secondo la direttiva 2010/63/UE, esperimenti con embrioni aviari non-covato durante i primi due terzi dello sviluppo embrionale non bisogno del permesso da un comitato etico.
1. conservazione e allevamento delle uova
- Ottenere le uova di gallina fecondate (Tabella materiali) da un allevatore locale.
Nota: Uova possono essere conservate a 14 ° C in atmosfera umidificata per fino a 10 giorni dopo la posa prima dell'uso per gli esperimenti. - Incubare le uova a 38 ° C con un'umidità media del 40-60% per 10 o 11 giorni in un'incubatrice che trasforma costantemente le uova.
2. selezione delle uova
- Controllare le uova per la fecondazione dopo incubazione di fino a 11 giorni. Utilizzare una luce speratura per questo passaggio. Immergere la frangia della lampada speratura in un inkpad e candela il lato aguzzo dell'uovo.
- Per identificare la vescica di aria, controllare per differenze di luminosità sulla parte superiore l'uovo.
Nota: La vescica di aria appare come una regione rotonda, più trasparente, mentre l'albume è più scura quando l'uovo è temperatura. - Dopo il rilevamento della vescica aria, segnare la posizione premendo la lampada leggermente contro l'uovo con l'inchiostro applicato in precedenza.
- Escludere le uova non fecondate a questo punto, che non mostrano una differenza di luminosità tra l'albume e la vescica di aria.
3. iniezione di sostanze
- Preparare la sostanza di interesse (ad es., l'Estratto di erbe o insulina) diluendo la sostanza della concentrazione desiderata nel buffer di soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hank. Ad esempio, 3.3 U/mL di un'analogico in HBSS di insulina disponibile in commercio.
- Per l'applicazione del composto selezionato, attentamente beccare il guscio d'uovo con un aguzzo paio di pinzette in zona marcata della vescica aria. Non fanno un buco più grande del diametro dell'ago della siringa. Iniettare la soluzione tampone (300 µ l) contenenti la sostanza di interesse nell'area pecked tramite una siringa.
Nota: Utilizzare siringhe monouso sterile, 1 ml, puntali per pipette e vasi. Indossare guanti e un camice da laboratorio per gli esperimenti. - Per determinare l'effetto di riduzione del glucosio nel sangue di una sostanza, mettere le uova in incubatrice per 60, 120 e 180 min, rispettivamente. Per determinare i livelli della glicemia basale, includere almeno 10-15 uova di controllo non trattato.
4. prove di tossicità per
- Dopo l'applicazione del composto selezionato per 24 h, equilibrare la membrana guscio d'uovo con tampone di fosfato (PBS) soluzione salina tamponata (sufficiente a coprire la membrana intero guscio d'uovo) per almeno 30 s.
- Rimuovere il tampone PBS in eccesso versandolo distanza.
- Staccare con cautela la membrana guscio d'uovo con un aguzzo paio di pinzette.
- Controllare i vasi sanguigni per lesioni e confermare la vitalità (ad es., movimento) di embrione di pollo.
Nota: Vedere la Figura 1 per il confronto di vitale contro gli embrioni non vitali dopo l'applicazione di un Estratto di erbe tossico.
5. misurazione del valore di glucosio del sangue
- Presso il punto di tempo rispettivo, è attentamente rimuovere il guscio d'uovo sopra la vescica di aria ed equilibrare la membrana guscio d'uovo con il tampone PBS (sufficiente a coprire la membrana intero guscio d'uovo).
- Rimuovere il tampone PBS in eccesso versandolo distanza.
- Staccare con cautela la membrana guscio d'uovo con un aguzzo paio di pinzette.
- Tagliare e rimuovere la membrana corio-allantoidea con una micro-forbice, per consentire il buon accesso ai vasi sanguigni adatti. Tagliate la membrana almeno 2-3 cm. Non tagliare qualsiasi grandi imbarcazioni nella membrana stessa per evitare la perdita di sangue indesiderate dell'embrione.
- Individuare la grande nave proveniente dall'addome dell'embrione. Sollevare questo vaso fuori l'albume con una micro-forbice chiusa e posizionarlo su una striscia di plastica pH. Spostare la striscia di pH sotto la nave, che si tiene con il micro-forbice, e tirare indietro la micro-scissor distanza attentamente.
- Rimuovere 1-2 mL di liquido sotto la membrana corio-allantoidea con una pipetta per evitare la diluizione del sangue nel passaggio successivo. Asciugare il vaso e il nastro di pH con carta da filtro, prima che la nave è tagliata.
- Tagliare il vaso sanguigno con attenzione con un micro-forbice su un lato. Non tagliare completamente la nave.
Nota: La nave è spessa circa 1 mm. Non tagliare più della metà della nave per evitare di tagliare attraverso il vaso interamente, come può scivolare fuori dalla strip e nessun prelievo di sangue è possibile. - Raccogliere il sangue colante da pH-strip utilizzando una pipetta. Dieci microlitri di sangue sono necessari per determinare i livelli di glucosio utilizzando il misuratore di glucosio nel sangue.
6. valutazione statistica
- Calcolare il valore medio di almeno 10 uova individuali al punto temporale e normalizzare questi valori tra i controllo ovociti (non o tampone trattato).
- Successivamente, determinare la percentuale di diminuzione. Inoltre, è possibile utilizzare l'insulina come controllo positivo.
Nota: Ripetere ogni esperimento almeno tre volte.
Representative Results
Descrizione dell'approccio Gluc-HET:
Dopo incubazione con le sostanze di interesse, le uova fecondate sono aperti e preparate per la raccolta del sangue da rimozione del guscio d'uovo (Figura 2). Ulteriore preparazione include equilibrazione e rimozione della membrana guscio d'uovo per ottenere l'accesso alla membrana corio-allantoidea. Questa membrana è quindi tagliata attentamente per fornire l'accesso a un vaso sanguigno adatto per la raccolta del sangue. Preferibilmente, la grande nave proveniente dall'addome dell'embrione è collocata su una striscia di plastica pH. Per evitare la diluizione del sangue durante la raccolta, la nave e la pH-striscia è asciugati con carta da filtro. Il vaso sanguigno viene poi tagliato e colatura sulla striscia di pH del sangue è raccolto per l'analisi utilizzando una pipetta.
Effetti di estratti di erbe selezionati sui livelli di glucosio nel sangue:
Con un recente costituzione GLUT4-traslocazione quantificazione schermo basato su primaria, siamo in grado di identificare le sostanze con un caratteristico insulino-mimetici10. Lo screening di centinaia di estratti di erbe solubile in acqua ha portato alla identificazione di parecchi colpi. Questi estratti sono stati testati nel nostro modello di ovo in. Gli estratti preparati da Combretum indicum (creeper Rangoon) e un estratto non forniti (chiamato Estratto 0845) sono stati utilizzati per questi esperimenti. Abbiamo sciolto gli estratti nel buffer di HBSS a 300 mg/L, una concentrazione che si è rivelato per essere appropriato in precedenti studi12,13. Le sostanze sono state applicate agli embrioni incubati per 11 giorni. Come indicato nella Figura 3, l'estratto dalla pianta rampicante Rangoon non ha provocato un significativo sangue glucosio riduzione in ovo. Tuttavia, la concentrazione di glucosio nel sangue è stato ridotto con successo con Estratto 0845, con una diminuzione secondaria dopo 60 min, che è paragonabile all'effetto osservato usando un'analogico di insulina disponibile in commercio. Un effetto significativo è stato osservato quando il tempo di incubazione delle uova è stato prolungato.
Figura 1: influenza di composti tossici sulla vitalità dell'embrione. Uova sono state incubate per 11 giorni (A e C) o trattate con un Estratto di erbe tossico il giorno 10 per altre 24 ore (B e D). Applicazione dell'estratto hanno portato a gravi lesioni dei vasi sanguigni della membrana corio-allantoidea (D) e l'embrione (B).
Figura 2: Descrizione del modello in-ovo . Da sinistra a destra: apertura e la rimozione del guscio d'uovo (1 - 2); equilibratura e la rimozione della membrana guscio d'uovo con membrana chorioallantoic esposti (3); recipiente di preparato su un nastro di pH (4); la raccolta di sangue e misurazione della concentrazione di glucosio utilizzando un misuratore di glucosio (5). Adattato da Haselgruebler et al., 201712. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: effetto di estratti di erbe sui livelli di glucosio nel sangue rispetto alle uova non trattate o trattati con insulina. Le uova sono state incubate per 11 giorni e trattate con le sostanze indicate (commercialmente disponibile insulina analogico: 3.3 U/mL; estratti: 300 mg/L) dissolto nel buffer di HBSS (300 µ l di volume) per fino a 3 h. sangue i livelli del glucosio sono stati determinati utilizzando un misuratore di glucosio del sangue. Risultati sono mostrati senza l'effetto del buffer. Barre di errore sono basati sull'errore standard della media. * P < 0.05 e * * * P < 0,0001, significativa diminuzione rispetto alle uova HBSS-trattati dello stesso tempo di incubazione. Adattato da Haselgruebler et al., 201712. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il dosaggio di HET-CAM è un sistema ampiamente utilizzato test alternativi alla sperimentazione animale nel settore12. Il sistema di in-ovo descritto qui rappresenta una versione modificata del test HET-CAM. Mentre nella sua forma originale, HET-CAM sono esperimenti per studiare le proprietà irritanti di composti e formulazione o l'analisi di angiogenesi14,15,16, abbiamo adattato l'approccio alla prova composti con caratteristiche insulino-mimetici putativo12. Secondo la direttiva 2010/63/UE, esperimenti con embrioni aviari non-covato durante i primi due terzi dello sviluppo embrionale non bisogno del permesso da un comitato etico poiché questi esperimenti non sono considerati gli esperimenti sugli animali. Recenti studi hanno dimostrato l'idoneità del sistema in-ovo per caratterizzare l'efficacia di estratti di erbe selezionati, che sono state identificate in un schermo primario basate su GLUT4-traslocazione10, per ridurre i livelli della glicemia nella assenza di insulina12,13. Punti critici per una buona prestazione del sistema in-ovo comprendono: primo, un allevatore affidabile consegnare le uova fecondate. Il pollo marrone classico Lohmann è una buona scelta di razza. In secondo luogo, l'attuazione di tossicità test per escludere effetti tossici delle esigenze composti studiati per essere fatto. Inoltre, la preparazione di un vaso sanguigno adatto per la raccolta del sangue è importante. È importante evitare il taglio di grandi vasi nella membrana corio-allantoidea stesso, come questo può portare a una perdita non-preferibile di sangue. Inoltre, prima che la nave è tagliata sulla striscia di pH, deve essere picchiettata asciutto utilizzando carta da filtro per evitare la diluizione del sangue raccolto. Infine, un numero sufficiente di esperimenti sembra essere importante. Si consiglia di utilizzare almeno 10 uova per ciascun punto di tempo e una triplice ripetizione dell'esperimento rispettivo.
Naturalmente, ci sono alcune limitazioni di questo approccio in ovo . Dato che ci vogliono fino a 30 minuti fino a quando le sostanze sono assorbite attraverso la membrana del guscio d'uovo ed entrano in stretto contatto con la membrana corio-allantoidea, non è possibile quantificare una risposta rapida dell'embrione al composto applicata. Inoltre, alcuni composti possono essere tossiche in concentrazione applicata, che spesso si traduce in lesioni dei vasi sanguigni della membrana corio-allantoidea. Così, la citotossicità test basati su incubazione a lungo termine dei composti per circa 24 ore appare ragionevole. Infine, abbiamo trovato che il sistema di buffer utilizzato per l'applicazione dei composti ha un effetto significativo sulle prestazioni del dosaggio. 12 attualmente, HBSS buffer viene utilizzato perché si traduce in più leggero effetto sui livelli di glucosio nel sangue dell'embrione.
Per le applicazioni future, possono essere testati sistemi buffer aggiuntivo come alternativa a HBSS. Inoltre, l'influenza di estratti di erbe su sangue ulteriori parametri come colesterolo, trigliceridi o lipoproteine potrebbe essere una domanda interessante.
Il nostro nuovo sistema di in-ovo è un importante e promettente strumento per testare le sostanze con caratteristiche insulino-mimetici in un organismo vivente senza la necessità di un esperimento sugli animali. Pertanto, colma il divario tra gli approcci in vitro e in vivo . Rispetto alle esistenti in ovo modello sistemi17 non c'è nessun bisogno di indurre il diabete dal trattamento di streptozotocin (STZ), come usiamo gli embrioni al giorno 10 o 11 di incubazione. In questa fase, non ha iniziato la produzione di insulina, ma gli embrioni sono già insulina sensibile. Inoltre, l'autorizzazione da un comitato etico potrebbe essere richiesto se usate17embrioni all'età di 14-17 giorni. Inoltre, rispetto a strategie alternative18, l'applicazione di composto come descritto qui è meno nocivo e laborioso, aumentando i tassi di attraverso-metta sperimentali.
Presi insieme, questo in-ovo approccio è un sistema interessante se un effetto sangue-diminuzione della sostanza insulino-mimetici deve essere testato in un organismo vivente.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dall'agenzia di promozione di ricerca austriaco (FFG; numero di progetto 850681), la University of Applied Sciences superiore Austria base Funding initiative (progetto GlucoSTAR) e il centro per l'innovazione tecnologica in medicina (TIMed Center) che riceve il finanziamento base di provincia dell'Alta Austria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
| Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
| Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
| Extracts | PEKISH extract library | ||
| Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |
References
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