Summary
В этом исследовании мы назвали систему - ovo перспективным инструментом для тестирования инсулин подражательный соединений в живом организме. Основные преимущества включают в себя адекватной скорости и по приемлемым ценам, позволяющие идентификацию фитохимические с инсулин подражательный свойствами.
Abstract
Уровень глюкозы в крови повышенный в сахарный диабет типа 2 (T2DM), сложных и многофакторных метаболических заболеваний, вызваны недостаточность инсулина сопротивления и β-клеток. Различные стратегии, включая инъекции инсулина или использование инсулина ознакомление наркотиков, были продолжены для лечения T2DM или по крайней мере уменьшить симптомы. Кроме того применение травяные соединений привлекает все большее внимание. Таким образом необходимо найти эффективный тест-системы для выявления и описания инсулин подражательный соединений. Здесь мы разработали модифицированных куриных эмбрионов модель, которая позволяет тестирование синтетических соединений и растительные экстракты с инсулин подражательный свойствами. С помощью флуоресценции микроскопии основанные начального экрана, который количественно транслокации транспортера глюкозы 4 (Glut4) к плазматической мембране, мы смогли определить соединений, преимущественно растительных экстрактов, которые ведут к увеличению внутриклеточных глюкозы концентрации в адипоцитов. Однако эффективность этих веществ требует дальнейшего контроля в живом организме. Таким образом мы использовали подход - ovo для определения их свойств снижение глюкозы в крови. Одобрения Комитета по этике не требуется, поскольку использование куриных эмбрионах в течение первых двух третей эмбрионального развития не считается эксперимент животных. Здесь подробно описывается применение этой модели.
Introduction
Сахарный диабет является метаболически заболевание, характеризующееся гипергликемией и вызванные дефектами секреции инсулина или инсулин действий1. Девяносто процентов всех случаев диабета являются сахарный диабет типа 2 категории (T2DM), где люди демонстрируют сопротивление инсулина и основном инсулин дефицит2. Известно, что несколько факторов увеличения глобальных масштабов T2DM, включая изменения в образе жизни, особенно в связи с чрезмерным питанием, старения и отсутствие физической активности. Около 400 миллионов человек имеют сахарным диабетом во всем мире согласно Международной Федерации диабета (МФД). Это число, как ожидается, достигнет 600 млн в течение следующих 20 лет3.
Диабетических осложнений, вызванных гипергликемии и сопротивление инсулина, таких, как гипертония, дислипидемия, нетерпимость глюкозы, ишемической болезни сердца и церебрального сосудистого заболевания, приведет к значительному сокращению продолжительности жизни и качества4. Затронутые лица требуют сахаропонижающую фармакотерапии; Однако использование наркотиков, таких как метформин5 зачастую ассоциируется с драматическим побочные эффекты6,,78. Таким образом антидиабетические подходы, которые являются безопасными, широко доступен и недорогую необходимы дальнейшие.
Различные травяные соединений, экстракты, растения и нутрицевтики были приписывают инсулин подражательный свойства компонента, модулируя различных клеточных функций. Важной особенностью является стимулирование транслокации транспортера глюкозы 4 (GLUT4) к плазматической мембране от внутриклеточного отсеков, что приводит к увеличению поглощения глюкозы в мышцах и жировой ткани в отсутствие инсулина, известный как Инсулин подражательный свойства9. Ранее мы реализовали подход, основанный на микроскопии флуоресцирования, количественно оценить процесс транслокации GLUT410. Анализ многочисленных растительных экстрактов из экстракта библиотека11 используя этот assay привел к выявлению перспективных кандидатов. Однако необходимы дальнейшие испытания в живых организмах. Подход, подробно описываются в настоящем документе, изменение куриных эмбрионов модель, оказалась перспективной моделью для идентификации веществ с инсулин подражательный свойствами. Он представляет собой привлекательный инструмент заполнение широкий разрыв между в vivo и in vitro исследования и предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими системами по приемлемым ценам, простой обработки процедур и адекватной скорости. Кроме того не требуется разрешение Комитета по этике.
Protocol
Согласно директиве 2010/63/ЕС эксперименты с не вылупились птичьего эмбрионы в течение первых двух третей эмбрионального развития не нужно разрешение Комитета по этике.
1. Хранение и разведение яйца
- Получите яйца оплодотворенные куриные (Таблица материалов) от местного заводчика.
Примечание: Яйца могут храниться на 14 ° C в атмосфере увлажненный до 10 дней после укладки перед использованием для экспериментов. - Инкубировать яйца в 38 ° C с средней влажностью 40-60% для 10 или 11 дней в инкубаторе, постоянно поворачивает яйца.
2. выбор яиц
- Проверьте яйца для оплодотворения после инкубации до 11 дней. Используйте просвечивании света для этого шага. Окунуть fringe просвечивании лампы в inkpad и свечи с заостренными стороны яйцо.
- Для определения воздушного пузыря, проверьте различия в яркости на вершине яйцо.
Примечание: Воздушного пузыря появляется как круглые, более прозрачной региона, в то время как белок темнее, когда яйцо candled. - После обнаружения воздушного пузыря отметьте место, нажав лампа слегка против яйцо с ранее применявшейся чернил.
- Исключите не оплодотворенные яйца на данном этапе, которые не показывают, разница в яркости между белком и воздушного пузыря.
3. инъекция вещества
- Подготовьте содержание интерес (например, растительный экстракт или инсулин), разбавление вещества в нужной концентрации в Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS) буфера. Например 3,3 ед/мл коммерчески доступных инсулина аналог в HBSS.
- Для применения выбранного соединения тщательно склевывают яичной скорлупы с парой отметил пинцет в помеченные области воздушного пузыря. Не образуют отверстие больше, чем диаметр иглу шприца. Придать буферного раствора (300 мкл), содержащие вещество интерес в области pecked через шприц.
Примечание: Используйте шприцы одноразовые стерильные, 1 мл, наконечники и судов. Надевайте перчатки и пальто лаборатории для экспериментов. - Чтобы определить эффект снижение глюкозы крови вещества, Положите яйца обратно в инкубатор для 60, 120 и 180 мин, соответственно. Для определения базальной глюкозы в крови, включают по крайней мере 10-15 не лечить контроля яйца.
4. токсичность тесты
- После применения выбранного соединения за 24 ч, сбалансировать яичной мембраны с буфером буферизации физраствора (PBS) фосфат (достаточно, чтобы покрыть весь яичной мембраны) для по крайней мере 30 s.
- Удалите избыток PBS буфера, поливая его прочь.
- Стащить мембраны яичной скорлупы тщательно с заостренными парой пинцетов.
- Проверьте кровеносных сосудов для поражения и подтвердить жизнеспособность (например, движение) куриных эмбрионов.
Примечание: Смотрите Рисунок 1 для сравнения жизненно важное значение по сравнению с не жизненно эмбрионов после применения токсичных растительный экстракт.
5. Измерение значения глюкозы крови
- В момент соответствующих времени тщательно удалить яичной скорлупы выше воздушного пузыря и сбалансировать яичной мембраны с буфером PBS (достаточно, чтобы покрыть весь яичной мембраны).
- Удалите избыток PBS буфера, поливая его прочь.
- Осторожно снять мембраны яичной скорлупы с заостренными парой пинцетов.
- Вырезать и удалить chorioallantoic мембраны с микро ножницы, чтобы хороший доступ к подходящим кровеносных сосудов. Вырезать мембраны по крайней мере 2-3 см. Не режьте любых крупных судов в мембране себя, чтобы избежать нежелательных кровопотери эмбриона.
- Найти большой сосуд, возникая от живота эмбриона. Поднимите этот сосуд из белка с закрытой микро ножницы и поместите его на пластиковые рН газа. Переместить в рН газа под судна, которое проводится с микро ножницы, и потяните микро ножничный прочь тщательно.
- Удаление 1-2 мл жидкости под chorioallantoic мембраны с пипетку, чтобы избежать разбавления крови на следующем шаге. Сухие судна и рН планка с фильтровальной бумаги, прежде чем вырезать судна.
- Вырежьте кровеносный сосуд тщательно с микро ножниц на одной стороне. Не прорезать судно полностью.
Примечание: Судно находится примерно 1 мм толщиной. Не режьте больше чем половина корабля чтобы избежать резки через судно полностью, как он может соскользнуть с полосы и без забора крови возможно. - Сбор крови течь на рН газа с помощью пипетки. Для определения уровня глюкозы в крови глюкозы метр с помощью требуются 10 микролитров крови.
6. Статистическая оценка
- Вычислите среднее значение по крайней мере 10 индивидуальных яиц на момент времени и нормализовать эти значения одного из управления яйца (не - или буфер лечение яйца).
- Впоследствии определите процент снижения. Кроме того использование инсулина как позитивный элемент управления.
Примечание: Повторите каждый эксперимент по крайней мере три раза.
Representative Results
Описание Gluc-HET подхода:
После инкубации с веществами, интерес оплодотворенные яйца открыты и подготовлен для сбора крови путем удаления яичной скорлупы (рис. 2). Дальнейшей подготовки включает в себя уравновешивания и удаления мембраны яичной скорлупы для получения доступа к chorioallantoic мембраны. Эта мембрана затем вырежьте внимательно предоставлять доступ к подходящим кровеносный сосуд для сбора крови. Предпочтительно большой сосуд, возникая от живота эмбрион помещается на пластиковые рН газа. Чтобы избежать разбавления крови во время сбора, судна и рН газа расположен похлопал сухой с фильтровальной бумаги. Затем вырежьте кровеносный сосуд и утечка на полосе рН крови собирается для анализа с помощью пипетки.
Воздействие отдельных растительных экстрактов на уровень глюкозы в крови:
С недавно созданной GLUT4-транслокации на основе количественный начального экрана мы способны идентифицировать вещества с инсулин подражательный характерные10. Скрининг сотен водорастворимые растительные экстракты привело к идентификации несколько хитов. Эти экстракты были проверены в нашей модели в -ovo. Экстракт, приготовленный из Комбретум indicum (Рангуне лианы) и не раскрыта экстракт (экстракт 0845 называют) были использованы для этих экспериментов. Мы распустил экстрактов в HBSS буфера на 300 мг/Л, концентрацию, которая оказалась в предыдущих исследованиях12,13. Вещества были применены к эмбрионов, инкубировали в течение 11 дней. Как указано на рисунке 3, выписку из Рангуна рептилия не завершились значительным крови глюкозы сокращения в ovo. Однако концентрация глюкозы крови успешно был сокращен с экстрактом 0845, с незначительными снижение после 60 мин, что сопоставимо эффект наблюдается использование коммерчески доступных аналог инсулина. Значительный эффект наблюдалось, когда длительное время инкубации яиц.
Рисунок 1: влияние токсичных соединений на жизнеспособность эмбриона. Яйца были инкубировали в течение 11 дней (A и C) или обращение с токсичными растительного экстракта на 10 день еще 24 часа (B и D). Применение экстракта привело к тяжелых поражениях кровеносных сосудов в chorioallantoic мембрана (D) и (B)эмбриона.
Рисунок 2: Описание модели в ovo . Слева направо: открытие и удаление яичной скорлупе (1 - 2); уравновешивания и удаления мембраны яичной скорлупы с chorioallantoic мембрана подвергается (3); подготовленный сосуд на рН газа (4); Сбор крови и измерение концентрации глюкозы, используя метр глюкозы (5). Адаптировано из Haselgruebler и др., 201712. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: эффект травяных экстрактов на уровень глюкозы в крови по сравнению с необработанной или инсулин лечение яйца. Яйца были инкубировали в течение 11 дней и относились с указанных веществ (коммерчески доступных аналог инсулина: 3,3 ед/мл; экстракты: 300 мг/Л) растворяют в HBSS буфера (объем 300 мкл) для до 3 ч. крови, уровня глюкозы были определены с помощью измерителя глюкозы крови. Результаты отображаются без эффекта буфера. Планки погрешностей основаны на Среднеквадратичная ошибка среднего значения. * P < 0,05 и *** P < 0,0001, значительное сокращение в отношении обработанных HBSS яйца в то же время инкубации. Адаптировано из Haselgruebler и др., 201712. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Assay HET-CAM является широко используются альтернативные испытания системы животных испытаний в промышленности12. Системы - ovo , описанные здесь представляет собой модифицированную версию HET-камеры assay. В его первоначальном виде, HET-CAM эксперименты по изучению раздражающих свойств соединений и разработки или анализа по ангиогенез14,,1516, мы адаптировали подход для тестирования соединения с предполагаемым инсулин подражательный характеристики12. Согласно директиве 2010/63/ЕС эксперименты с не вылупились птичьего эмбрионы в течение первых двух третей эмбрионального развития не нужно разрешение Комитета по этике, поскольку эти эксперименты не считаются экспериментов на животных. Недавние исследования доказали пригодность характеризуют эффективность отдельных растительных экстрактов, которые были определены на основе GLUT4-транслокации начального экрана10, чтобы снизить уровень глюкозы в крови в системе - ovo отсутствие инсулина12,13. Критические точки для хорошей производительности системы в ovo включают в себя: во-первых, надежного заводчика доставки оплодотворенные яйца. Lohmann классический коричневый курица это хороший выбор породы. Во-вторых осуществление токсичности тесты исключить токсические эффекты исследуемых соединений необходимо сделать. Кроме того подготовка подходящих кровеносный сосуд для сбора крови имеет важное значение. Важно избежать резки крупных судов в chorioallantoic мембраны, сам, как это может привести к не предпочтительнее потери крови. Кроме того, прежде чем судно разрезается на полосы рН, он должен быть похлопал сухой с помощью фильтровальной бумаги для предотвращения разбавления собранной крови. Наконец достаточное количество экспериментов, как представляется, важное значение. Мы рекомендуем использовать по крайней мере 10 яиц для каждой точке времени и трехкратное повторение соответствующих эксперимента.
Естественно существуют некоторые ограничения этого подхода в шоу ovo . Поскольку он занимает до 30 минут, пока вещества поглощаются через мембраны яичной скорлупы и вступить в тесный контакт с chorioallantoic мембраной, невозможно количественно быстрого реагирования эмбриона прикладной соединения. Кроме того некоторые соединения могут быть токсичными в прикладной концентрации, которая часто приводит к поражения кровеносных сосудов в chorioallantoic мембраны. Таким образом цитотоксичность тестирования на основе долгосрочных инкубации соединений для около 24 часов представляется разумной. Наконец мы нашли, что буферная система используется для применения соединений имеет значительное влияние на производительность assay. 12 в настоящее время HBSS буфер используется потому, что оно приводит к в наименьший эффект на уровень глюкозы в крови эмбриона.
Для будущих применений может испытываться дополнительные буферные системы в качестве альтернативы HBSS. Кроме того влияние экстрактов трав на крови дополнительных параметров, таких как холестерина, триглицеридов и липопротеидов, может быть привлекательным вопрос.
Нашей новой системы в ovo является перспективным и важным инструментом для тестирования вещества с инсулин подражательный характеристиками в живом организме без необходимости животного эксперимента. Таким образом он заполняет разрыв между подходами в vivo и in vitro . По сравнению с существующей в ovo модель систем17 существует не нужно вызвать диабет, лечение Стрептозотоцин (СТЗ), как мы используем эмбрионов в день 10 или 11 инкубации. На данном этапе не было начато производство инсулина, но эмбрионы уже чувствительной инсулина. Кроме того разрешение Комитета по этике может потребоваться, если используется17эмбрионов, в возрасте 14-17 дней. Кроме того по сравнению с альтернативным стратегиям18, составные приложения как описано здесь менее вредных и трудоемкий, увеличение экспериментальной через положило.
Вместе взятые, это -ovo подход является привлекательной системы, если кровь уменьшается эффект инсулина подражательный вещества должен испытываться в живом организме.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась австрийского Агентства по поощрению исследований (FFG; номер проекта 850681), Университет прикладных наук Верхняя Австрия Основные финансирование инициативы (проект GlucoSTAR) и центр для технологических инноваций в области медицины (временный центр) что получает базовое финансирование провинции Верхняя Австрия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
| Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
| Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
| Extracts | PEKISH extract library | ||
| Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |
References
- Defronzo, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).
- American_Diabetes_Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).
- Han Cho, N., et al. IDF Diabetes Atlas. Cavan, D. 7, International Diabetes Federation. (2015).
- Bailey, C. J., et al. Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes. Diabetes & vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).
- Maruthur, N. M., et al. Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).
- Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. E. Current Advances in the Biochemical and Physiological Aspects of the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus with Thiazolidinediones. PPAR research. , 7614270 (2016).
- Cohen, F. J., Neslusan, C. A., Conklin, J. E., Song, X. Recent antihyperglycemic prescribing trends for US privately insured patients with type 2 diabetes. Diabetes care. 26 (6), 1847-1851 (2003).
- Desai, N. R., et al. Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications. The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).
- Martel, J., et al. Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms. Nature reviews. Endocrinology. , (2016).
- Lanzerstorfer, P., et al. Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).
- Onur, S., Stöckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., Döring, F. The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library. Journal of Food Research. 2 (4), (2013).
- Haselgrubler, R., et al. Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds. PloS one. 12 (8), e0182788 (2017).
- Stadlbauer, V., et al. Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts. PloS one. 11 (1), e0148109 (2016).
- Greywe, D., et al. Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial. Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).
- Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test. Neuro endocrinology letters. 31, Suppl 2. 8-10 (2010).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
- Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin. Biological & pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).
- Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN). Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).
