Summary
本研究では生きている有機体でインスリン模倣化合物をテストする有望なツールとしてovo でシステムについて説明します。主な利点は、十分なスループット率とインスリン模倣性の植物化学物質の同定を可能にする受諾可能な費用に含まれます。
Abstract
2 型糖尿病 (2 型糖尿病)、複雑で多因子代謝病の高血糖値は、インスリン抵抗性と β 細胞の障害によって引き起こされます。2 型糖尿病を治療したり、少なくとも症状を減らすインスリンの注射またはインスリン増感薬の使用を含む様々 な戦略を追求しました。さらに、ハーブの化合物のアプリケーションはますます注目を集めています。したがって、効率的なテスト システムを識別し、特徴付けるインスリン模倣化合物を見つけることが必要です。ここでは、合成化合物やハーブエキス インスリン模倣性のテストを可能にする変更されたニワトリ胚モデルを開発しました。我々 は、細胞内のグルコースの増加につながる主にハーブ抽出物、化合物を識別するためができた画面を使用して蛍光顕微鏡によるプライマリ、グルコーストランスポーター 4 (Glut4) プラズマ膜への転流を定量化します。脂肪細胞中の濃度。ただし、生きている有機体で検証と、これらの物質の効果がさらに必要です。したがって、彼らの血ブドウ糖を減らすプロパティを識別するのにovo でアプローチを使用しました。萌芽期の開発の最初 3 分の 2 の中に鶏の胚の使用は動物実験とは見なされませんので、倫理委員会の承認は必要ありません。ここでは、このモデルのアプリケーションは、詳細で説明されます。
Introduction
糖尿病は、高血糖によって特徴付けられる代謝性疾患、インスリン分泌やインスリン アクション1の欠陥によって引き起こされます。すべての糖尿病の症例の 90% がカテゴリー 2 型糖尿病 (2 型糖尿病)、個人がほとんどインスリン欠乏2およびインスリン抵抗性を示します。いくつかの要因は、大麻の過剰摂取、加齢と運動不足に関連する特にそれらのライフ スタイルの変化など、2 型糖尿病の世界的な発生率を高めるために知られています。約 4 億人は、国際糖尿病連合 (IDF) によると世界的な糖尿病があります。この番号は、6 億3の 20 年以内に到達する予定です。
高血糖やインスリン抵抗性、高血圧、高脂血症、耐糖能異常、冠状心臓病、脳血管障害などによる糖尿病合併症は大幅に減少平均余命および品質4に します。影響を受けた個人が必要な血糖値を下げる薬物療法;しかし、メトホルミン5などの薬の使用は、しばしば劇的な副作用6,7,8関連付け。そのため、さらに安全な広く利用可能な安価な糖尿病治療のアプローチが必要です。
さまざまなハーブ化合物、エキス、植物および栄養補助食品は、様々 な細胞機能を調節することによって機能のインシュリン擬態プロパティに帰されています。重要な機能は、ブドウ糖の運送者 (GLUT4) 4 の転流の刺激細胞膜細胞内貯蔵コンパートメント、筋肉でのグルコースととして知られているインスリンのない状態で脂肪組織の増加取り込み結果からインスリン模倣プロパティ9。以前は、GLUT410の移行プロセスを定量化する蛍光顕微鏡ベースのアプローチを実施します。このアッセイを用いた抽出ライブラリ11からの多くの植物エキスの分析は、有望な候補者の特定につながった。しかし、生きている有機体にさらにテストが必要です。本稿では、変更されたニワトリ胚モデルで詳細に記載されているアプローチは、インスリン模倣性物質を識別するための有望なモデルであること証明しています。体外と体内の研究の広いギャップをうめる魅力的なツールを表し、受諾可能な費用、単純な処理の手順、および十分なスループット レートなど既存システムに比べていくつかの利点を提供しています。さらに、倫理委員会の許可は必要ありません。
Protocol
EU によると、ディレクティブ 2010/63/、胚の最初 3 分の 2 の中に孵化した非鳥類胚の実験は倫理委員会の許可を必要はありません。
1. ストレージと卵の繁殖
- 地元のブリーダーから受精鶏卵 (資材表) を取得します。
注: 卵は、実験のため使用前に敷設した後は、10 日間、加湿雰囲気の 14 ° C で保存されるかもしれない。 - 10 の 40-60% の平均湿気の 38 ° C で卵を孵化させなさいまたは 11 日インキュベーター、常に卵になります。
2. 卵の選択
- 11 日間の培養後の受精卵を確認します。このステップでは、candling ライトを使用します。Candling ランプのフリンジを浸し、印肉と卵のとがった側をキャンドルします。
- 空気の膀胱を識別するために卵の上に明るさの違いを確認します。
注: とき卵がー、卵白に暗いですが、空気の膀胱が円形より透明性の領域として表示されます。 - 空気の膀胱の検出後に場所をマークするために、以前に適用したインクで卵に対して若干ランプを押すと。
- 卵白と空気の膀胱の明るさの違いが表示されないこの段階で非受精の卵を除外します。
3. 物質の注入
- ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) バッファーに必要な濃度の物質を希釈することによって (例えばハーブエキスやインスリン) 関心のある物質を準備します。たとえば、3.3 U/mL の市販インスリン アナログ HBSS の。
- 選択した化合物のアプリケーションは、慎重に空気の膀胱のマークされた領域にピンセットの先の尖ったペアで卵殻をつつきます。注射器の針の直径より大きい穴を形成しません。注射器を介してついばんだの領域に関心のある物質を含む緩衝液 (300 μ L) を挿入します。
注: は、生殖不能、1 ml の使い捨て注射器、ピペット チップおよび容器を使用します。実験のための実験用の上着を着用します。 - 物質の血ブドウ糖を減らす効果を判断するには、それぞれ 60、120、180 分の定温器に戻って卵を置きます。基底の血ブドウ糖のレベルを決定するため、少なくとも 10-15 非治療卵が含まれます。
4. 毒性試験
- 24 時間選択した化合物のアプリケーション後、少なくとも 30 のリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) バッファー (全体卵殻膜をカバーするために十分な) と卵殻膜を平衡 s。
- 離れてそれを注ぐことによって余分な PBS バッファーを削除します。
- 先の尖ったピンセットのペアで慎重に卵殻膜をやってのけます。
- 病変の血管を確認し、ニワトリ胚の活力 (例えば運動) を確認します。
注: は、有毒なハーブ抽出の適用後重要な非重要な胚との比較のため図 1を参照してください。
5、血糖値の測定
- それぞれの時点で慎重に空気膀胱上卵殻を削除し、(全体卵殻膜をカバーするために十分な) PBS バッファーと卵殻膜を平衡します。
- 離れてそれを注ぐことによって余分な PBS バッファーを削除します。
- 慎重に先の尖ったピンセットのペアで卵殻膜をやってのけます。
- カットし、漿膜マイクロ シザー、適切な血管へのアクセスを有効にするを削除します。膜を切り取り、少なくとも 2 ~ 3 cm。膜胚の不要な血液損失を避けるために自分自身のすべての大型船をカットしないでください。
- 胚の腹部から大きな容器を探します。閉じたマイクロ ハサミで卵白からこの船を持ち上げ、プラスチック製の pH ストリップの上に置きます。マイクロはさみで開催されている容器の下で pH ストリップを移動し、引いてマイクロはさみ離れて慎重に。
- 次の手順で血液の希釈を避けるためにピペットで漿膜の下に液体の 1-2 の mL を削除します。容器をカットする前に、容器、フィルター紙の pH ストリップを乾燥します。
- 1 つの側面のマイクロはさみで慎重に血管をカットします。切らない血管を通じて完全に。
注: 船は約 1 mm 厚です。それはオフ ・ ストリップが空転し、採血が可能ではない、完全に船を通って切断を避けるために容器の半分以上をカットしないでください。 - ピペットを使用して pH ストリップに漏れの血を収集します。10 マイクロリットル血液の血糖測定器を使用してグルコース レベルを決定する必要があります。
6. 統計学的評価
- 時点あたり少なくとも 10 個々 の卵の平均値を計算し、コントロール卵 (非またはバッファー処理卵) のいずれかにこれらの値を正規化します。
- その後、減少の割合を決定します。さらに、肯定的な制御としてインスリンを使用します。
注: は、少なくとも 3 回各実験を繰り返します。
Representative Results
Gluc HET アプローチの説明:
興味の物質とインキュベーション後、受精卵が開かれ、卵殻 (図 2) の除去によって血のコレクションのために準備します。それ以上の準備には、平衡と漿膜へのアクセスを得るために卵殻膜の除去が含まれています。この膜は血のコレクションの適切な血管へのアクセスを提供するために慎重に切って。好ましくは、胚の腹部から大型の容器は、プラスチック製の pH ストリップに配置されます。コレクションの中に血液の希釈を避けるためには、容器と pH ストリップを乾燥ろ紙を撫でます。血管を切って、血の pH ストリップ上に漏れがピペットを使用して分析のため収集します。
選択したハーブ ・ エキスの血糖値に及ぼす影響:
最近設立された GLUT4 転流定量に基づいたプライマリ画面、インシュリン擬態特性10物質を識別することがおります。水溶性のハーブエキスの何百ものスクリーニングは、いくつかのヒットの特定につながった。これらの抽出物は、私たちの卵モデルでテストされました。Combretum 中(ラングーン クリーパー) から調製した抽出物と非開示の抽出 (抽出 0845 と呼ばれる) は、これらの実験に使用されました。HBSS バッファー 300 mg/L、判明する前の研究12,13で適切な濃度での抽出を解散しました。物質は、11 日間の培養胚に適用されました。図 3で示したように、ラングーンつるからの抽出物は重要な血ブドウ糖減少ovoでされませんでした。しかし、血中グルコース濃度は正常に低減抽出 0845、60 分後のマイナーな減少と市販インスリン アナログを使用して観測された効果に匹敵します。卵の孵化時間が延長された有意な効果が観察されました。
図 1: 有毒な化合物の胚の活力に及ぼす影響します。卵(A、C)の 11 日間の培養または別の 24 h の 10 日目に有毒なハーブエキスで治療(B、D).抽出のアプリケーションは漿尿膜(D)と(B)胚の血管の重篤な病変をもたらした。
図 2: ovo でモデルの説明です。左から右へ: 開口部と卵殻除去(1-2);平衡および漿膜と卵殻膜の除去公開(3)準備した容器 pH ストリップ(4);血とブドウ糖メーター (5)を用いたグルコース濃度計測のコレクションです。Haselgrueblerらから適応。 2017、12。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 未処理またはインスリン治療の卵と比較して血糖値に及ぼすハーブエキス。卵が 11 日間の培養し、示された物質と扱われる (市販インスリン アナログ: 3.3 U/mL; 抽出: 300 mg/L) 3 h まで血液の血糖値を血糖測定器を使用して求めた HBSS バッファー (300 μ L ボリューム) に解散。バッファーの効果がなければ結果が表示されます。誤差範囲は、平均値の標準誤差に基づいています。* P < 0.05 と * * * P < 同じインキュベーション時間 HBSS 処理卵に関して 0.0001、大幅な減少します。Haselgrueblerらから適応。 2017、12。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
ヘット カム アッセイは、業界12での動物実験に広く使用されている代替試験システムです。ここで説明したovo でシステムは、ヘット カム アッセイの変更されたバージョンを表しています。元の形式で、化合物と定式化の刺激特性や血管新生14,15,16の解析を研究するヘット カム実験を行い、テスト方法を適応しています。推定されるインシュリン擬態特性12化合物。これらの実験は、動物実験とは見なされませんので、萌芽期の開発の最初 3 分の 2 の中に孵化した非鳥類胚実験ディレクティブ 2010/63/EU によると倫理委員会の許可は必要ではありません。最近の研究は、GLUT4 ベース転座プライマリ画面10での血糖値を減らすために識別されている選択したハーブ抽出物の効果を特徴付けるovo でシステムの適合性を証明している、インスリン12,13の不在。Ovo でシステムの良好なパフォーマンスのための重要なポイントがあります: 最初に、受精卵を提供する信頼できるブリーダーです。ローマン クラシック ブラウン チキンは、品種の良い選択です。第二に、毒性の実装は除外されるべき調査の複合ニーズの毒性をテストします。さらに、適切な血管の血のコレクションのための準備は重要です。血液の非推奨の損失につながるよう自体、漿尿膜内大血管の切断を避けるために重要です。さらに、船は、pH のストリップにカットは、前にそれは、なでられる乾燥ろ紙を使用して収集した血液の希釈を防止します。最後に、実験のための十分な数が重要であると表示されます。各時点の 3 倍それぞれ実験繰り返しの少なくとも 10 の卵を使用してお勧めします。
当然のことながら、この卵のアプローチのいくつかの制限があります。物質卵殻膜から吸収され、漿膜と密接な接触に入って来るまでに最大 30 分かかる、応用化合物に胚の急速な応答を定量化することはないです。さらに、いくつかの化合物は頻繁に漿尿膜の血管の病変の結果適用濃度の有毒な可能性があります。したがって、細胞毒性テスト約 24 時間のための化合物の長期培養に基づく合理的なが表示されます。最後に、化合物の応用に使用されるバッファー システム アッセイのパフォーマンスに大きな影響があるとわかった。12現在、HBSS バッファーは使用胚の血糖値に最小の効果を得られるので。
将来のアプリケーション HBSS の代替として追加のバッファー システムをテストすることがあります。さらに、コレステロール、トリグリセリド、リポタンパク質など追加の血液パラメーターにハーブ抽出物の影響は、魅力的な質問かもしれません。
Ovoの新しい体制は、動物実験を必要とせず生きている有機体でインスリン模倣の特性を持つ物質をテストする有望かつ重要なツールです。したがって、体外と体内のアプローチの間のギャップを埋めます。既存の ovo モデル システム17と比較すると我々 は 10 または孵卵 11 日に胚を使用するよう、ストレプトゾトシン (STZ) 治療で糖尿病を誘発する必要はありません。この段階でインスリン産生が開始していないが、胚は、既にインシュリン敏感です。14-17 日齢の胚が使用される17場合また、倫理委員会の許可が必要になる可能性があります。さらに、代替戦略18と比較して、化合物の応用ここで説明がより少なく有害な骨の折れる、実験のスループット レートを増加します。
まとめると、この卵のアプローチは、インスリン模倣物質の血液減少効果は生きている有機体でテストする必要がある場合は魅力的なシステムです。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
医学 (定刻センター) の技術革新のオーストリア研究推進機構 (ミサイルフリ ゲート艦; プロジェクト番号 850681)、大学の応用科学上オーストリア基本資金調達イニシアチブ (プロジェクト GlucoSTAR)、センターによって資金が供給されたこの作品オーバーエスターライヒ州の基本的な資金を受け取る。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
| Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
| Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
| Extracts | PEKISH extract library | ||
| Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |
References
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