Summary
이 연구에서 우리는 살아있는 유기 체에서 인슐린 모방 화합물을 테스트 하는 유망한 도구로 -비켜 시스템을 설명 합니다. 주요 이점 적절 한 처리량 속도 허용 비용, phytochemicals 인슐린 모방 속성의 id를 포함 합니다.
Abstract
높은 혈액 포도 당 수치를 타입-2 당뇨병 mellitus (T2DM), 복잡 하 고 multifactorial 신진 대사 질환, 인슐린 저항 및 β-셀 오류로 인해 발생 합니다. 인슐린의 주입 또는 인슐린 sensitizing 약물의 사용을 포함 하 여 다양 한 전략을 T2DM 하거나 적어도 증상을 줄일 추구 했다. 또한, 초본 화합물의 응용 프로그램 증가 주목을 받고 있다. 따라서, 그것은 식별 하 고 인슐린 모방 화합물의 특성 효율적인 테스트 시스템을 찾을 필요가 있다. 여기 우리는 합성 화합물 및 초본 추출 물 인슐린 모방 속성의 테스트를 가능 하 게 수정 된 병아리 태아 모델 개발. 사용 하는 형광 현미경-기반 기본 스크린, 플라즈마 막에 포도 당 운송업 자 (Glut4) 4의 전 좌 단정, 우리 화합물, 주로 허브 추출 물, 세포내 포도 당의 증가 이어질를 식별할 수 있었다 adipocytes에 대 한 농도 그러나, 이러한 물질의 효능 더 살아있는 유기 체에서 확인을 해야합니다. 따라서, 우리는 그들의 혈액 포도 당을 감소 속성을 식별 하는 -비켜 방식을 사용. 배아 발달의 첫번째 2/3 동안 닭 배아를 사용 하 여 동물 실험으로 간주 되지 않습니다 이후는 윤리 위원회의 승인이 필요 하지 않습니다. 여기,이 모델의 응용 프로그램 세부 사항에 설명 되어 있습니다.
Introduction
당뇨병 혈당이 특징인 대사 질환 이며 인슐린 분 비 또는 인슐린 작업1에서 결함에 의해 발생 합니다. 모든 당뇨병 케이스의 90 %는 카테고리 타입-2 당뇨병 mellitus (T2DM), 인슐린 저항 및 주로 인슐린 결핍2개인 설명 하는 곳. 여러 가지 요인, overnutrition, 노화, 및 육체적 인 비활동에 관련 된 특히 그들의 라이프 스타일에 변화를 포함 하 여, T2DM의 글로벌 발생률을 증가 알려져 있습니다. 약 400 백만 명이 당뇨병 mellitus 국제 당뇨병 연맹 (IDF)에 따르면 전세계 있다. 이 번호는 다음 20 년3내에서 600 백만 도달 예정입니다.
혈당 및 인슐린 저항, 고혈압, dyslipidemia, 포도 당 옹 졸, 관상 동맥 심장 질환, 뇌 혈관 질환 등으로 인 한 당뇨 합병증은 현저 하 게 감소 된 수명 및 품질4이어질. 영향을 받는 개인 필요한 포도 당을 낮추는 pharmacotherapy; 그러나, metformin5 같은 약물의 사용은 종종 극적인 부작용6,,78연관 된다. 따라서, 더 안전한, 널리 사용할 수 있으며 저렴 한 antidiabetic 접근 필요 하다.
다른 초본 화합물, 추출 물, 식물, 그리고 영양 보충 식품 기능 인슐린 모방 속성에 다양 한 세포 기능을 조절 하 여 관찰 되었습니다. 중요 한 기능은 근육에서 포도 당 및 지방 조직으로 알려진 인슐린의 부재에서의 증가 된 통풍 관의 결과로 세포내 저장 격실에서 원형질 막에 포도 당 운송업 자 (GLUT4) 4의 전 좌의 자극은 인슐린 모방 속성9. 이전에, 우리는 계량 GLUT410의 전 과정을 형광 현미경 검사 법 기반 접근 구현. 이 분석 결과 사용 하 여 추출 라이브러리11 에서 수많은 식물 추출 물의 분석 결과 유망한 후보자의 식별. 그러나, 살아있는 유기 체에서 더 테스트는 필수입니다. 이 종이, 수정된 병아리 태아 모델에서 자세히 설명 하는 접근은 인슐린 모방 특성을 가진 물질을 식별 하는 데 유망한 모델을 입증 했다. 그것은 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문 사이의 넓은 간격을 작성 하는 매력적인 도구를 나타내고 허용 비용, 간단한 처리 절차, 적절 한 처리 속도 등 기존 시스템에 비해 몇 가지 장점을 제공 합니다. 또한, 윤리 위원회에 의해 허가 필요 하지 않습니다.
Protocol
지시문 2010/63/유럽에 따르면 배아 발달의 첫번째 2/3 동안 부 화 되지 않은 조류 배아 실험 윤리 위원회에 의해 허가 필요 하지 않습니다.
1. 저장 및 계란의 번 식
- 로컬 개종에서 수정 된 암 탉 계란을 (테이블의 재료)를 가져옵니다.
참고: 계란 저장할 수 있습니다 14 ° c 습도 분위기에서 실험에 대 한 사용 하기 전에 누워 후 최대 10 일 동안. - 10에 대 한 40-60%의 평균 습도와 38 ° C에 계란을 품 어 또는 인큐베이터에서 11 일을 지속적으로 계란을 화나게.
2입니다. 계란의 선택
- 11 일의 부 화 후 수정에 대 한 계란을 확인 하십시오. Candling 라이트를 사용 하 여이 단계에 대 한. inkpad에 candling 램프의 프린지와 계란의 뾰족한 쪽을 촛불.
- 공기 방광을 식별 하려면 계란 정상 밝기에 차이를 확인 합니다.
참고: 때 계란 candled는 배 젖은 어두운 공기 방광 라운드, 더 투명 한 영역으로 나타납니다. - 공기 방광의 탐지, 후 이전에 적용 된 잉크와 계란에 대 한 약간 램프를 눌러 위치를 표시 합니다.
- 배 젖과 공기 방광 사이의 밝기에 차이가 표시 되지 않습니다이 단계에서 비 수정 된 계란을 제외 합니다.
3입니다. 물질의 주입
- 행 크의 균형된 소금물 (HBSS) 버퍼에 원하는 농도에서 물질을 희석 하 여 (예를 들어, 허브 추출 물 또는 인슐린)의 물질을 준비 합니다. 예를 들어 3.3 U/mL의 상용 인슐린 아날로그 HBSS에서.
- 선택 된 화합물의 응용 프로그램에 대 한 신중 하 게 공기 방광의 표시 영역에서 핀셋의 뾰족한 쌍으로 달걀 껍질 펙. 주사기의 바늘의 직경 보다 큰 구멍을 형성 하지 않는다. 주사는 주사기를 통해 pecked 영역으로 관심의 물질을 포함 하는 버퍼 솔루션 (300 µ L).
참고: 살 균, 1 ml 일회용 주사기, 피 펫 팁, 및 용기를 사용 합니다. 착용 장갑 및 실험에 대 한 실험실 외 투. - 물질의 혈액 포도 당 감소 효과 확인 하려면 장소 계란 60, 120, 180 분, 인큐베이터에 다시 각각. 기저 혈액 포도 당 수치를 확인 하려면 적어도 10-15 비 처리 제어 계란을 포함 합니다.
4. 독성 테스트
- 신청 후 24 시간에 대 한 선택 된 화합물의, 적어도 30에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 버퍼 (전체 껍질 막 커버 하기에 충분) 껍질 막 equilibrate s.
- 멀리 그것을 붓는 의해 초과 PBS 버퍼를 제거 합니다.
- 뾰족한 핀셋의 쌍을 신중 하 게 달걀 껍질 막 해 내.
- 혈관 병 변 확인 고 병아리 태아의 활력 (예를들면, 운동)를 확인 합니다.
참고: 독성 초본 추출의 신청 후 중요 한 비 배아 대 중요 한의 비교를 위해 그림 1 을 참조 하십시오.
5입니다. 혈액 포도 당 가치 측정
- 해당 시간 점에서 신중 하 게 공기 방광 위에 달걀 껍질을 제거 하 고 PBS 버퍼 (전체 껍질 막 커버 하기에 충분) 껍질 막 equilibrate.
- 멀리 그것을 붓는 의해 초과 PBS 버퍼를 제거 합니다.
- 조심 스럽게 핀셋의 뾰족한 쌍 껍질 막 해 내.
- 잘라 고 적합 한 혈관에 좋은 액세스할 수 있도록 하는 마이크로-시저와 chorioallantoic 멤브레인을 제거 합니다. 막 컷 2-3 cm 이상. 태아의 원치 않는 혈액 손실을 방지 하기 위해 자체 막에 있는 어떤 큰 배를 잘라 하지 마십시오.
- 태아의 복 부에서 발생 하는 대형 선박을 찾습니다. 닫힌된 마이크로 시저와 배 젖에서이 배를 들어올린 플라스틱 산도 스트립에 배치. 마이크로 시저와 함께 개최 되는 선박에서 산도 스트립을 이동 하 고 다시 당겨 마이크로 시저 멀리 신중 하 게.
- 다음 단계에서 혈액의 희석을 피하기 위해 피 펫과 chorioallantoic 막 아래 액체의 1-2 mL를 제거 합니다. 건조 선박 및 필터 종이로 산도 스트립 전에 그릇 잘라.
- 1 개의 측에 신중 하 게 마이크로 시저와 함께 혈관을 잘라. 자르지 않는다 선박을 통해 완전히.
참고: 선박 약 1 m m 두께입니다. 스트립에서 풀 수 있습니다 하 고 아무 혈액 컬렉션은 가능한 선박을 통해 완전히 절단 하지 않도록 그릇의 절반 이상을 잘라 하지 마십시오. - 피 펫을 사용 하 여 pH 지구에 새 피를 수집 합니다. 10 microliters 혈액의 포도 당 수준을 혈액 포도 당 미터를 사용 하 여 결정 해야 합니다.
6. 통계 평가
- 시간 포인트 당 10 개인 계란의 평균 값을 계산 하 고 컨트롤 계란 (계란 비 또는 버퍼-대우) 중 하나에 이러한 값을 정상화.
- 그 후, 감소의 백분율을 결정 합니다. 또한, 인슐린을 사용 하 여 긍정적인 통제로.
참고: 각 실험에 세 번 이상 반복 합니다.
Representative Results
Gluc HET 접근의 설명:
관심의 물질과 부 화 후 수정 된 알은 열리고 (그림 2) 달걀 껍질의 제거에 의해 혈액 컬렉션에 대 한 준비. 더 준비 평형 chorioallantoic 막에 대 한 액세스를 얻기 위해 달걀 껍질 막의 제거를 포함 됩니다. 이 막 다음 적합 한 혈관에 혈액 컬렉션에 대 한 액세스를 제공 하기 위해 신중 하 게 절단 됩니다. 선호, 태아의 복 부에서 발생 하는 큰 그릇은 플라스틱 산도 스트립에 배치 됩니다. 수집 하는 동안 혈액의 희석을 피하기 위해, 선박 및 산도 스트립 필터 종이 건조 했더니입니다. 혈관은 다음 잘라내어 혈액 산도 스트립에 새는 피 펫을 사용 하 여 분석을 위해 수집 됩니다.
혈액 포도 당 수준에 선택 된 초본 추출 물의 효과:
최근에 설립 된 GLUT4 전 정량 기반 기본 화면, 우리 인슐린 모방 특성10물질을 식별할 수 있습니다. 수용 성 허브 추출 물 수백의 심사 결과 여러 안타의 식별. 이러한 추출 물 -비켜 모델에서 테스트 되었습니다. Combretum indicum (랑 군 기)에서 준비 된 추출 물과 비 공개 추출 (추출 0845 불리)이이 실험을 위해 사용 되었다. 우리 녹 HBSS 버퍼 300 mg/l, 이전 연구12,13에 적합 한 것으로 밝혀졌다는 농도에서 추출 물. 물질은 11 일 동안 incubated 배아에 적용 했다. 그림 3에 표시 된 대로 중요 한 혈액 포도 당 감소 -비켜랑 군 기에서 추출 발생 하지 않았다. 그러나, 혈액 포도 당 농도 성공적으로는 상용 인슐린 아날로그를 사용 하 여 관찰 하는 효과에 비해 추출 0845, 60 분, 후 작은 감소와 함께 감소 되었다. 상당한 효과 계란의 부 화 시간이 연장 했다 때 관찰 되었다.
그림 1: 배아 활력에 유독한 화합물의 영향. 계란 알을 품을 11 일 (A와 C) 에 대 한 또는 다른 24 h에 대 한 10 일째에 독성 초본 추출 물으로 치료 (B와 D). 추출의 응용 프로그램 chorioallantoic 막 (D) 와 (B)태아에 혈관의 심한 병 변으로 이끌어 냈다.
그림 2: 설명에 비켜 모델의. 왼쪽에서 오른쪽: 달걀 껍질의 제거와 (1-2); 평형 및 제거 chorioallantoic 막으로 달걀 껍질 막의 노출 (3); 준비 된 배 산도 스트립 (4); 혈액 포도 당 미터 (5)를사용 하 여 포도 당 농도의 측정의 컬렉션입니다. Haselgruebler 외에서 적응. 2017,12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 치료 또는 인슐린 치료 계란에 비해 혈액 포도 당 수준에 초본 추출 물의 효과. 계란 11 일 동안 incubated 되었고 지정 된 물질과 치료 (상용 인슐린 아날로그: 3.3 U/mL; 추출 물: 300 mg/L) 3 h. 혈액 포도 당 수준을 혈액 포도 당 미터를 사용 하 여 결정 했다 HBSS 버퍼 (300 µ L 볼륨)에서 해산. 결과 버퍼의 효과 없이 표시 됩니다. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 기반으로 합니다. * P < 0.05와 * * * P < 인큐베이션 동시의 계란 HBSS 취급에 관하여 0.0001, 상당한 감소. Haselgruebler 외에서 적응. 2017,12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
HET-캠 분석 결과 업계12동물 테스트를 널리 대체 테스트 시스템입니다. 여기 설명 에 비켜 시스템 HET 캠 분석 결과의 수정된 된 버전을 나타냅니다. 그것의 원래의 형태에 (서) 동안 한 캠 실험 화합물과 배합의 자극적 속성 또는 신생14,,1516의 분석 연구를 수행, 우리가 테스트 접근 방식에 적응 해야 상 상속 인슐린 모방 특성12화합물. 지시문 2010/63/유럽에 따르면 배아 발달의 첫번째 2/3 동안 부 화 되지 않은 조류 배아 실험 필요 하지 않습니다 윤리 위원회에 의해 허가 이후 이러한 실험 동물 실험으로 간주 되지 않습니다. 최근 연구 특성화 GLUT4 전-기반 기본 화면10에서 혈액 포도 당 수준을 줄이기 위해 확인 되었습니다 선택 된 초본 추출 물의 효능을 비켜에서 시스템의 적합성을 입증 했다는 인슐린12,13의 부재. 비켜에 시스템의 좋은 성능에 대 한 중요 한 포인트는: 첫째, 수정 된 알을 제공 신뢰할 수 개종. Lohmann 고전적인 갈색 닭 품종의 좋은 선택입니다. 둘째, 독성의 구현 테스트 해야 할 조사 복합 요구의 독성 효과 제외 하. 또한, 혈액 컬렉션에 대 한 적합 한 혈관의 준비는 중요 하다. 그것은이 혈액의 비 바람직 손실로 이어질 수 자체, chorioallantoic 막에 큰 혈관의 절단을 피하기 위해 중요 하다. 또한, 전에 배 산도 스트립에 절단, 그것은 함께 수 수집 된 혈액의 희석을 방지 하기 위해 필터 종이 사용 하 여 건조. 마지막으로, 충분 한 수의 실험은 중요 한 것 처럼 보인다. 각 시간 점과 각 실험의 3 겹 반복에 대 한 최소 10 계란을 사용 하는 것이 좋습니다.
당연히,이 비켜에서 방법의 몇 가지 제한이 있습니다. 물질 달걀 껍질 막을 통해 흡수 하는 chorioallantoic 막과 긴밀 한 접촉에와 서 때까지 최대 30 분 소요, 이후 적용 된 화합물에는 태아의 급속 한 응답을 계량 수는. 또한, 일부 화합물 chorioallantoic 막에 있는 혈관의 병 변에서 자주 결과 적용된 농도에서 독성이 있을 수 있습니다. 따라서, 세포 독성 약 24 시간 동안 화합물의 장기 외피를 기반으로 테스트 합리적인 나타납니다. 마지막으로, 우리는 화합물의 응용 프로그램에 사용 되는 버퍼 시스템 분석 결과의 성능에 큰 영향을 발견. 12 현재, HBSS 버퍼 사용 됩니다 그것은 태아의 혈액 포도 당 수준에 작은 효과가 발생 하기 때문에.
미래 응용 프로그램, HBSS 대신 추가 버퍼 시스템 테스트 수 있습니다. 또한, 콜레스테롤, 중성 지방 이나 단백질 같은 추가 혈액 매개 변수에 초본 추출 물의 영향 매력적인 질문을 될 수 있습니다.
우리의 새로운 에 비켜 시스템 동물 실험의 필요성 없이 살아있는 유기 체에서 인슐린 모방 특성을 가진 물질을 테스트 하는 유망 하 고 중요 한 도구입니다. 따라서, 그것은 생체 외에서 그리고 vivo에서 접근 사이 간격을 채웁니다. 기존에 비켜 모델 시스템17 에 비해 하루에 10 또는 11 보육의 배아를 사용 하는 우리가 streptozotocin (STZ) 처리에 의해 당뇨병을 유도 하기 위해 필요가 없습니다입니다. 이 단계에서 인슐린 생산 시작 되지 않은, 하지만 배아는 이미 인슐린 과민 한. 또한, 윤리 위원회에 의해 수 있습니다 필요한 배아 14-17 일을 세는 사용된17입니다. 또한, 대체 전략18에 비해, 복합 응용 프로그램 여기에 설명 된 대로 덜 유해 하 고 힘 드는, 실험을 통해 넣어 속도 증가.
함께,이 비켜 찍은 접근 인슐린 모방 물질의 혈액 감소 효과 살아있는 유기 체에서 테스트 하는 경우 매력적인 시스템입니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 의학 (TIMed 센터)에서 기술 혁신에 대 한 오스트리아 연구 추진 기구 (FFG; 프로젝트 번호 850681), 대학교의 응용 과학 위 오스트리아 기본 기금 이니셔티브 (프로젝트 GlucoSTAR)와 센터에 의해 투자 되었다 그 기본 어퍼 오스트리아 지방에 의해 자금을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
| Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
| Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
| Extracts | PEKISH extract library | ||
| Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |
References
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