Summary
Bu çalışmada, insülin mimetic bileşikler yaşayan bir organizma test etmek için umut verici bir araç olarak bir ovo sistemi açıklanmaktadır. Ana avantajı yeterli üretilen iş hızları ve fitokimyasallar insülin mimetic özelliklere sahip kimliği etkinleştirme kabul edilebilir maliyeti içerir.
Abstract
Yüksek kan şekeri düzeyleri de tip 2 diyabet (T2DM), karmaşık ve multifaktöriyel bir metabolik hastalığı, insülin direnci ve β-hücre hatasından kaynaklanır. İnsülin enjeksiyon veya insülin duyarlılığı ilaçların kullanımı da dahil olmak üzere çeşitli stratejileri T2DM tedavi etmek ya da en azından semptomları azaltmak takip. Buna ek olarak, uygulama bitkisel bileşiklerin artan dikkat çekti. Böylece, tanımlamak ve insülin mimetic bileşikler karakterize için verimli test sistemleri bulmak gereklidir. Burada sentetik bileşikler ve insülin mimetic özellikleri ile bitkisel özler test sağlar değiştirilmiş civciv embriyo modeli geliştirdik. Plazma zarı için glikoz taşıyıcı 4 (Glut4) translocation quantifies, bir Floresans mikroskobu tabanlı birincil ekranı kullanarak bileşikler, hücre içi glikoz bir artış için kurşun çoğunlukla bitkisel özler tanımlamak başardık adiposit konsantrasyonlarda. Ancak, bu maddelerin etkinliği daha da canlı bir organizma doğrulama gerektirir. Böylece, bir ovo yaklaşım kan şekeri azaltarak özelliklerini tanımlamak için kullanılır. Tavuk bebekleri ilk üçte embriyonik gelişim sırasında kullanımı hayvan deney olarak kabul edilmez beri bir Etik Komitesi tarafından onay gerekli değildir. Burada, uygulamanın bu modelin ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Introduction
Diabetes mellitus hiperglisemi tarafından karakterize metabolik bir hastalık ve kusurları insülin salgılanması veya insülin eylem1neden olur. Tüm diyabet vakaların % 90'ı Kategori tip 2 diabetes mellitus (T2DM), insülin direnci ve insülin eksikliği2çoğunlukla nerede bireyler göstermek vardır. Çeşitli faktörler yaşam tarzı, özellikle de overnutrition, yaşlanma ve fiziksel hareketsizlik ile ilgili değişiklikler de dahil olmak üzere T2DM, küresel insidansı artırmak için bilinir. Yaklaşık 400 milyon kişinin diyabet uluslararası diyabet Federasyonu (IDF) göre dünya çapında var. Bu sayı 600 milyon gelecek 20 yıl3içinde ulaşması bekleniyor.
Diyabetik komplikasyonlar hiperglisemi ve insülin direnci, hipertansiyon, dislipidemi, glukoz intoleransı, koroner kalp hastalığı ve beyin damar hastalıkları gibi nedeniyle önemli ölçüde azaltılmış yaşam süresi ve kalitesi4kurşun. Etkilenen bireylerin glukoz düşürücü farmakoterapi gerektirir; Ancak, metformin5 gibi ilaçların kullanımı sık sık dramatik yan etkiler6,7,8ile ilişkilidir. Bu nedenle, daha güvenli, yaygın olarak kullanılabilir ve ucuz antidiyabetik yaklaşımlar gereklidir.
Farklı bitkisel bileşikleri, özleri, bitkiler ve nutraceuticals özellik insülin mimetic özellikler için çeşitli hücresel işlevlerini oransal tarafından atfedilen. Önemli bir özelliği hücre içi depolama bölmeleri, glikoz kas ve yağ dokusu olarak bilinen insülin yokluğunda artan bir alımını sonuçlanan plazma zarı uyarılması glikoz taşıyıcı 4 (GLUT4) translocation olduğunu insülin mimetic özellikleri9. Daha önce biz GLUT410translocation sürecinin ölçmek için Floresans mikroskobu dayalı yaklaşım hayata. Bu tahlil kullanarak bir özü Kütüphane11 çok sayıda bitki özleri analiz umut verici adaylar tanımlaması içinde sonuçlandı. Ancak, daha fazla canlı organizmalar testlerinde gereklidir. Ayrıntılı bu kağıt, değiştirilmiş civciv embriyo manken olarak açıklanan yaklaşım maddeler ile insülin mimetic özelliklerini tanımlamak için umut verici bir model olduğu ispatlanmıştır. In vitro ve ın-vivo çalışmalar arasında geniş boşluk doldurma bir çekici araç temsil eder ve kabul edilebilir maliyeti, basit işleme yordamlarını ve yeterli hızlarındaki gibi mevcut sistemleri ile karşılaştırıldığında birçok avantaj sunar. Buna ek olarak, izni bir Etik Komitesi tarafından gerekli değildir.
Protocol
Yönerge 2010/63/AB göre sigara yumurtadan kuş embriyo ilk üçte embriyonik gelişim sırasında ile deneyler izni bir Etik Komitesi tarafından gerek yoktur.
1. depolama ve damızlık yumurta
- Döllenmiş tavuk yumurta (Tablo reçetesi) elde etmek--dan a yerel doğurmak.
Not: Yumurta oksijen bir atmosferde 14 ° C'de deneyler için kullanmadan önce döşeme sonra 10 gün için saklanabilir. - 38 ° c ile 40-%60 10 için ortalama bir nem yumurtaları kuluçkaya veya bir kuluçka 11 günde sürekli yumurta döner.
2. yumurta yelpazesi
- Yumurta kuluçka 11 gün sonra gübreleme için kontrol edin. Kontrol bir ışık için bu adımı kullanın. Fringe kontrol lambası bir inkpad daldırma ve yumurta sivri tarafı mum.
- Hava kesesi belirlemek için üst kısmında yumurta parlaklık farklılıkları için kontrol.
Not: ne zaman yumurta candled albümin koyu ise hava kesesi yuvarlak, daha şeffaf bölge olarak görüntülenir. - Sonra hava kesesi tespiti, lamba biraz daha önce uygulanan mürekkep ile yumurta karşı basarak işaretlemek.
- Parlaklık albümin ve hava kesesi arasında bir fark gösterme sigara döllenmiş yumurta Bu adımda hariç.
3. enjeksiyon maddelerin
- Faiz (örneğin, bitkisel özü veya insülin) madde madde Hank'in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) arabelleği istenen konsantrasyon sulandrarak hazırlayın. Örneğin, 3.3 U/mL ticari olarak mevcut insülin HBSS içinde analog.
- Seçili bileşik uygulama için yumurta kabuğu cımbız hava kesesi işaretli alanında sivri bir çifti ile dikkatli bir şekilde peck. Bir delik şırınga iğne çapı daha büyük oluşturmaz. Bir şırınga ile pecked alana ilgi madde içeren arabellek çözüm (300 µL) enjekte.
Not: steril, 1 ml tek kullanımlık şırınga, pipet ipuçları ve kaplar kullanın. Eldiven ve önlük deneyler için giymek. - Bir madde kan şekeri azaltarak etkisini belirlemek için yumurta geri kuluçka makinesi 60, 120 ve 180 dk, sırasıyla yerleştirin. Bazal kan şekeri düzeylerini belirlemek için en az 10-15 sigara tedavi kontrol yumurta ekleyin.
4. toksisite testleri
- Sonra uygulama seçili bahçedeki 24 h için yumurta kabuğu membran fosfat tamponlu tuz (PBS) arabellek (bütün yumurta kabuğu membran kapak için yeterli) ile en az 30 için equilibrate s.
- Aşırı PBS arabellek uzakta dökerek kaldırın.
- Yumurta kabuğu membran dikkatle cımbız sivri bir çift ile çek.
- Kan damarları lezyonlar için kontrol ve canlılık (örneğin, hareketi) civciv embriyo onayla.
Not: Vital hayati embriyo karşı karşılaştırma için zehirli bir bitkisel özü uygulamadan sonra bkz. şekil 1 .
5. kan glikoz değer ölçümü
- İlgili zamanda noktada dikkatli hava kesesi yukarıda yumurta kabuğu kaldırmak ve yumurta kabuğu membran PBS arabellek (bütün yumurta kabuğu membran kapak için yeterli) ile equilibrate.
- Aşırı PBS arabellek uzakta dökerek kaldırın.
- Dikkatle yumurta kabuğu membran cımbız sivri bir çift ile çek.
- Kesme ve chorioallantoic membran ile mikro-uygun kan damarları iyi erişimi etkinleştirmek için makas, kaldırın. Membran kesmek en az 2-3 cm. Herhangi bir büyük gemilerin zarda kendisini embriyo istenmeyen kan kaybını önlemek için uygun değil.
- Embriyo karından kaynaklanan büyük gemi bulun. Bu gemi albümin kapalı mikro-makas ile dışarı kaldırın ve plastik bir pH-şerit yerleştirin. PH şerit mikro-makas ile düzenlenen geminin altında hareket ve geri mikro-makas uzakta dikkatlice çekin.
- 1-2 mL sıvı kan sonraki adımda seyreltme önlemek için bir pipet ile chorioallantoic membran altında kaldırın. Gemi kesmeden önce gemi ve pH-şerit filtre kağıdı, Kuru.
- Bir tarafta kan damarı dikkatle mikro-makas ile kesti. Gemi ile tamamen işlevsel değil.
Not: Yaklaşık 1 mm kalın gemisi. Yarısından fazlası gemi tamamen çıkarmak kayma ve hiçbir kan toplama mümkündür gibi kesme önlemek için gemi kesmeyin. - Sızıntı Kan pH-bir pipet kullanarak Strip'te toplamak. On microliters kan kan şekeri ölçüm cihazı kullanarak glukoz düzeylerini belirlemek için gereklidir.
6. istatistiksel değerlendirme
- Her zaman noktası en az 10 bireysel yumurta ortalama değerini hesaplamak ve denetim yumurtaların (yumurta sigara - veya arabellek-tedavi) için bu değerleri normalize.
- Daha sonra azalma yüzdesini belirleyin. Buna ek olarak, insülin olumlu bir denetimi kullanın.
Not: her deney en az üç kere tekrar edin.
Representative Results
Gluc-HET yaklaşım açıklaması:
Faiz maddeler ile kuluçka sonra döllenmiş yumurta açtı ve kan toplama için yumurta kabuğu (Şekil 2) Temizleme tarafından hazırladı. Daha fazla hazırlık denge ve chorioallantoic membran erişmek için yumurta kabuğu membran kaldırılmasını içerir. Bu zar dikkatle kan koleksiyonu için uygun bir kan damarı erişim sağlamak için kesilir. Tercihen, embriyo karından kaynaklanan büyük gemi bir plastik pH-şerit üzerinde yer alıyor. Toplama sırasında kan seyreltme önlemek için gemi ve pH-striptiz okşadı kuru filtre kağıdı ile. Kan damarı sonra kesilir ve kan pH-şerit sızıntı bir pipet kullanarak analiz için toplanır.
Kan glikoz düzeyleri üzerine etkisi seçili bitkisel özler:
Bir yeni kurulan GLUT4-translocation Nefelometri tabanlı birincil ekran ile maddeler bir insülin mimetic karakteristik10ile tespit edebiliyoruz. Tarama, suda çözünebilen bitkisel özler yüzlerce birden fazla bulunan tanımlaması içinde sonuçlandı. Bu özler bizim içinde -ovo modeli test edildi. Özler Combretum indicum (Rangoon sarmaşık) hazırlanan ve (özü 0845 denir) bir sigara ifşa özü bu deneyler için kullanılmıştır. Özler HBSS tampon 300 mg/L, önceki çalışmalar12,13' te uygun olduğu ortaya çıktı bir konsantrasyon, dağıldı. Madde 11 gün boyunca inkübe embriyolar için uygulandı. Şekil 3' te gösterildiği gibi Rangoon sarmaşık ayıklamak içinde bir önemli kan şekeri azaltma ovosonuçlanmamıştır. Ancak, kan glikoz konsantrasyonu başarıyla özü 0845, 60 dk sonra küçük bir düşüş ile ile olan ticari olarak mevcut insülin analog kullanarak gözlenen etkisi karşılaştırılabilir düşürüldü. Önemli bir etkisi ne zaman yumurtaların kuluçka süresi uzamış gözlendi.
Şekil 1: toksik bileşiklerin etkisi embriyo canlılık. Yumurta (A ve C) 11 gün boyunca inkübe veya toksik bir bitkisel özü başka bir 24 h için günde 10 ile tedavi (B ve D). Uygulama ekstresinin chorioallantoic membran (D) ve (B)embriyo kan damarlarının ağır lezyonlar yol açtı.
Resim 2: Ovo modelinin açıklaması. Soldan sağa: açılış ve yumurta kabuğu kaldırılması (1 - 2); denge ve yumurta kabuğu membran chorioallantoic membran ile kaldırılması (3)maruz; pH-şerit (4)hazırlanan gemide; Kan ve bir glikoz metre (5)kullanarak glikoz konsantrasyonu ölçümü topluluğu. Haselgruebler ve arkuyarlanmıştır., 201712. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: tedavi edilmemiş veya insülin tedavi yumurta için karşılaştırıldığında kan şekeri düzeyleri üzerinde bitkisel özler etkisi. Yumurta 11 gün boyunca inkübe ve belirtilen maddelerle tedavi (ticari olarak mevcut insülin analog: 3.3 U/mL; özleri: 300 mg/L) 3 h. kan şekeri bir kan şekeri ölçüm cihazı kullanarak tespit HBSS arabellek (300 µL cilt) çözünmüş. Sonuçları arabellek etkisi gösterilir. Hata çubukları standart hata ortalamaya temel alır. * P < 0,05 ve *** P < 0,0001, önemli azaltmak HBSS tedavi yumurta aynı kuluçka süresi ile ilgili. Haselgruebler ve arkuyarlanmıştır., 201712. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
HET-CAM tahlil hayvan içinde sanayi12test için yaygın olarak kullanılan alternatif test sistemidir. Burada açıklanan ovo sistem HET-CAM tahlil değiştirilmiş bir sürümü temsil eder. Orijinal biçiminde iken, HET-CAM deneyler bileşikler ve formülasyon rahatsız edici özelliklerini veya angiogenez14,15,16analizi eğitimi için gerçekleştirilir, test etmek için yaklaşım adapte olması sözde insülin mimetic özellikleri12bileşikler. Bu deneylerin hayvan deneyleri kabul edilmez bu yana yönergesi 2010/63/AB göre izni bir Etik Komitesi tarafından ilk üçte embriyonik gelişim sırasında sigara yumurtadan kuş embriyo ile deneyler gerek. Son yıllarda yapılan çalışmalarda ovo GLUT4 translocation-tabanlı birincil ekran10' kan şekeri azaltmak için tespit edilen seçili bitkisel özler etkinliğini karakterize sisteme uygunluğu kanıtlanmış insülin12,13yokluğunda. Ovo sistem iyi bir performans için kritik noktalar şunlardır: ilk, döllenmiş yumurta teslim güvenilir a doğurmak. Lohmann klasik kahverengi Tavuk doğurmak iyi bir seçimdir. İkinci olarak, toksisite uygulanması bileşik incelenen yapılması gereken toksik etkileri dışlamak için sınar. Buna ek olarak, kan toplama için uygun bir kan damarı hazırlanması önemlidir. Bu tercih bir kan kaybına yol açabilir gibi büyük gemilerin chorioallantoic zarda kendisi, kesme önlemek önemlidir. Gemi pH şerit kesmeden önce Ayrıca, bu okşadı zorunda kuru seyreltme toplanan kan önlemek için filtre kağıdı kullanarak. Son olarak, deneyler yeterli sayıda önemli gibi görünüyor. Her zaman noktası ve ilgili deney üç kat bir tekrarı için en az 10 yumurta kullanmanızı öneririz.
Doğal olarak, bu ovo yaklaşımın bazı sınırlamalar vardır. Maddelerin yumurta kabuğu membran emilir ve chorioallantoic membran ile yakın temas haline gelir kadar 30 dakika alır bu yana, embriyo hızlı bir yanıt uygulanan bileşiği ölçmek mümkün değildir. Ayrıca, bazı bileşikler lezyonlar chorioallantoic zarda kan damarlarının sık sonuçlanır uygulanan konsantrasyon toksik olabilir. Böylece, sitotoksisite bileşikleri uzun vadeli kuluçka yaklaşık 24 saat dayalı test makul görünür. Son olarak, bulduk bileşiklerin uygulama için kullanılan arabellek sistem tahlil performans üzerinde önemli bir etkisi vardır. 12 embriyo kan glikoz düzeyleri en küçük etkisi sonucunda çünkü şu anda, HBSS arabellek kullanılır.
Gelecekteki uygulamalarda, HBSS alternatif olarak ek arabellek sistemlerinin test. Ayrıca, kolesterol, trigliserid ve lipoproteinler gibi ek kan parametreleri bitkisel özler etkisi çekici bir soru olabilir.
Yeni ovo sistemimiz bir hayvan deney, gerek kalmadan yaşayan bir organizma olarak insülin mimetic özelliklere sahip maddelerin test etmek için umut verici ve önemli bir araçtır. Bu nedenle, in-vitro ve ın-vivo yaklaşımlar arasındaki boşluğu doldurur. Varolan ovo model sistemleri17 ile karşılaştırıldığında diyabet streptozotocin (STZ) tedavi tarafından ikna etmek için gerek yoktur biz gün 10 ya da 11, kuluçka embriyo kullanmak gibi. Bu aşamada, insülin üretim başlatılmamış olması, ama embriyo zaten insülin duyarlı. Ayrıca, 14-17 gün yaşlı embriyo kullanılan17iseniz izni bir Etik Komitesi tarafından gerekli olabilir. Ayrıca, alternatif stratejileri18için bileşik uygulama burada açıklandığı gibi daha az zararlı ve zahmetli, deneysel aracılığıyla yerine oranları artan karşılaştırılır.
Kan azalan etkisi insülin mimetic madde yaşayan bir organizma test edilmesi gerekiyorsa birlikte, bu ovo alınan yaklaşım bir çekici sistemidir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Avusturya araştırma Tanıtım Ajansı (işe FFG; proje numarası 850681), (proje GlucoSTAR) Üniversitesi Uygulamalı Bilimler üst Avusturya temel finansman girişimi ve Merkezi tarafından Tıp (zamanlı Merkezi) teknolojik yenilik için finanse edildi temel finansman tarafından üst Avusturya eyaletinde yer alır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L1825 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| Hens eggs (Lohmann classic brown chicken) | Local Breeder | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II Teststreifen | Roche | 5942861 | |
| Incubator HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
| Syringe Omnican F 1 mL | Braun | 09161502S | |
| Extracts | PEKISH extract library | ||
| Lamp Tempo Nr. 119 | ORBAN |
References
- Defronzo, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).
- American_Diabetes_Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).
- Han Cho, N., et al. IDF Diabetes Atlas. Cavan, D. 7, International Diabetes Federation. (2015).
- Bailey, C. J., et al. Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes. Diabetes & vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).
- Maruthur, N. M., et al. Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).
- Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. E. Current Advances in the Biochemical and Physiological Aspects of the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus with Thiazolidinediones. PPAR research. , 7614270 (2016).
- Cohen, F. J., Neslusan, C. A., Conklin, J. E., Song, X. Recent antihyperglycemic prescribing trends for US privately insured patients with type 2 diabetes. Diabetes care. 26 (6), 1847-1851 (2003).
- Desai, N. R., et al. Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications. The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).
- Martel, J., et al. Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms. Nature reviews. Endocrinology. , (2016).
- Lanzerstorfer, P., et al. Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).
- Onur, S., Stöckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., Döring, F. The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library. Journal of Food Research. 2 (4), (2013).
- Haselgrubler, R., et al. Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds. PloS one. 12 (8), e0182788 (2017).
- Stadlbauer, V., et al. Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts. PloS one. 11 (1), e0148109 (2016).
- Greywe, D., et al. Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial. Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).
- Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test. Neuro endocrinology letters. 31, Suppl 2. 8-10 (2010).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
- Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin. Biological & pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).
- Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN). Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).
