Prøvetagningsmetoder og forarbejdning af Biobank vævsprøver fra svin biomedicinsk modeller

Summary

Den praktiske anvendelse og ydeevne metoder til generering af repræsentative vævsprøver af svin dyremodeller for et bredt spektrum af downstream analyser i biobank projekter er demonstreret, herunder volumetry, systematisk stikprøveudtagning, og differentieret behandling af vævsprøver af kvalitative og kvantitative morfologiske og molekylære analyser former.

Abstract

I translationel medicinsk forskning blevet svin modeller stadigt mere populære. Overvejer den høje værdi af individuelle dyr, især af genmanipulerede svin, modeller, og det ofte begrænset antal tilgængelige dyr af disse modeller, etablering af (biobank) samlinger af tilstrækkeligt forarbejdede vævsprøver egner sig til en bredt spektrum af efterfølgende analyser metoder, herunder analyser ikke angivet på tidspunkt for prøvetagning, repræsenterer meningsfuld tilgange til at drage fuld fordel af translationel værdien af modellen. Om særlige forhold for svin anatomi oprettet omfattende retningslinjer for nylig for standardiseret generation af repræsentant, høj kvalitet prøver fra forskellige svin organer og væv. Disse retningslinjer er afgørende forudsætninger for reproducerbarhed af resultaterne og deres sammenlignelighed mellem forskellige undersøgelser og efterforskere. Registrering af grundlæggende data, såsom orgel vægte og diskenheder, bestemmelse af prøveudtagning placeringer og antal af vævsprøver skal genereres, samt deres orientering, størrelse, forarbejdning og trimning retninger, er relevante faktorer bestemmelse af generalizability og anvendeligheden af modellen for Molekylær, kvalitative og kvantitative morfologiske analyser. Her, en illustrativ, praktiske, trin for trin demonstration af de vigtigste teknikker for generation af repræsentant, multi-purpose biobank modellen fra svin væv er præsenteret. De metoder, der beskrives her omfatter bestemmelse af organ/væv diskenheder og tætheder, anvendelsen af en bind-vægtede systematisk stikprøveudtagning procedure for parenkymalt organer ved punkt-tælling, bestemmelse af omfanget af væv svind relateret til histologisk indlejring af prøver og generering af tilfældigt orienterede prøver for kvantitative analyser, stereological, såsom isotropic ensartede tilfældige (IUR) sektioner genereret af “Orientering” og “Isector” metoder og lodret uniform tilfældig (VUR) sektioner.

Introduction

I translationel medicin, svin er i stigende grad fælles til brug som store dyre modeller^1,2,3,4,5, på grund af flere fordelagtige ligheder mellem de svin og Human Anatomi og fysiologi og tilgængeligheden af etablerede Molekylær biologiske metoder giver mulighed for generation af skræddersyet, genetisk modificerede gris modeller for en bred vifte af sygdom betingelser^1,4.

Men i forhold til gnavere modeller, antallet af dyr af et respektive gris model, der kan være fastsat eksperimenter til enhver tid er begrænset. Dette er på grund af svin generation interval på ca. et år, og de finansielle og tidskrævende indsats kræves for generation af svin modeller og husdyrhold. Enkelte dyr af et svin model, samt de prøver, der kan genereres fra disse svin, er derfor meget værdifulde, især hvis genmanipulerede svin modeller og/eller langsigtede eksperimentelle emner (f.eks., sene komplikationer af kroniske sygdomme) er undersøgt i alderen enkeltpersoner^2,6,7.

I forbindelse med enhver undersøgelse, udførelsen af yderligere analyser, som ikke havde været planlagt i den oprindelige eksperimenterende design af undersøgelsen kunne senere vise sig for at være relevante, f.eks., at adresse særskilte spørgsmål som følge af tidligere opdaget uventede resultater. Hvis der ikke findes egnede prøver for sådanne yderligere forsøg, kan uforholdsmæssigt høje omkostninger og tidskrævende udgifter være nødvendigt at generere yderligere svin og vævsprøver. For at være forberedt på sådanne eventualiteter, betragtes generation af biobank samlinger af velbevarede back-up prøver af forskellige organer, væv eller bio-væsker, kvantitativt og kvalitativt egnet til en bred vifte af efterfølgende analyser, som en vigtig tilgang^2,6,7. Der følger optimale fordele fra et svin dyremodel, tilgængeligheden af tilstrækkelige biobank prøver også tilbyder den unikke mulighed for at udføre et bredt spektrum af forskellige analysemetoder på identiske prøvematerialer på en multi orgel niveau i den selvsamme individuelle dyr, f.eks.ved uddeling af vareprøver til forskere af forskellige arbejdsgrupper organiseret i en forskning netværk^2,6,7. Derudover bidrager de ” fremadskuende ” prøvetagningsmetode i biobanking også til en reduktion af antallet af dyr i en undersøgelse. Fordelene ved svin model biobanking har for nylig påvist i en multi orgel, multiomics undersøgelse, undersøge orgel krydstale i en genetisk modificerede svin model af langsigtede diabetes mellitus, ved hjælp af prøver fra München MIDY gris Biobank ².

Der er nogle ufravigelige krav biobank prøver skal generelt opfylde for pålidelighed og interpretability af resultaterne af de efterfølgende udført analyser. Prøverne skal genereres reproducerbar, og de skal være repræsentant, dvs, tilstrækkeligt afspejler de interesserede morfologiske og molekylære funktioner i væv/organ prøverne blev taget fra⁷. For at være egnet til en bred vifte af downstream analysetyper, skal prøverne indtages i tilstrækkelige mængder og forarbejdet i henhold til krav (herunder tid og temperaturforhold) af de forskellige analytiske metoder, herunder beskrivende histopatologisk analyser, såsom cryohistology, paraffin og plast histologi, immunhistokemi, i situ hybridisering, ultrastrukturelle elektron mikroskopisk analyser og klinisk diagnostisk laboratorieanalyser, såvel som Molekylær analyser af DNA, RNA, proteiner og metabolitter.

For at muliggøre vurdering af en bred vifte af forskellige kvantitative morfologiske parametre som tal, mængder, længder eller overfladen områder af forskellige væv strukturer af kvantitative stereological analyser, randomiseret afsnit fly af den histologiske prøver af de respektive organer/væv skal være forberedt^7,8,9,10,11. I kvantitative morfologiske undersøgelser, præcis bestemmelse af den samlede mængde af væv, orgel eller orgel rum, prøverne blev taget fra (dvs.reference pladsen) er afgørende betydning^{7,9 , 12} for at beregne de absolutte mængder af de interesserede parametre inden for de respektive orglet, væv eller organisme. Til sidst, har effekten af embedding-relateret væv krympning under forberedelse af histologiske sektioner til bestemmes og tages i betragtning¹³. Kvantitative analyser, stereological, navnlig af arkiveret prøver (fast vævsprøver, indlejrede væv blokke, histologiske sektioner, osv.) fra tidligere undersøgelser er derfor undertiden stærkt begrænsede eller endda umuligt¹², især hvis volumetry af de respektive organer/væv ikke blev udført, hvis ingen passende stikprøver design blev anvendt for at berettige repræsentative prøver, hvis tal og mængder af tilgængelige enkelte prøver er utilstrækkelige, eller hvis behandlingen af den prøverne er uforenelig med vurdering af den kvantitative morfologiske parametre af interesse. På grund af de mangfoldige mulige påvirke faktorer, egnetheden af arkiv-prøven materialer til analyser af forskellige kvantitative morfologiske parametre kan ikke besvares entydigt, men afhænger af omhyggelig vurdering af hvert enkelt tilfælde.

Således som beliggenhed, størrelse, antal, forarbejdning, trimning retning og orientering af prøver vil potentielt påvirke resultaterne af de efterfølgende analyser, disse faktorer er af stor betydning og skal tages i betragtning i den eksperimentelle design af enhver undersøgelse. Med hensyn til disse aspekter og de særlige træk ved de svin anatomi, omfattende, detaljeret og omfattende prøvetagning retningslinjer tilpasses svin dyremodeller har for nylig blevet etableret, leverer en robust henvisning til standardiserede, reproducerbare , og effektiv generation af redundante, tilstrækkeligt forarbejdede, høj kvalitet prøver fra mere end 50 forskellige svin organer og væv^6,7.

De metodologiske beskrivelser og den video tutorial i denne artikel giver detaljerede, illustrative, forståelige, trin for trin instruktioner for praktiske udførelsen af forskellige teknikker til volumetry, prøvetagning af svin væv og organer, og behandlingen af vævsprøver for forskellige downstream analysemetoder. De fremhævede teknikker omfatter metoder til bestemmelse af organ/væv diskenheder og tætheder baseret på principperne om Archimedes og Cavalieri⁹, herunder bestemmelse af dimensioner af tre-dimensionelle svind af væv i forbindelse med den indlejring i forskellige indlejring medier¹⁴ under forarbejdningen til histologisk undersøgelse, anvendelse af praktisk volumen-vægtede systematisk tilfældige stikprøver tilgange, behandling af stikprøven væv prøver for forskellige efterfølgende analyser^7,8,9,15, og generation af behørigt orienteret og forarbejdede prøver for potentielle kvantitative stereological analyser^{7,8, 9,10,11}. Ved siden af deres anvendelse i svin biobank projekter er de påviste metoder generelt egnede for alle studier undersøger kvantitative Histò-morfologiske egenskaber af organer/væv. Desuden er systematisk stikprøveudtagning designs især gavnligt for generation af repræsentative prøver i eksperimenter af molekylære analysemetoder til påvisning af overflod, ændringer, fx, RNA’er, proteiner eller metabolitter i forskellige organer og væv.

De næste afsnit giver en kort introduktion til disse metoder, mens deres praktiske resultater er beskrevet i afsnittet protokol.

Bestemmelse af organ/væv diskenheder
Bestemmelse af orgel vægte og diskenheder er vigtige i flere eksperimentelle indstillinger, da disse faktorer kan indikere ændringer, potentielt relateret til eksperimentelt undersøgt faktorer af interesse. Det samlede volumen af et organ/væv er også almindeligt kræves for at beregne absolutte kvantitative parametre, (fx, samlede celle nummer), fra stereologically anslåede numeriske volumen tætheder (dvs., at antallet af celler pr. volumen enhed af væv)^7,12. Ud over teknikker, der anvender komplekse teknisk udstyr, herunder computertomografi, der er grundlæggende tre praktiske metoder almindeligvis anvendes til at bestemme den absolutte volumen af et organ eller væv. Volumen af et organ kan bestemmes ved “direkte volumetrisk måling” i henhold til princippet om Archimedes, dvs., måle mængden af vand eller saltvand fordrevet af strukturen, når helt neddykket. Men for forholdsvis store svin organer, disse tilgange er upraktisk og udsat for upræcise, da de kræver meget store volumetriske/måling kolber. Mere bekvemt, volumen af et organ/væv kan beregnes ud fra sin vægt og massefylde^7,12,16, som effektivt kan bestemmes ved hjælp af “submersion metode”^{7,12 ,16} (protokol trin 1.1.). Organ/væv diskenheder kan også estimeres ved hjælp af volumetry tilgange baseret på “princippet om Cavalieri” (1598-1647). I enkle vendinger, Cavalieri princippet fastslår, at hvis to objekter er opdelt i planer parallelt med en stelplade, og profiler af sektionerne skære igennem de to objekter på tilsvarende afstande fra stelpladens har de samme områder, de to objekter har den samme mængde. Således kan omfanget af vilkårligt formede objekter estimeres som produktet af deres afsnit profil områder i parallel, lige så Fjern sektion fly og afstanden mellem afsnit planer. Dette er forståeligt med de følgende analogi: overveje to stakke består af det samme antal identiske mønter er placeret side om side, en stak med mønter ordnet stablet oven på hinanden giver en cylindrisk form af mønt stack, og den anden stakken af mønter med off-center placeret mønter (figur 3A). Selv om figurer af begge mønt stakke er forskellige, deres diskenheder er de samme, siden områderne af mønter på et tilsvarende niveau af både stakke (dvs.områder af profiler for parallelle strækninger skære igennem begge mønt stakke i samme afstand fra den jorden) er identiske. Skøn over mængden af svin organer og væv ved hjælp af Cavalieri princip^7,12,15 er beskrevet i trin 1.2.

Bestemmelse af omfanget af væv svind relateret til histologisk indlejring
I analyser af flere kvantitative morfologiske parametre måles i histologiske væv sektioner, har effekt af embedding-relateret væv svind opstår under væv behandling for histologi at bestemmes og tages i betragtning. Udstrækningen af integrering-relateret væv svind kan være variabel og afhænger af både på vævet, forarbejdningen og den indlejring medium^{8,13,17,18,19}. Generelt, embedding-relaterede ændringer af mængden af en vævsprøve (dvs., for det meste svind) forekomme i alle tre dimensioner af rummet, og derfor påvirker alle dimensionelle parametre anslået af kvantitative stereological analyser⁸ . Dybest set, udstrækningen af integrering-relateret væv svind, udtrykt som den lineære væv svind faktor (f_S), kan estimeres som vist i trin 1.3. og anvendes til korrektion af (svind-følsomme) kvantitative morfologiske parametre¹⁴.

Volumen-vægtede systematisk stikprøvekontrol af organer/væv
For etablering af en biobank samling af svin orgel/vævsprøver, volumen-vægtede systematisk stikprøveudtagning tilgange som beskrevet i trin 2 har vist sig for at være praktisk tidsbesparende og effektiv teknikker for generation af repræsentant, multi-purpose væv prøver^7,8,9,15.

Generation af Isotropic ensartede tilfældige sektioner og lodret ensartede tilfældige sektioner for kvantitative stereological analyser
Biobank vævsprøver skal være egnet til en lang række forskellige kvantitative stereological analysemetoder for estimation af parametre, kunne ikke bestemmes uden et tilstrækkeligt forberedt modellen maksimalt. Næsten alle kvantitative stereological parametre kan bestemmes, ved hjælp af “isotropic (uafhængige) ensartede tilfældige (IUR) afsnit”^8,9. I IUR sektioner, er den tredimensionale orientering af sektionsplan af vævsprøve randomiseret. Dette kan opnås ved randomisering af vævsprøve i forhold til placeringen af sektionsplan, stilling, som anvendes i “Isector” metode¹¹ (protokol trin 3.1) eller ved randomisering af orientering af sektionsplan forhold til den vævsprøve, som i “Orientering” metode¹⁰ (protokol trin 3.2). I vævsprøver, såsom hud- eller slimhinde modellen viser et naturligt er til stede, eller definerede og korrekt identificerbare lodrette akse, forberedelse af “lodret ensartede tilfældige (VUR) afsnit” (protokol trin 3.3.) strengt sectioned i flyet for deres lodrette akse er fordelagtige^8,20. For en komplet diskurs af det teoretiske grundlag for IUR/VUR prøveudtagning og en omfattende diskussion af potentielle downstream kvantitative stereological analyser omtales den interesserede læser lærebøger af kvantitative Stereologi i livet Sciences^8,9.

Protocol

Alle metoder, der beskrives bruge her vævsprøver fra døde dyr og fuldt ud overholde de tyske retsforskrifter om dyrevelfærd. 1. Volumetry Submersion teknik til bestemmelse af væv/Organ tætheder (figur 1 og figur 2) 7 , 12 , 16 Forberede materialer: skalpel vinger, pa…

Representative Results

Neddykning teknik til bestemmelse af væv/organ densitet Fig. 12A -B viser den repræsentative bestemmelse af tætheden og volumen af et svin nyre ved hjælp af submersion teknik beskrevet taktfast 1.1 (figur 1, figur 2). Mere repræsentative resultater af tæthed målinger af yderligere svin organer og væv er præsenteret i …

Discussion

Generation af biobank prøve samlinger fra svin dyremodeller kræver robust teknikker og protokoller til bestemmelse af organ/væv diskenheder, den reproducerbare generation af repræsentant, redundant vævsprøver egnet til en bred vifte af forskellige analysemetoder og randomisering af orientering af prøven sektioner for kvantitative stereological analyser. De metoder, der beskrives i denne artikel er tilpasset størrelsen på svin organer og væv, og er blevet udviklet for at effektivt opfylder disse krav<sup class="…

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.