Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolere lymfocytter fra mus Small Intestinal immunsystemet

Published: February 28, 2018 doi: 10.3791/57281
Automatic Translation
1, 1
1Center for Infectious Diseases, Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

Summary

Her beskriver vi en detaljeret protokol til isolering af lymfocytter fra de induktive websteder inklusive de Peyerske plaques gut-associerede lymfoide væv og afdrypning mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder, og effektor herunder lamina propria og den intestinale epitel af lille tarm immunsystemet.

Abstract

Tarm immunforsvaret spiller en væsentlig rolle i at opretholde den barriere funktion i mave-tarmkanalen ved at generere tolerante svar til kosten antigener og commensal bakterier mens montering effektiv immunrespons til enteropathogenic mikrober. Derudover er det blevet klart, at lokale intestinal immunitet har en dybtgående indvirkning på fjernt og systemisk immunitet. Det er derfor vigtigt at undersøge hvordan en tarm immunrespons er induceret og immunologiske resultatet af reaktionen er. Her, en detaljeret protokol er beskrevet til isolering af lymfocytter fra tyndtarmen induktive sites som de Peyerske plaques gut-associerede lymfoide væv og afdrypning mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder og effektor sites som lamina propria og den intestinale epitel. Denne teknik sikrer isolering af et stort antal lymfocytter fra små tarmens væv med optimal renhed og levedygtighed og minimal afdelingsmæssig krydskontaminering inden for acceptable tidspresset. Den tekniske kapacitet til at isolere lymfocytter og andre immunceller fra tarmens væv gør det muligt for forståelsen af immunrespons gastrointestinale infektioner, kræft og inflammatoriske sygdomme.

Introduction

Den gastrointestinale (GI) tarmkanalen har mange folder og fremspring, der repræsenterer den største grænseflade adskille den indre krop og det ydre miljø. Tarm immunforsvaret spiller en væsentlig rolle i at opretholde den barriere funktion af mave-tarmkanalen. Det er konstant udsat for kosten antigener, commensal bakterier og patogene mikrober. Som sådan må det forblive tolerant over for fødevarer antigener og commensal bakterier samtidig bevare evnen til at generere hurtigt en effektiv immunrespons på enteropathogenic mikrober1. Tarm immunsystemet kan anatomisk opdeles i induktive sites, hvor naiv lymfocytter aktiveres af antigen præsentere celler transporterer antigener fra tarmslimhinden, og effektor websteder, hvor aktiverede lymfocytter udøve bestemte effektor funktion2. De induktive sites omfatter organiseret lymfoide strukturen af Peyerske plaques (PP), undersøgelser af intestinal lumen direkte gennem handling af specialiserede M celler og regionale afdrypning mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder (mio.). Effektor websteder består af lamina propria (LP), som er bindevæv under basalmembranen og den intestinale epitel, et enkelt cellelag placeret over basalmembran, der indeholder intraepithelial lymfocytter (IEL). Lymfocytter er store spillere af adaptive immunitet, der mægle beskyttelse mod infektioner og kræftformer og kan også bidrage til immunopathology i inflammatoriske sygdomme. Det er vigtigt og yderst relevant at studere lymfocytter i disse forskellige anatomiske slimhinde rum for bedre at kunne forstå deres induktion og effektor funktion.

En relativt enkel og samlet protokol til isolering af lymfocytter fra disse rum er nødvendig som antallet af efterforskerne at udforske immun hændelser, som forekommer i tarmen accelererende. Flere forskergrupper har offentliggjort protokoller, der deler flere lignende processer til isolering af immunceller fra musen lille tarm rum3,4,5,6,7 . Der er dog flere tekniske forskelle blandt dem afhængigt af fokus for den enkelte protokol. For eksempel, med fokus på isolere immunceller fra LP, analyserer én protokol konsekvensen af forskellige enzymatiske digestions på cellernes levedygtighed, celle overflade markør udtryk og sammensætningen af isolerede immunceller5. En anden protokol fremhæver en hurtig og reproducerbar metode til isolation af lymfocytter uden tæthed centrifugering6. Endelig findes bestemte protokoller også med henblik på isolering af mononukleære fagocytter fra forskellige væv lag af tyndtarmen7. Her, er en yderst reproducerbare protokol, der giver mulighed for sekventielle isolation af lymfocyt befolkning fra MLN, PP, LP og IEL rum af tyndtarmen præsenteret.

Vi fokuserer på isolere højtrenset befolkninger fra de LP og IEL rum, der er stort set fri for forurenende stoffer fra andre intestinal rum. Dette udbredt meget protokol producerer et højt udbytte af maksimalt ren og levedygtige lymfocytter indenfor acceptabel tid begrænsninger4,8,9,10,11,12. Denne protokol også sikrer isolering af lymfocytter fra LP og IEL rum med minimal afdelingsmæssig krydskontaminering, at en bona fide mulighed for at studere lymfocytter i disse særskilte rum. De isolerede lymfocytter kan underkastes yderligere manipulationer som flow cytometric analyse og funktionalanalyse. Denne protokol har været anvendt med succes til isolering af lymfocytter fra mus tyndtarmen og tyktarmen i løbet af bakterielle infektioner som Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumog Yersinia pseudotuberculosis infektioner og inflammatoriske tilstande såsom kemiske - og patogen-induceret colitis. Denne protokol kan også bruges til at isolere medfødte immun celler såsom dendritiske celler, makrofager, neutrofile og monocytter fra mus tyndtarmen og tyktarmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med National Institute of Health retningslinjer og godkendt af Stony Brook University institutionelle Animal Care og brug udvalget.

Bemærk: Sikre, at alle godkendelser er tildelt før den udfører procedurer.

1. løsning forberedelse

  1. HGPG (HEPES, L-glutamin, penicillin/streptomycin og phosphatbufferet), 100 ×
    1. Bland 59.6 g HEPES (500 mM endelige), 14,6 g L-glutamin (200 mM endelige), 1 × 106 U penicillin (2.000 U/mL endelige), 1 g streptomycin (2 mg/mL endelige) og 2,5 mg gentamicin (5 µg/mL endelige). Tilføj RPMI 1640-500 mL. Juster pH-værdien til 7,5 ved hjælp af NaOH (før justering, bufferen er gul/orange med en pH-værdi omkring 6.0). Filter sterilisere ved hjælp af et 0,45 µm filter. Alikvot og opbevares ved-20 ° C i op til 1 år eller ved 4 ° C i op til 1 måned.
  2. HEPES-bikarbonatbuffer, 10 x
    1. Bland 23,8 g HEPES (100 mM endelige), 21 g NaHCO3 (250 mM endelige) og tilsæt vand til 1000 mL. Justere pH til 7,2 med HCl. Filter sterilisere ved hjælp af et 0,45 μm filter. Opbevares ved stuetemperatur. PH ændrer sig over tid. Re-justere pH med jævne mellemrum.
  3. Høste medier (~ 1 flaske/2-mus)
    1. 500 mL RPMI 1640, tilføje 25 mL varme-inaktiverede føtal bovint serum (5% endelige) og 5 mL 100 × HGPG. Gemme op til 6 måneder ved 4 ° C.
  4. Dithioerythritol (DTE) løsning (40 mL/lille tarmen)
    1. Mix 50 mL 10 × Hanks afbalanceret saltopløsning, Ca2+- og Mg2+-gratis, 50 mL 10 × HEPES-bikarbonat buffer og 50 mL varme-inaktiverede føtal bovint serum (10% endelige). Tilføje 350 mL H2O og 15,4 mg dithioerythritol pr. 100 mL (1 mM endelige). Forberede denne friske før brug.
  5. Ethylendiamintetra syre (EDTA) opløsning (50 mL/lille tarmen)
    1. Mix 50 mL 10 × Hanks afbalanceret saltopløsning, Ca2+- og Mg2+-gratis med 5 mL 100 × HGPG. Tilføje 445 mL H2O. tilføje 260 µL 0,5 M EDTA/100 mL (1,3 mM endelige). Forberede denne friske før brug.
  6. Collagenase løsning (30 mL/LP)
    1. Til 500 mL RPMI, tilsættes 50 mL FBS (10% FBS endelig), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (1 mM endelige) og 1 mL 0,5 M CaCl2 (1 mM endelige). Tilføj collagenase, Type I (100 U/mL endelig). Forberede denne friske før brug.
  7. Tæthed gradient (GD) løsninger
    1. Forberede 1 × GD stamopløsning ved blanding af 90 mL GD stamopløsning (Se Tabel af materialer) med 10 mL af 10 × PBS. Holde sterile ved 4 ° C.
    2. Forberede 44% GD løsning (8 mL/IEL, 8 mL/LP) ved at blande 44 mL af 1 × GD stamopløsning og 56 mL RPMI 1640. Forberede denne friske før brug.
    3. Forberede 67% GD løsning (5 mL/IEL, 5 mL/LP) ved at blande 67 mL af 1 × GD stamopløsning og 33 mL RPMI 1640. Forberede denne friske før brug.

2. isolering af mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder, tarme og Peyer's Patches

  1. Aflive musen ved hjælp af CO2-narkose og sekundære cervikal dislokation. Placer musen på ryggen og spray med 70% ethanol. Brug saks til at gøre en midterlinjen indsnit og åbne hud og bugvæggen at eksponere bughulen.
  2. Find caecum og bruge tang til at forsigtigt trække caecum ned. Bruge pincet til at omhyggeligt gå tyndtarmen til højre, udsætte hele MLN kæden, som er afstemt med kolon.
    Bemærk: Et kort over mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder kæde og lymfe dræning af tarmene var tidligere skildret13.
  3. Identificere noden bunden i kæden, ligger tættest til coecum. Bruge ét sæt af tang til at gribe mesenterium/fedt omkring det og forsigtigt fjerne MLN kæde fra bunden til toppen af pincet fedt fra omkring lymfeknude med et andet sæt af tang.
  4. Lå MLN kæde på et stykke køkkenrulle fugtet med høsten medier. Fjerne mesenterium/fedt af rullende kæden på papir tårn og trækker fedt med to sæt af tang. Sted MLN i kolde høst medier til senere isolation trin.
    Bemærk: a direkte håndtering af noder er afskrækket. I stedet, forstå mesenterium/fedt omkring dem. (ii) det er vigtigt at fjerne så meget mesenterium/fedt som muligt at forbedre cellernes levedygtighed.
  5. Skære tyndtarmen under den pylorus lukkemuskel og over coecum ved hjælp af saks. Tag tarmen ud langsomt fra ileum duodenum ved hjælp af et sæt af tang mens du fjerner den vedhæftede mesenterium/fedt ved hjælp af et andet sæt af tang.
  6. Placer tarmen på et stykke køkkenrulle fugtet med høsten medier og drille enhver resterende mesenterium/fedt ud med to sæt af tang.
    Bemærk: (i) være sikker på at fjerne så meget mesenterium/fedt som muligt for optimal celle udbytte og levedygtighed. (ii) holde tarmen fugtet i hele dette og de følgende trin ved at anvende høst medier med jævne mellemrum.
  7. Indsamle Peyerske plaques ved at fjerne dem fra tarmen med en buet saks. Bruge et dissekere muligheder eller Forstørrelsesglas hvis nødvendigt (begyndere); de fleste Peyerske skal være synlige for det trænede øje. Indsamle 5-11 (typisk) Peyerske fra tyndtarmen. Sted Peyer patches i kolde høst medier til senere isolation trin.
    Bemærk: Peyer's patches er små, primært runde buler i den ydre tarmvæggen overfor linjen af mesenterium vedhæftet fil.
  8. Brug den flade side af pincet og forsigtigt dias fra duodenum mod ileum for at udvise fecal indhold og slim. Gentag én gang for at fjerne de fleste af slim.
    Bemærk: Ufuldstændig fjernelse af slim kan nedsætte cellers levedygtighed og udbytte. Ikke desto mindre være sikker på at skubbe tarmen forsigtigt for at undgå stripping villi eller beskadige basalmembranen.
  9. Brug fine Sakse med en stump ende på ét punkt, Indsæt den stumpe ende i tarmen, og skære tarmen åben på langs fra duodenum til ileum. Sideværts skåret åbnede tarmen i ~ 2-cm stykker. Placer de intestinale stykker i en 50 mL konisk tube med 25 mL koldt høst medier for senere isolation trin.
    Bemærk: At holde saksen fugtet med media vil hjælpe dem glide ubesværet gennem tarmen.

3. isolering af lymfocytter fra de induktive Sites

  1. Isolere lymfocytter fra MLN af forsigtigt tog gennem en 70 µm celle si bruge stemplet af en 3-mL sprøjte. Vask celle si med 5 mL af kolde høst medier.
  2. Pellet MLN-celler ved centrifugering ved 400 × g i 5 min. ved 4 ° C. Celle resuspenderes i 1 mL koldt høst medier. Grev levedygtige celler benytter trypan blå udstødelse.
    Bemærk: røde blodlegemer lysisbuffer kan bruges til at fjerne røde blodlegemer, hvis blødning opstået under fjernelse.
  3. Isolere lymfocytter fra Peyerske plaques ved at inkubere Peyerske plaques i en 15 mL konisk slange der indeholder 5 mL forvarmet collagenase løsning ved 37 ° C og 220 rpm i 30 min.
  4. Vortex for 15 s på maksimale indstilling og filter fordøjet væv og supernatanten ind i en 50 mL konisk rør gennem en 70 µm celle si. Forsigtigt adskille de resterende væv stykker bruge stemplet af en 3-mL sprøjte og vaske celle si med 5 mL af kolde høst medier.
  5. Pellet Peyer's patch celler ved centrifugering ved 400 × g i 5 min. ved 4 ° C og celle resuspenderes i 1 mL koldt høst medier. Grev levedygtige celler benytter trypan blå udstødelse.
    Bemærk: Peyer's patches isolation kan have nogle kontaminerende lamina propria lymfocytter og intraepithelial lymfocytter.

4. isolering af Intraepithelial lymfocytter fra tyndtarmen

  1. Vask stykker af tyndtarmen tre gange med 25 mL af kolde høst medier af invertere røret 10 gange, at lade de intestinale stykker bosætte sig og hælde ud supernatanten.
    Bemærk: Væv stykker bør let bilægge til bunden af røret. Hvis de ikke gør det, er det en indikation, at for meget mesenterium/fedt forbliver fastgjort eller de er forbundet med en luftboble.
  2. Der tilsættes 20 mL af forvarmet DTE løsning til 50 mL konisk rør indeholdende tarmen stykker og overførsel til en 50 mL Silikoniseret Erlenmeyerkolbe indeholdende en rør-bar. Rør ved 37 ° C og 220 rpm på en magnetomrører til 20 min. Brug en stor magnet på ydersiden af kolben til at holde rør-bar og væv samt løsning tilbage til 50 mL konisk tube.
  3. Vortex tube maksimale indstilling for 10 s. overførsel supernatanten ind i en ny 50 mL konisk rør gennem en 70 µm celle si at være omhyggelig med at holde væv stykker i den oprindelige tube. Smid ikke supernatanten; supernatanten indeholder intraepithelial lymfocytter. Pellet celler ved centrifugering ved 400 × g i 5 min. ved 4 ° C. Celle resuspenderes i 10 mL koldt høst medier og opbevares på is.
  4. Der tilsættes 20 mL af forvarmet DTE løsning til 50 mL konisk rør indeholdende tarmen stykker og overføre tilbage til 50 mL Silikoniseret Erlenmeyerkolben indeholdende en rør-bar. Rør ved 37 ° C og 220 rpm på en magnetomrører til 20 min. Brug en stor magnet på ydersiden af kolben til at holde rør-bar og væv samt løsning tilbage til 50 mL konisk tube.
    Bemærk: DTE er en reduktionsmiddel, der beriger intraepithelial lymfocytter.
  5. Vortex tube maksimale indstilling for 10 s. overførsel supernatanten gennem en 70 µm celle si ind i tidligere rør, der indeholder celler fra supernatanten af det første DTE behandling (fra trin 4.3).
    Bemærk: De resterende tarm stykker bruges til at isolere lymfocytter fra lamina propria. Kvalitetskontrol: Et stykke væv kan fjernet og undersøgt histologisk til at sikre, at epitelceller er til stede og basalmembranen er intakt.
  6. Pellet celler ved centrifugering supernatanten ved 400 × g i 5 min. ved 4 ° C. Resuspenderes celle i 8 mL af 44% GD løsning ved stuetemperatur (RT).
  7. Overførsel 8 mL 44% GD løsning/celle suspension i en 17 mm ø x 100 mm stil 14 mL polypropylen runde-nederste rør. Underlag med 5 mL RT 67% GD løsning. Der centrifugeres ved 1600 × g i 20 min. på RT uden at bruge bremsen.
    NOTE: Rør kan være forbehandlet med bovint serum til at forhindre celler klistrer til tube vægge.
  8. Bemærk, at levedygtige celler danner et band (buffy coat) på grænsefladen 44% til 67%, døde celler og nogle epitelceller er i en slimet film øverst på gradueringen, og de røde blodlegemer er i pellet. Fjern det øverste lag af gradient til inden for ~ 2 cm på grænsefladen af vakuum aspiration. Bruge Pasteur pipette til at høste buffy coat på grænsefladen og overføre dem til en 50 mL konisk slange der indeholder 40 mL koldt høst medier.
  9. Pellet celler ved centrifugering ved 400 × g i 5 min. ved 4 ° C. Celle resuspenderes i 1 mL koldt høst medier. Grev levedygtige celler benytter trypan blå udstødelse.

5. isolering af Lamina Propria lymfocytter fra tyndtarmen

  1. Fjerne epitelceller fra tarmens væv stykker ved at tilføje 25 mL EDTA-oploesning, forvarmet til kolbe indeholdende de resterende tarm stykker. Stir kolben ved 37 ° C og 220 rpm på en magnetomrører i 30 min. Brug en stor magnet på ydersiden af kolben til hold opsigt-bar og omhyggeligt supernatanten samtidig holde intestinal stykker i kolben.
    Bemærk: a EDTA er et calcium-chelator, der er rettet mod calcium-afhængige vejkryds fremmer udstationering af intestinale epitel celler. (ii) supernatanten bør være uklar og kan bruges til at isolere IEC eventuelt deres samling.
  2. Gentag trin 5.1.
    Bemærk: Supernatanten bør være mindre overskyet, efter denne inkubation. Kvalitetskontrol: Et stykke væv kan fjernet og undersøgt histologisk for at tarm epitelceller er blevet fjernet og basalmembranen er intakt. En prøve af supernatanten kan også vurderes ved flowcytometri at bekræfte at leukocytter (CD45+ celler) er fraværende.
  3. Kolben tilsaettes 50 mL RT høst medier. Rør kort med en magnet. Lad intestinal stykker bosætte sig og omhyggeligt supernatanten.
    Bemærk: Dette trin sikrer fjernelse af EDTA før collagenase fordøjelsen som EDTA inaktiverer collagenase af chelaterende calcium, der er afgørende for collagenase funktion.
  4. Kolben tilsættes 30 mL af forvarmet collagenase løsning og rør intestinal stykker ved 37 ° C og 220 rpm på en magnetomrører for 45 min.
  5. Overføre fordøjet væv og supernatanten til en 50 mL konisk slange ved filtrering gennem et 70 µm celle si. Forsigtigt adskille resterende væv stykker ved hjælp af stemplet af en 3-mL sprøjte til mash gennem filteret. Vask filteret med 10 mL koldt høst medier.
  6. Pellet celler ved centrifugering ved 400 × g i 5 min. ved 4 ° C. Resuspenderes celle i 8 mL af omgivende temperatur 44% GD løsning.
  7. Overførsel 8 mL 44% GD løsning/celle suspension i en 17 mm ø x 100 mm stil 14 mL polypropylen runde-nederste rør. Underlag med 5 mL af omgivende temperatur 67% GD løsning. Der centrifugeres forløb ved stuetemperatur og 1600 × g i 20 min. med ingen bremse.
  8. Fjerne fedt lag på toppen af vakuum aspiration. Bruge en Pasteur pipette til at høste buffy coat på interface og overførsel til en 50 mL konisk slange der indeholder 40 mL koldt høst medier.
  9. Pellet celler ved centrifugering ved 400 × g i 5 min. ved 4 ° C. Celle resuspenderes i 1 mL koldt høst medier. Grev levedygtige celler benytter trypan blå udstødelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skematisk gengivelse af protokollen er afbildet (figur 1). Lymfocytter i tarmslimhinden induktive og effektor websteder er udpræget organiseret. Peyer's patches (PP) og mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder (mio.) indeholder lymfocytter i velorganiseret T-celle områder og B-celle follikler, mens den intestinale epitel indeholder lymfocytter, der er mere diffust fordelt. Lamina propria (LP) indeholder både diffust fordelt lymfocytter og lymfocytter indeholdt i organiseret lymfoide strukturer som isolerede lymfoide follikler (ILF) og cryptopatches. Hvert intestinal immun rum er også karakteriseret ved en unik sammensætning af lymfocyt delmængder (figur 2). MLN er hovedsageligt sammensat af αβ T celler (~ 70%), mens PP lymfocytter er for det meste B celler (~ 80%). LP lymfocyt sammensætning er hovedsageligt stamme-afhængige, men primært består af αβ T celler og B-celler. Adskiller sig fra de andre intestinal rum, lymfocytter bosat i epitel er hovedsageligt γδ T-celler (~ 60%) og αβ T celler med stort set ingen B-celler. Forskellige andele af αβ T celle subsets findes også inden for forskellige anatomiske steder af tarmene. Αβ T cellerne i LP er hovedsagelig CD4+ T-celler (~ 70%), mens CD8α+ T celler (~ 85%) dominerer i intraepithelial lymfocytter (IEL) rum. CD8α+ αβ T celler i LP og IEL rum express CD8αα homodimer eller CD8αβ heterodimer boer induktive site CD8α+ αβ T celler overvejende express CD8αβ heterodimer (figur 3). Fleste γδ T celler i IEL rum også udtrykke CD8α, mens γδ T celler findes i MLN manglende CD8α (figur 3). Uanset almindeligheder, sammensætningen af lymfocyt delmængder kan variere mellem mus stammer og kan blive ændret med alder eller sygdom. Som sådan bør en omhyggelig analyse af lymfocyt befolkning i tarmslimhinden ved steady-state udføres i baggrunden stamme udnyttede de eksperimentelle manipulationer.

Celle udbytte kan variere meget afhængigt af belastning og alder af mus, og eksperimentelle betingelser anvendes. Enkelt, levende celler kan tælles på en hemocytometer eller en automatiseret celle optælling maskine benytter trypan blå udstødelse. Antallet af lymfocytter er beregnet som: celle count × CD45+ celler (%) i Gate 3 × lymfocytter (%) i Gate 4 (figur 2). Ca 15 × 106 MLN lymfocytter, 5-10 × 106 PP lymfocytter, 2-5 × 106 LP lymfocytter og 3-6 × 106 IEL kan fås fra en 8 til 12 uger gamle naive C57Bl/6 eller Balb/c mus. Alternativt, flow-baseret tælle perler kan bruges til at kvantificere cellepopulationer med det forbehold, at celletab opstår under farvning processen. I sidste ende, konsistens i counting teknik skal opretholdes i laboratoriet for at sikre, at der kan foretages passende sammenligninger på tværs af eksperimenter.

I denne protokol bruges DTE behandling til at berige IEL, som efterfølges af EDTA behandling for at fjerne IEC for optimal isolering af højt beriget lymfocytter. To DTE behandlinger er tilstrækkelige til at isolere > 95% af IEL. Et meget lille antal lymfocytter kan også findes i EDTA-behandling. Disse lymfocytter ligner en blanding af IEL og LP lymfocytter (figur 4). En sammenligning af DTE behandling og kombinerede DTE-EDTA behandling at isolere IEL optrådte også. Kombinerede DTE-EDTA behandling øger IEC forurening i IEL forberedelse (figur 5) og reducerer endelige udbytte af levende immunceller efter tæthed gradient centrifugering. Tæthed gradient centrifugering anbefales at isolere lymfocytter fra de intestinale rum. Det fjerner døde celler, mange epitelceller og slim, fremme isolering af højt beriget lymfocytter og drastisk faldende flowcytometri erhvervelse gange (figur 6).

Figure 1
Figur 1 . Flowdiagram af isolation protokol. DTE, dithioerythritol. EDTA, ethylendiamintetra syre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . En flowcytometri gating strategi for lymfocyt befolkning fra tarmens væv. Enkelt celle suspensioner forberedt fra den mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder (mio.), lamina propria (LP), Peyer's patches (PP) og intraepithelial lymfocytter (IEL) rum var plettet med fixable levedygtighed farvestof (fx Live/Dead) og følgende lysstofrør-mærket antistoffer: CD45 for identifikation af hæmatopoietisk celler, CD19 for B-celler, CD3ε for T celler, T-celle receptoren (TCR) β for αβ T celler, TCRδ til γδ T celler, CD8α for CD8α+ αβ T celler og CD4 for CD4+ αβ T celler. Gate 0 viste frem scatter (FSC) - A/side scatter (SSC) - A egenskaber. Porten 1 identificeret enkelt celler. Gate 2 identificeret levende celler. Gate 3 identificeret hæmatopoietisk celler. Gate 4 identificeret lymfocytter baseret på FSC-Andersen/SSC egenskaber. Gate 5 identificeret T celler og B-celler. Gate 6 identificerede αβ T celler og γδ T celler blandt samlede T celler. Gate 7 identificeret CD8α+ og CD4+ T-celler i αβ T-celle population. Procenter (i rød skrift) inden for pseudocolor parceller svarer til hyppigheden af celler inden for den angivne port i foregående forældrenes befolkningen. Gate 0 og gate 1 vises samlede begivenheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Fænotype ofCD8α+ αβ T celler og γδ T-celler i tarmens væv. Udtryk for CD8β af CD8α+ αβ T celler og udtryk for CD8α af γδ T celler er afbildet. Procenter (i rød skrift) inden for histogrammer svarer til hyppigheden af celler, der udtrykker den angivne markør i angivet forældrenes befolkningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Sammensætningen af lymfocytter fra DTE, EDTA og collagenase behandlinger. Forældre gating strategien er den samme som i figur 2. Gate 5 identificeret T celler og B-celler. Gate 6 identificerede αβ T celler og γδ T celler blandt samlede T celler. Gate 7 identificeret CD8α+ og CD4+ T-celler i αβ T-celle population. Procenter (i rød skrift) inden for pseudocolor parceller svarer til hyppigheden af celler inden for den angivne port i foregående forældrenes befolkningen. Lymfocytter fra EDTA isolation bærer lighed med en blanding af IEL og LP lymfocytter isoleret fra DTE og collagenase behandlinger, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . En sammenligning af DTE behandling og kombinerede DTE-EDTA behandling til isolering af IEL. DTE behandling blev udført efter denne protokol. IEL blev indsamlet efter DTE behandlinger og før EDTA-behandlinger. Kombinerede DTE-EDTA behandling blev udført på samme koncentrationerne anvendes i denne protokol, men på samme tid. FSC-Andersen/SSC egenskaber, levedygtigheden og procentdelen af CD45+ hæmatopoietisk celler er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 . Virkningen af tæthed gradient centrifugering renhed af IEL og LP lymfocyt præparater. Enkelt celle suspensioner isoleret efter denne protokol blev udsat for tæthed gradient centrifugering eller analyseret ved flowcytometri direkte. FSC-Andersen/SSC egenskaber, levedygtigheden og procentdelen af CD45+ hæmatopoietisk celler er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En detaljeret protokol præsenteres til isolering af lymfocytter fra tarmens slimhinde induktiv (MLN og PP) og effektor (LP og IEL rum) websteder. Protokollen er udviklet til at skabe balance mellem input (tid) og output (rentabilitet og udbytte) til at maksimere produktiviteten og resultater. Protokollen også sikrer minimal afdelingsmæssig krydskontaminering mellem LP og IEL rum.

Flere protokoller til isolering af immunceller fra musen tyndtarmen har været udgivet3,4,5,6,7. De fleste af disse protokoller fokusere på isolering af immunceller fra LP. Den intestinale epitel er en særskilt rum fra LP, som er direkte udsat for det ydre miljø og består af en unik sammensætning af lymfocytter. De seneste tilgange har søgt en mere global analyse af immunforsvaret i tarmene ved at undersøge forskellige intestinal rum samtidigt for at forstå de unikke aspekter af immunrespons, der forekommer i disse rum og relationer mellem dem. Derfor ønskes en pålidelige protokol til isolering af immunceller fra alle disse rum. To DTE behandlinger er tilstrækkelige til at isolere > 95% af IEL og nogle IEC. EDTA mål calcium-afhængige vejkryds og er effektiv til at løsne IEC. Derfor, supernatanten fra de efterfølgende EDTA-behandlinger omfatter det meste IEC. Et meget lille antal lymfocytter kan findes i supernatanten efter EDTA behandling; men omkring 20-fold flere lymfocytter er fremstillet af DTE brøkdel. Derudover lymfocytter fra EDTA-behandling ligner blandede bestande af IEL og LP lymfocytter (figur 4), hvilket tyder på LP forurening fra villi og krypten skader. Derfor, i denne protokol, IEL er indsamlet fra DTE behandling før EDTA behandling, maksimere renhed ved at minimere cross-rum forurening. Andre protokoller bruge sekventielle dithiothreitol (DTT)-EDTA behandlinger eller kombinerede DTT-EDTA behandling til isolering af IEL5,6,7. DTT er en epimer af DTE og begge fungerer som reduktionsmiddel. I disse protokoller, DTT rapporteres kun fjerne slim og EDTA bruges til at isolere IEL. Selv om effekten af DTT og DTE ikke var direkte sammenlignes, blev IEL efter DTE eller kombinerede DTE-EDTA behandling evalueret. Ikke overraskende kombinerede DTE-EDTA behandling øger IEC forurening i IEL forberedelse (figur 5) og tilstedeværelsen af et stort antal IEC faldt IEL udbytter efter tæthed gradient centrifugering. Som EDTA kan skade nogle villi og Krypter, kombinerede DTE-EDTA behandling kan også resultere i forurening af LP lymfocytter i IEL forberedelse eller tab af LP celler fra LP isolation. Desuden, som > 95% af IEL blev isoleret fra DTE brøkdel, separat DTE og EDTA behandlinger er at foretrække. Nogle protokoller isolere lymfocytter uden brug af tæthed gradient centrifugering for at berige immunceller6. Tæthed gradient centrifugering tager ekstra tid og tab af nogle celler kan forekomme. Men det fjerner døde celler, epitelceller og slim, fører til højt beriget lymfocytter populationer (figur 6), som bidrager til at styrke påvisning af små populationer af celler og væsentligt nedsætter erhvervelse tid for flow flowcytometri. Tæthed gradient centrifugering har rapporteret for at resultere i ændrede forholdet mellem mononukleære phagocyt delmængder7; men lymfocyt delmængde sammensætning synes normale. Det er især nyttigt at udføre tæthed gradient centrifugering til isolering af IEL. Alt i alt præsenteres en fuldstændig protokol for at isolere højt beriget og optimalt levedygtige lymfocytter fra alle tarmens væv herunder LP og IEL med minimal cross-afdelingsmæssig forurening.

Betydelig tid og pleje skal tages under væv isolation skridt til at begrænse forurening mellem præparater. Ufuldstændig fjernelse af PP kan stærkt skew LP lymfocytter. ILF kan også forurene LP præparater. Men ILF kan ikke ses med det blotte øje og derfor ikke kan kirurgisk fjernes før fordøjelsen. Forskellige mus stammer har forskellige antal ILF14, som kan bidrage væsentligt til den varierende sammensætning af LP lymfocytter mellem mus stammer. Når du fjerner slim, skal du forsigtigt skubbe tarmen for at undgå at beskadige basalmembranen og LP, som kunne resultere i LP kontaminering af IEL. En angivelse af forurening er tilstedeværelsen af store mængder af B-celler i IEL forberedelse. IEL indeholder par B-celler (~ 1% eller derunder), hvorimod LPL kan have op til 60% B celler afhængigt af mus stamme. CD19 men ikke B220 bør bruges til at identificere B celler i LP og IEL rum, som intestinal T celler kan også udtrykke B22015. Desuden, mange intestinal T celler kan udtrykke traditionelle makrofag og DC markører som CD11b og CD11c, henholdsvis16. Derfor bør ordentlig dump gating strategier udnyttes til at sikre passende analyse.

Trin kan ændres for at imødekomme forskeres behov. Mekanisk fordøjelsen kan være tilstrækkeligt til PP lymfocyt isolation ved steady state eller collagenase fordøjelsen af lymfeknuder kan lette isolation af nogle delmængder af leukocytter under betændelse. Type af collagenase bruges kan have væsentlig indvirkning på celle overflade markør udtryk og levedygtighed og renhed af LP lymfocytter5,17. Tarmen kan være skåret i små stykker til collagenase fordøjelse, som kan øge celle udbytte. Men det reducerer også levedygtighed. Inkubationstiden med collagenase kan blive optimeret for at maksimere afkastet samtidig minimere celledød, fører til maksimal nyttiggørelse af levende celler. Forskellige labs bruge lidt forskellige tæthed gradienter for at isolere lymfocytter. En veletableret 44/67% tæthed gradient protokol er præsenteret her. Forskere kan teste forskellige tæthed gradienter passer bedst til deres individuelle behov. Hvis et større antal lymfocytter er ønsket, kan to små tarme kombineres til DTE behandlinger, EDTA-behandlinger og collagenase fordøjelsen. Hvis mere end to tarmene er nødvendige for behandlingen af ekstremt sjældne hændelser, så anbefales det at enkelt celle suspensioner sammenlægges, efter isolering.

Isolerede lymfocytter kan bruges til yderligere fænotypiske, funktionelle og genomisk analyse. Når du udfører flow cytometric analyse, er det yderst tilrådeligt at altid bruge en levedygtighed farvestoffer og anti-CD45 antistof at udelukke døde celler og ikke-hæmatopoietisk celler, der vil i høj grad forbedre analysen. Hvis ren lymfocyt befolkning er nødvendig, celle sortering af CD45+ celler sammen med andre markører for valg kan udføres. Panorering på anti-CD8α-belagte plader kan også bruges til at isolere ren T celler fra IEL forberedelse, som de fleste af disse T celler udtrykker CD8α. Panorering eller celle sortering er generelt kræves for kultur af IEL, som forurener epitelceller kan hæmme IEL vækst. Feeder celler som naiv splenocytes kan også føjes til fremme IEL overlevelse i kultur. Hvis foderautomater er brugt, er det vigtigt at udnytte congenically uoverensstemmende celler for at skelne mellem populationer. Bakteriel forurening er sjældent et problem i disse funktionelle korttidstest som høst medier indeholder penicillin, streptomycin og gentamycin. Desuden fjerne talrige vask trin og tæthed gradient centrifugering de fleste bakterier.

Isolation er tidskrævende og kræver en balance mellem pleje, præcision og hastighed for optimale resultater. Nok tid skal bruges for at sikre ordentlig manipulation af hvert trin samtidig minimere tid mellem mus offer og opnåelse af en enkelt cellesuspension for at maksimere cellernes levedygtighed og udbytte. Det er en hårfin balance, der er også en flaskehals for begyndere forsøger at få sammenhæng i isolere lymfocytter med høj rentabilitet og udbytte. En hel isolation processen fra mus dødshjælp til at opnå en optalte enkelt cellesuspension tager en erfaren forsker ca 8 h for 8 mus. Det anbefales at få hjælp til mere end 8 mus til at generere høje kvalitet og reproducerbare resultater. Det er vigtigt at bruge pleje, når sammenligne lymfocytter fra disse væv med lymfocytter i milten, blod eller andre lymfoide væv som de omfattende inkubationer kan føre til kunstige ændringer forbundet med isolation procedure17. Rutinemæssig sammenligninger af LP og IEL befolkninger til tilsvarende behandlede lymfoide væv vil vurdere, om markør af interesse er moduleret under lymfocyt isolation fra tarmens væv. Lignende problemer er også et stort problem, når man sammenligner RNA profiler fra tarmene med dem fra lymfoide væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

B.S.S. understøttes af NIH grant (R01 AI076457) og midler fra Stony Brook University. Z.Q. understøttes af NIH yde (K12 GM102778).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific BP310-500
L-glutamine  Sigma-aldrich G3126-100G
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Gentamicin Life Technologies 15710-072
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
RPMI 1640 Life Technologies 21870-076
Sodium bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Fetal bovine serum Life Technologies 26140-079
10x Hanks' balanced salt solution Sigma-aldrich H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol Sigma-aldrich D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
Calsium chloride hexahydrate Sigma-aldrich 21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-aldrich M2670-100G
Collagenase, Type I Life Technologies 17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)  GE Healthcare 17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer Biolegend 420301
70-µm cell strainer  Corning 352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Erlenmeyer flask  Kimble 26500R-50mL
Magnetic stirrer Thermo Fisher 50094596
Stir bar Fisher Scientific 14-512-148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
  2. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
  3. Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2001).
  4. Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19 (2012).
  5. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  6. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
  7. Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
  8. Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
  9. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
  10. Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
  11. Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
  12. Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
  13. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  14. Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
  15. Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
  16. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

Tags

Immunologi sag 132 lymfocytter tyndtarmen mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder Peyerske plaques lamina propria intraepithelial lymfocytter flowcytometri
Isolere lymfocytter fra mus Small Intestinal immunsystemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating… More

Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. J. Vis. Exp. (132), e57281, doi:10.3791/57281 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter