Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הכנה של בלוטת הרוק Submandibular מאתר מיקרוסקופ Intravital זקופה

Published: May 7, 2018 doi: 10.3791/57283
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, 1
1Theodor-Kocher Institute, University of Bern, 2Center for Infectious Diseases, Integrative Virology, University Clinic of Heidelberg
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים פרוטוקול בניתוח לחשוף ולייצב את בלוטת הרוק submandibular מאתר עבור הדמיה intravital באמצעות מיקרוסקופ intravital זקוף. פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות אחרים בלוטות אקסוקרינית של הראש, באזור הצוואר של עכברים ומכרסמים קטנים אחרים.

Abstract

בלוטת הרוק submandibular (SMG) הוא אחד של בלוטות הרוק הגדולות שלוש, הוא עניין בתחומים רבים ומגוונים של המחקר הביולוגי, כולל ביולוגיה של התא, אונקולוגיה, רפואת שיניים, אימונולוגיה. SMG היא בלוטה אקסוקרינית מורכב של תאים אפיתל הפרשה, myofibroblasts, תאי אנדותל, עצבים, מטריצה חוץ-תאית. בעבר יש כבר תמונה דינמית תהליכים תאיים החולדה, העכבר SMG, בעיקר באמצעות הפוכה מיקרוסקופים פוטונים ריבוי מערכות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול פשוטה עבור הכנה כירורגית ו ייצוב SMG מאתר בעכברים ומורדמת עבור ויוו הדמיה עם מערכות מיקרוסקופים פוטונים מרובה זקוף. אנו מציגים תמונה intravital נציג סטים של אנדוגני, הועבר adoptively פלואורסצנט תאים, כולל תיוג של כלי הדם או צינוריות הרוק ואת הדור השני הרמונית להמחיש קולגן fibrillar. לסיכום, פרוטוקול שלנו מאפשר הכנה כירורגי של בלוטות הרוק העכבר במערכות מיקרוסקופ זקוף, אשר משמשים בדרך כלל עבור הדמיה intravital בתחום של אימונולוגיה.

Introduction

הרוק הוא מופרש על ידי בלוטות אקסוקרינית לשמן מזון, להגן על משטחים הרירית של מערכת אוראלי, וכדי לספק אנזימי העיכול, כמו גם חומרים מיקרוביאלית1,2. בנוסף בלוטות הרוק קטין וביניהם ב submucosa דרך הפה, ישנם שלוש קבוצות דו צדדיים של בלוטות הגדולות מזוהות הפרוטיד, sublingual, submandibular, לפי המיקום שלהם,1,2. תאים אפיתל בצורת פירמידה, המסודרות בצורת הבקבוק שקי (acini) או demilunes זה מוקף קרום המרתף, והתאים myoepithelial מפרישים הצפק, ריריות מרכיבי הרוק1. ברווח luminal הצר acini מתנקז לתוך צינוריות intercalated, אשר התאחדו לתוך צינוריות תילומית עד שהם סוף סוף להצטרף לתוך צינור excretory1. ההדבקה excretory הראשי של SMG נקרא צינור וורטון (WD) ופותח לתוך3,sublingual caruncle4. תא אפיתל SMG מייצג ולכן מבנה מאוד arborized עם הקצה מסוף סעפת, הדומה צרור של ענבים-1,-5,-6. Interstitium SMG מורכב של כלי הדם, הלימפה בתוך רקמת חיבור7 המכיל העצבים הפאראסימפתטית8 ו מטריצה חוץ-תאית5. בלוטות הרוק רגיל של האדם ושל מכרסמים מכילות גם T תאים מקרופאגים, תאים דנדריטים9, כמו גם תאים פלזמה להפריש אימונוגלובולינים (איגה) לתוך רוק9,10. בשל תפקידיה הגיוון הרב של מחלה ובריאות, SMG הוא נושא מעניין עבור שדות רבים של המחקר הביולוגי, כולל רפואת שיניים4, אימונולוגיה11, אונקולוגיה12, פיזיולוגיה8וביולוגיה של התא 3.

הדמיה של תהליכים תאיים דינאמית ואינטראקציה הוא כלי רב עוצמה המחקר הביולוגי13,14. הפיתוח של רקמות עמוק הדמיה וחידושים inmicroscopes מבוסס על אופטיקה לא לינארית (NLO), אשר מסתמך על פיזור או קליטת פוטונים מרובים על-ידי המדגם, אפשרה לבדוק ישירות תהליכים תאיים ברקמות מורכבות13 ,15. קליטת פוטונים מרובים כרוכה משלוח של עירור סה כ האנרגיה על ידי אנרגיה נמוכה פוטונים, איזה עירור fluorophore וביתנו למישור מוקד, ובכך מאפשר חדירה רקמות עמוק ועם צמצום נזקי רעש מחוץ המוקד עירור13,15. עיקרון זה הוא מועסק על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים (מהשעה 2) ומאפשר הדמיה של דגימות פלורסנט בעומקים של עד 1 מ מ15,16. תוך זמינים מסחרית-2 בצהריים setups הפכו להיות ידידותי, אמין, האתגר העיקרי עבור הדמיה intravital היא בקפידה לחשוף ולייצב את איבר היעד ומורדמת עכברים, במיוחד עבור הדמיה של זמן לשגות סדרות. מספר שיטות לתיקון דיגיטלי הסחף לאחר קירור והקפאה כבר פורסם17,18 , לאחרונה פיתחנו "VivoFollow", מערכת תיקון אוטומטי, אשר מנטרל את רקמת איטי להיסחף בזמן אמת באמצעות הבמה הממוחשבת19. עם זאת, עדיין במצב קריטי לאיכות גבוהה הדמיה כדי למזער את רקמת תנועה, במיוחד מהר תנועות הנגרמת על ידי נשימה או פעימת לב19. הליכי הכנה וייצוב פורסמו עבור איברים מרובות, כולל חוט השדרה20, הכבד21, העור22, ריאות23, ו הלימפה24. יתר על כן, מודלים עבור עכברים בלוטת הרוק הדמיה יש כבר פיתח3,25 ומעודן יותר עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה intravital של מאתר ש-SMG למידותיו מיקרוסקופ הפוכה ההתקנה26, 27 , 28.

כאן, אנו מציגים מעשי וישימה עבור הדמיה intravital של SMG מאתר פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ לא לינארית זקוף, המשמש בדרך כלל עבור הדמיה intravital בתחום של אימונולוגיה. לשם כך, שינינו שלב הנייח מועסקים נרחב המשמש ההכנות popliteal הלימפה בבית השחי הצומת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי הוועדה הקנטונים לניסויים בבעלי חיים וניהלת בהתאם להנחיות הפדרלי.

1. עזים ומתנגד העכבר

  1. ללבוש ציוד מגן אישי, כולל חלוק וכפפות.
  2. מערבבים קטמין חריגות השירותים הווטרינריים, תמיסת מלח כדי ריכוז העבודה של 20 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל, בהתאמה. להזריק את מלאי עבודה intraperitoneally (i.p.) ב 8-10 µL/g העכבר. הנח את העכבר בחזרה לתוך הכלוב.
    הערה: פרוטוקול זה נבדקו עבור עכברים זכר ונקבה 6 - ל שבוע בן 40 עם רקע C57BL/6.
  3. להכין את הפתרון איזופרומאזין ב- 2.5 מ"ג/מ"ל, להזריק 30 µL i.p., 15 דקות אחרי הזריקה קטמין-חריגות השירותים הווטרינריים (µg 75/עכבר).
  4. לאחר 5-15 דקות, בדוק אם שיכוך כאבים והרדמה נאותה על ידי שליטה רפלקסים, למשל, רפלקס הנסיגה של כף הרגל או רפלקס המצמוץ.
  5. לשלוט על רפלקסים כ 30 דקות במהלך לכל אורך הניסוי. Subcutaneously להזריק קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים רפלקסים µL 1.5/g העכבר, כל 60 דקות או מוקדם יותר אם הם חיוביים.
    הערה: אין אפשרות להשתמש באינהלציה הרדמה כגון איזופלוריין עם פרוטוקול זה, בשל הקיבעון של העכבר.

2. להסיר את הפרווה של אזור ההפעלה

  1. השתמש מכונת גילוח חשמלית לגלח אזור שמרחיבה בערך של 5 מ מ סימטרית של הפה כלפי כאשר רגליו הקדמיות, המשתרע על פני הלסתות כלפי בשתי האוזניים.
  2. להחיל קרם להסרת שיער באזור מגולח באמצעות מקלון צמר גפן. בזהירות וביסודיות להסיר לאחר 3 דקות, למשלעל ידי ניגוב עם במטלית לחה.

3. לתקן את העכבר על הבמה

הערה: פרוטוקול זה משתמשת במה אישית (איור 1) מצויד שני בעלי מתכוונן באופן חופשי עבור שער גולשת (אחד מחובר את הבמה עם בורג, והשני קבוע לצמיתות על זה); ברים האוזן סטיאוטטי מתכווננת; מחרוזת, אשר ניתן לתגבר את בורג; מתכת מתכוונן באופן חופשי חימום הטבעת; אזור מוגבה הייעודיים כדי למקם את הגוף של העכבר. בשלב זה הוא שונה מן הבמה popliteal הלימפה בבית השחי הצומת, ועם של מחזיק סטיאוטטי נוספה תמיכה עבור תגית המכסה התחתון מחזיק את SMG יהיו exteriorized. תוכניות מפורטות או ציטוטים של הבמה הינם זמינים על פי בקשה.

  1. להכין את הבמה על-ידי הסרת את מחזיקי הטבעת חימום, המחזיק slip כיסוי נשלף. שחרר את הברגים של בעלי אוזן בר, בעל קבוע כיסוי slip. סרט חתיכת גזה לאזור מרכז הבמה, הגשה מצעים על העכבר.
  2. להשתמש בדבק (ראה טבלה של חומרים) כדי לצרף זכוכית מכסה בקוטר 20 מ מ העליון של בעל מתכת גלילי (זה יהיה הזכוכית המכסה התחתון). דבק זכוכית מכסה 25 מ מ לחלק התחתון של המחזיק המתכת השטוחים (זה יהיה הזכוכית המכסה העליון). ודא כי המשקפיים כיסוי חופפים כ 2-3 מ מ עם מחזיקי מתכת כי שאר הזכוכית נשאר ללא גריז ודבק.
  3. הנח את העכבר על גבו אל הגזה, בניצב החוט נמתח, עם הראש בין הסורגים האוזן.
  4. לתקן את הגפיים העליונות של העכבר לבמה עם הדבקה.
  5. בשלב הבא, לחבר את החוט אל החותכות הקדמי העליון והדק עד הלסת מגיע במיקום אופקי. להשתמש מלקחיים מעוקל בזווית למשוך מעט את הלשון מהפה, אשר מקל על הנשימה.
  6. בחוזקה, אך לא בכוח, משוך את הזנב, להקליט אותה על הבמה.
  7. יישר את הסורגים האוזן כדי להשיג זווית של 30 מעלות בין שורת לבין קצה הבמה. כדי להבטיח את הזווית, להשתמש סרגל משולש לצייר זווית 30 מעלות ימינה ושמאלה על גיליון נייר, ולמקם על הבמה שקוף על הנייר כדי ליישר את מחזיקי בהתאם.
  8. לתקן את הלסת בין הסורגים אוזן על-ידי בו זמנית הזזת הסרגל ימינה ושמאלה פנימה עד הלסת הוא immotile, ולהדק את הברגים. להתבונן תנועת החזה לפני, במהלך, ואחרי תיקון הלסת. מופחת או נעדר נשימה מציין כי הסורגים קבועות על הצוואר, לא עצם הלסת; במקרה זה, חזור על הליך תיקון מיידי.
  9. מספקים חימום העכבר, למשל, על ידי הצבת מנורה חימום בקרבת מקום ו/או כרית חימום מתחת לבמה.

4. ניתוח החשיפה של בלוטת הרוק באמצעות Stereomicroscope

הערה: השלבים הבאים מחייבים השימוש של stereomicroscope, מלקחיים בסדר ומספריים כירורגיים. מאז ההליך הוא מסוף, זה לא הכרחי לשמור על הפעלה בתנאים סטריליים. אתנול-ניקיתי כלי נגינה מספיק.

  1. אתר את המיקום המשוער של האונה הימנית SMG מאת מחפש בליטה קלה של העור כ 15 מ מ סימטרית של הפה, 5 מ מ המדיאלי של קו הלסת. הרם קיפול העור קטנה במרכז הבליטה, לחתוך אותה כדי ליצור פתיחה של 5 מ מ אורך.
  2. מיד החל טבעת 4 מ מגבוהה של ואקום גריז על העור שמסביב החתך. (השתמש מזרק ואקום מלא גריז עם מחט תת-עורית קהות של 25 גרם).
  3. למלא את הטבעת גריז עם תמיסת מלח כדי להבטיח שהרקמה יישאר לח במהלך המבצע.
  4. תחת stereomicroscope, לשבש את רקמת החיבור באמצעות ההליך הבא: להשתמש מלקחיים בסדר אחד לאחוז בחוזקה חתיכה של רקמת חיבור מחובר ישירות SMG ולהשתמש עם מלקחיים השנייה למשוך רקמת חיבור דיסטלי עד זה ציסטות נקרעות. להבטיח כי כמה רקמת נשאר קשור SMG; זה רצוי שכן הוא מאפשר טיפול. אל תגעו בלוטת עצמה עם המלקחיים, מאז זה לגרום לדימום.
  5. התהליך של שיבוש רקמת חיבור קודם על גבי בלוטת ולאחר מכן בצד המדיאלי (בין האונה מימין ומשמאל של SMG). אל תפריד את sublingual מבלוטת נקראות.
  6. להמשיך להסיר את רקמת חיבור לרוחב נגד כיוון השעון מסביב SMG (המדיאלי כדי סימטרית, כדי הדיסטלי, כדי rostral).
  7. ודא כי אספקת הדם efferent lymphatics, צינור הרוק, אשר ממוקמים בצרור באתר הגולגולת של בלוטת, הם לא נקרע.
  8. לאחר רקמת חיבור לרוחב מופרת, להשתמש מלקחיים למשוך מצורף לסוף סימטרית SMG כלפי מעלה כדי להרים את הסוף סימטרית של SMG רקמת החיבור. לשבש את רקמת החיבור שמתחת האונה SMG, החל סימטרית ונעה לקראת הסוף rostral.
  9. המשך עד רקמת החיבור לכל האתרים של SMG מוסר (למעט אתר rostral עם כלי הדם האכלה/ניקוז, של WD).

5. תיקון בלוטת

  1. לאשר הטבעת גריז מחזיק את תמיסת המלח הוא לפחות 4 מ מ גבוה ולא דולף (ראה שלב 4.2).
  2. התקנת השער התחתון זכוכית (ראה שלב 3.2) על-ידי הצמדת סרגל מתכת ומתכתי גובהו. ודא בעל מכסה מותאם למיקום upmost אינו נוגע את הטבעת גריז כאשר מצורף אל הבמה. הצב בעל מהכיוון סימטרית בזווית של 60° העכבר, עם כיסוי בתגית מכסה בערך שני שליש (חלקים סימטרית ו דיסטלי) של האונה חשוף. הורידו את הזכוכית המכסה עד שהוא יוצר קשר עם בלוטת.
  3. השלם את המעגל גריז על גבי הזכוכית המכסה כדי ליצור מאגר מלוחים חדש
  4. משוך בזהירות את האונה SMG מעל תגית כיסוי עם מלקחיים, רק לגעת רקמת החיבור מצורף (איבר המין יכול להיות הפוך עם האתר התחתון כלפי מעלה).
  5. ודא הטבעת גריז יש גובה ואפילו לפחות 4 מ מ אינה דולפת. במידת הצורך, מילוי המאגר מלוחים באמצעות 30 G מזרק מלא מי מלח.
  6. ודא כי בעל כיסוי זכוכית עבור הזכוכית המכסה העליון במקומו upmost. השתמש את הבורג כדי לחבר המחזיק מתכת עם הזכוכית המכסה העליון של 25 מ מ עם בעלי. השתמש את הברגים מתכוונן של בעל כדי למקם את מכסה הזכוכית כך SMG ממורכזת באמצע.
  7. השתמש את הברגים של מאחז מתכוונן להנמיך את הזכוכית המכסה העליון עד זה קשר ישירות את SMG. לבחון את הצורה ואת צביעה של בלוטת במהלך שלב זה. אם בלוטת שטח מופיע גדולים יותר, או צביעה משתנה (למשל מורוד-לבן), מיד לשים את מכסה הזכוכית למיקום גבוה יותר כדי להקל על הלחץ SMG.
  8. בדוק את האגם מלוחים לאיתור נזילות על ידי מחפש בועות אוויר, או טיפות של תמיסת מלח מחוץ המאגר. אם זוהתה בועה דליפה או באוויר, הסרת שער גולשת וכל משמנים והפעל מ שלב 2.
  9. בורג סגור כל הברגים קיבעון.

6. תיקון כביש הטבעת חימום של רגש טמפרטורה

  1. להוסיף בדיקה טמפרטורה לתוך המאגר, מקם אותה קרוב בלוטת, לאחר מכן להקליט את החוט בדיקה על הבמה.
  2. חלות טבעת גריז הרכב המכסה העליון, עם SMG במרכז (הקוטר של גריז. הטבעת צריכה להתאים את קוטר טבעת חימום). מקם את טבעת חימום מעל תגית כיסוי, חותם עם גריז. להקליט את הצנרת של טבעת חימום על הבמה.

7. הדמיה

הערה: אנו משתמשים מערכת מיקרוסקופ שני הפוטונים זקוף מצוידים לייזר Ti:Sa tunable, מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מים-טבילה 20 X או 25 X יעדים. ניתן ליישם תיקון בזמן אמת של רקמות להיסחף במהלך הרכישה באמצעות על הבמה אוטומטיות ו- VivoFollow19. זה משפר את היציבות של ייבוא תמונות, אך אינו נדרש.

  1. הפעל את המערכת מיקרוסקופ זקוף באמצעות תוכנה מתאימה המסופקים על ידי היצרן מיקרוסקופ. מנגינה הלייזר Ti:Sa עירור 780-900 ננומטר אורך גל.
  2. להתחבר לאורך צינור חימום הטבעת חימום. משאבה סחרור מים מסחררת מים חמים (מחומם על ידי השוקע חלק הצנרת באמבט מים 80° C) דרך טבעת כדי לחמם את SMG.
  3. לחבר את המכשיר טמפרטורה מד חום דיגיטלי. כוון את מהירות משאבת סחרור, אם הטמפרטורה היא לא בין 35-39 מעלות צלזיוס. מהר יותר המשאבה עובדת, חם מקבל האובייקט, ולהיפך.
  4. לפני תחילת ייבוא תמונות, לבצע פקד ויזואלי בין המהירויות זרימת דם. בדוק ליקוציט המעבר דרך הנימים דק או בזריקה לתוספי פלורסנט.
    הערה: לתוספי פלורסנט מוזרק לווריד מיד ימלאו את להערכת SMG כולו כאשר זרימת הדם הוא פיזיולוגי. . זה כמעט תמיד במקרה של הליך זה.
  5. כדי לעקוב אחר תאים חיסוניים, עומק הדמיה הוא בדרך כלל בין 20-150 מיקרומטר מתחת לפני השטח של SMG המזוהה על-ידי האות הרמונית דור 2nd . אוספי תמונות שיא של 150-300 מיקרומטר שדה ראייה עם פיקסל ברזולוציה של 512 x 512 ומעלה, z-בעומק של 20-60 מיקרומטר עם מרווח של 2-4 מיקרומטר בין תמונות. חזור על רכישת המחסנית s כל 20-30 עבור משך סך של 20-60 דקות.
  6. השתמש את המדחום הדיגיטלי כדי לשלוט רמות מינימום ומקסימום טמפרטורה לאחר רכישה של רצף תמונות אחד. לבטל את רצף תמונות אם מינימום או מקסימום אינם בטווח של 37 ± 2 ° C. למלא מים כדי ליהנות מחוויה חושית המטרה בין רצפי תמונות.
  7. בסוף המפגש הדמיה, המתת חסד העכברים בעזרת2 CO תחת הרדמה.
    שימו לב: זאת בהתאם להנחיות הפדרלי השוויצרי של ניסויים בבעלי חיים; הנחיות המתת חסד אחרים עשויים לחול במקום אחר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של כמעט כל הגבי או הגחון הצד של SMG. שדה הראייה בדרך כלל כולל גם את בלוטת הרוק sublingual, שונה במקצת SMG קומפוזיציה הסלולר4. שתי בלוטות כמוס על ידי קולגן fibrillar, מחולק אונות. רוב השעות 14:00 מערכות יכול לייצר תמונה ללא תווית של קולגן fibrillar על ידי מדידת האות הרמונית 2nd , אך בדרך כלל מולקולות פלורסנט נחוצות עבור ויזואליזציה של מבנים הסלולר subcellular. למשל, הביטוי הטרנסגניים בכל מקום של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בשילוב עם האות הרמונית 2nd מספיקה לזהות acini צינוריות, במערכת SMG הדם על-ידי תכונות מורפולוגיות שלהם. תוכנית התקנה זו ניתן להתבונן הטרנסגניים סמני פלורסנט עם תא סוג ביטוי ספציפי כדי לזהות תאים מסוים קבוצות משנה. איור 2 מציג את רשת ofCOL1A1-GFP לבטא כתב פיברובלסט כמו תאים של רקמת חיבור. גם מוצגות כלי דם, תווית באמצעות ורידיות הפלורסנט מצמידים לתוספי משקל מולקולרי גבוה. תא luminal של הצינורות יכול גם להיקרא (איור 3) כאשר לצבוע מוזרק retrogradually WD29.

Figure 1
איור 1 : אישית שלב. (ו- a *) שני מחזיקי מתכוונן באופן חופשי שער גולשת; ברים האוזן סטיאוטטי מתכווננת (b ו b *); (ג) של מחרוזת, אשר ניתן לתגבר את בורג; (ד) מתכת מתכוונן באופן חופשי חימום הטבעת; (ה) העלה המיועדים למקם את הגוף של העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : להערכת סמן (אדום) ורשת של COL1A1-GFP לביטוי תאים (ירוק). להערכת המתויגים באמצעות ורידיות טקסס אדום-לתוספי המספר המשלים (MW 70 kDa). קולגן fibrillar בין שתי האונות הוא מדמיין כמו האות הרמונית 2nd (כחול). המוצג הוא z יחיד-תחזית של 15 תמונות מוערמות עם 47 עומק מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 40 µm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : Luminal צינור הנקרא לאחר ההזרקה WD- כלי הדם עם 70 kDa-MW טקסס אדום-לתוספי (אדום), צינור לומן תוויות בתווית עם מפל כחול-לתוספי (לבן; 10 kDa MW) באמצעות הזרקת רטרוגרדית דרך WD GFP הועבר adoptively+ CD8+ T תאים (ירוק) SMG. מוצג. זאת יחידה z-ההקרנה של 27 תמונות מוערמות עם 50 עומק מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 40 µm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מציעה גישה ישירה עבור ויוו הדמיה של מאתר בלוטות הרוק submandibular, sublingual באמצעות מיקרוסקופ ליניארי זקוף משמש לעתים קרובות בתחום אימונולוגיה. השיטה ניתן להתאים עבור ההדמיה בלוטות אקסוקרינית אחרות באזור הראש והצוואר. למשל, המעבדה שלנו ביצע הדמיה של בלוטת הדמעות באופן מקביל (לא מוצג).

הסרת רקמת החיבור מסביב SMG הוא השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה, שכן נזק לרקמות מקרי יכול להתרחש. נזק אספקת הדם הראשי SMG מחייבת פיטורים מידיים של הניסוי, מאז הרקמה SMG יהפוך ובשפתיים. אם הרקמה SMG עצמו פגום, הדימום בדרך כלל עוצר באופן טבעי על ידי קרישת הדם. עם זאת, זה צריך לקחת בחשבון כי הפגיעה מפעיל דלקת סטרילית ושחרור ציטוקינים proinflammatory30, אשר עשויה להשפיע על מדידה ניסיוני. סיבוך נפוץ יותר, אבל פחות קריטי במהלך תיאום הן נזילות במאגר המים מלוחים. כדי למזער את המופע של דליפות, תמיד למרוח משחה לעור יבש, שיער. תיקון נזילה היא בדרך כלל חסרת טעם: במקום, להסיר את כל השומן, לנקות את העור עם ספוגית כותנה יבשה, ולהחיל מחדש מאפס.

במהלך דימות, טמפרטורה קרוב טמפרטורת הגוף פיזיולוגיים חייבת להישמר (כ 37 מעלות צלזיוס על זכר ונקבה C567BL/6 עכברים31). מאז גם היפו - וגם היפרתרמיה תשנה את הדם לזרום32,33, תפקיד פיזיולוגי של SMG לא יכולה להניח, בתנאים כאלה. עם זאת, הבחנו אין הבדל זרימת הדם או תא T תנועתיות במהלך קטן (± 2 ° C), ארעי (< 5 דקות) לחריגות טמפרטורה אופטימלית.

צמצום התנועה רקמה חיונית עבור איכות הדמיה טובה. סוגים שונים של רקמות לא רצויות תנועה יכול להתרחש, אומרת כי ניתן לעבור לפתרון בעיות. ראשית, רציפה xyz-להיסחף נגרמת בדרך כלל SMG נסחף לאט בחזרה למיקומו המקורי דרך רקמת חיבור המצורפת. זה קורה אם הזכוכית המכסה התחתון הותקן גבוה מדי, או רקמת החיבור מסביב SMG לא הופרעו ביסודיות. שנית, z-להיסחף איטי ומתמשך עלולה להתרחש אם הטמפרטורה יציב. במקרה זה בקפידה להתאים את החימום ולחכות הטמפרטורה יציב, כ- 15 דקות לפני הדמיה. לבסוף, רקמה פועמת תנועה מתרחשת כאשר תא מלוחים לא אטומה בחוזקה. הלחץ מצטבר ומשחרר בבית הבליעה מלוחים עם כל מחזור הנשימה. בשילוב עם דליפות או בועות אוויר זה מוביל פועמת זורם נוזל, אשר תרגם ישירות אל הרקמה SMG. במקרה זה, ההרכבה מחדש של משקפיים הכיסוי והן מלוחים קאמרית היא הפתרון הכי אמין.

מהמקסימום הדמיה עומק תלוי אורך הגל עירור המשמש את fluorophores מועסק. כמו כמעט כל הכיוונונים הדמיה intravital, צבעי אדום-העביר או פלורסנט חלבונים יכולים להתרגש עם אורכי גל ארוכים (900-1100 ננומטר) מאפשרים רקמות עמוק הדמיה מאשר צבעי ירוק, עירור קצר אורכי גל.

SMG שימש מודל איברים עבור אנדו - אקסוציטוזה ואת קרום שיפוץ27,3,28, זיהום34, מחלת חיסון עצמי11, הגידול ביולוגיה12. היא מתירה עוד צורות רבות של מניפולציה: צבעי, תרכובות תרופתי ו נוגדנים יכול להיות מועברת בלוטת דרך זרם הדם. לחלופין, ניתן לפלח את SMG ישירות באמצעות תעלות של WD, אשר שימש להעברת וירוסים11, dextrans3, דנ א25, צבעי29או סוכנים תרופתי3.

השדה הדמיה intravital ממשיכה להרוויח מארגז ההולכת וגוברת של פלורסנט גנטי וביוכימי תיוג טכניקות. ההתקדמות בהנדסה גנטית לספק קווים העכבר שורות תאים עם סמנים פלורסנט מתוחכמים. הדוגמאות האחרונות כוללות תיוג של קבוצות תאים מסוים משנה (CD11c+ תאים35) או חלבונים cytoskeletal דינמי (Lifeact36), photoconvertible סמנים עבור מעקב אחר 37, כתבים בזמן אמת של גרעיני תא טרנסלוקציה (NFAT38) או סידן איתות39. יישומים אחרים עשויים להשתמש פלורסנט הגששים הביוכימי, המבליטים תאים subcellular ספציפיים (כגון ה-DNA מחייב 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) או צבעי ממברנה lipophilic). מיקרוסקופ NLO מודרני מציע פתרונות אפשריים רבים לענות בצורה הטובה ביותר את השאלות ניסיוני. למשל, מרובבת שני הפוטונים הדמיה פותחה חריפה להגביר מהירות הרכישה המרבי40. טכניקות אחרות מציעות הדמיה ללא תווית multiphoton, על-ידי ייצור השני או השלישי הרמונית אותות15, או על ידי מדידת רטט תהודה אופייני של מולקולות (ראמאן נגד סטוקס קוהרנטי פיזור)41. לכן, כאשר מעשית נהלי רקמות חשיפה וייצוב זמינים, הגבולות של הנבחנים בעיקר נקבעים על-ידי משאבים ויצירתיות של הנסיין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו מומן על ידי הקרן הלאומית השוויצרית (SNF) פרויקט גרנט 31003A_135649, 31003A_153457, 31003A_172994 (ל JVS), מלגת Leopoldina LPDS 2011-16 (כדי BS). עבודה זו כמיותרים setups אופטי של "מיקרוסקופ הדמיה מרכז" (MIC) באוניברסיטת ברן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
  2. Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
  3. Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).
  4. Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).
  5. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
  6. Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).
  7. Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).
  9. Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).
  10. Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).
  11. Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).
  12. Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).
  13. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  14. Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  15. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  16. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).
  17. Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
  18. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
  20. Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
  21. Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
  22. Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
  23. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).
  24. Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
  25. Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).
  26. Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
  27. Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).
  28. Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).
  29. Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
  30. Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).
  31. McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).
  32. Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38 (2), Accessed November 21, 2017 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069 588-595 (2010).
  33. Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. , 1-13 (2017).
  34. Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).
  35. Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).
  36. Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).
  37. Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).
  38. Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).
  39. Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  40. Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).
  41. Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 135 Intravital הדמיה עכבר דגם מיקרוסקופ multiphoton בלוטות רוק ניתוח של תגובות מערכת החיסון מסתגלת אימונולוגיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B.,… More

Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter