Summary
Denne metode giver mulighed for generation af tetraploide og triploid Caenorhabditis nematoder fra enhver diploide stamme. Polyploide stammer, der er genereret af denne metode har været brugt til at studere kromosom vekselvirkninger i meiotiske prophase, og denne metode er nyttig til at undersøge vigtige grundlæggende spørgsmål i celle, udviklingsmæssige, evolutionær, og kræft biologi.
Abstract
Mekanismer, der indebærer samlede genom polyploidi spiller en vigtig rolle i udvikling og evolution; også, en unormal generation af tetraploide celler har været forbundet med både progression af kræft og udviklingen af resistens over for lægemidler. Indtil nu har det ikke været muligt at nemt manipulere Ploidi hos en flercellede dyr uden at generere det meste sterile afkom. Præsenteres her er en enkel og hurtig protokol til at generere tetraploide Caenorhabditis elegans dyr fra enhver diploide stamme. Denne metode gør det muligt for brugeren at oprette en bias i kromosom segregation under meiose, i sidste ende øge Ploidi i C. elegans. Denne strategi bygger på en forbigående reduktion af udtryk af rec-8 for at generere diploide kønsceller. En rec-8 mutant producerer diploide kønsceller, der potentielt kan producere tetraploids efter befrugtning. Denne tractable ordningen har været anvendt til at generere tetraploide stammer bærer mutationer og kromosom rearrangementer at få indsigt i kromosomale dynamics og interaktioner under parring og synapsis i meiose. Denne metode er effektiv til at generere stabile tetraploide stammer uden genetiske markører, kan anvendes på enhver diploide stamme og kan bruges til at udlede triploid C. elegans. Denne enkle metode er nyttig for at undersøge andre grundlæggende biologiske spørgsmål relevant for genom ustabilitet gen dosering, biologiske skalering, ekstracellulære signalering, tilpasning til stress, udvikling af resistens over for lægemidler, og mekanismer for artsdannelse.
Introduction
Samlede genom polyploidi findes overalt i naturen og er ofte et nødvendigt skridt i tilpasning, artsdannelse, organogenesis, sårheling og biologiske skalering; Det er også kendt for at fremme både kræft og resistens over for lægemidler1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. landbrugs- og fiskeriprodukter industrier generere polyploide planter, fisk og skaldyr af kemisk behandling (f.eks., colchicin og orzalin) til at opnå hurtigere vækstrater og bulkier afgrøder og husdyr13, 14,15. Eksperimenterende og ineffektiv produktion af tetraploids findes for mus og zebrafisk model systemer16,17. Dog er de fleste eller alle polyploide flercellede dyr genereret embryonically dødelige eller sterilt og dermed ikke ideel til laboratorieundersøgelser af virkningerne af polyploidi i en flercellet organisme. Derfor, enhver forståelse af hele genom polyploidization i flercellede organismer har været begrænset til nærtbeslægtede arter fra evolutionære nylige polyploidization begivenheder18,19,20 . En sti til at fremme forespørgsler af den biologiske rolle eller konsekvenserne af polyploidization er brugen af C. elegans modelsystem. Vigtigere, C. elegans er en tractable genetiske system, der normalt findes som en diploid, indeholder kun fem autosome (A) og en sex kromosom (X) pr. genom, er gennemsigtig giver mulighed for i vivo observation af biologiske processer og har en kort levetid på 3-4 dage (fra æg til seksuelt modne voksne). C. elegans har vist sig at være i stand til at reproducere som en tetraploide, som er den mest almindelige type af hele genom polyploidi i naturen. Triploid dyr kan genereres ved at krydse tetraploids med diploids, men deres Ploidi er ikke stabil, og stammer blive diploide inden for et par generationer.
I de sidste par årtier kun en håndfuld af levedygtige og frugtbare C. elegans tetraploids stammer var isoleret i laboratoriet, ved hjælp af en strategi, der er besværlige og genererer kun begrænset typer stammer21,22,, 23. denne strategi genererer C. elegans tetraploids af varme-chok behandlinger, som formentlig påvirker kromosom adskillelse i gameter, efterfulgt af en screening for formodede polyploide dyr ved hjælp af genetiske markører. Disse tetraploids var yderst nyttigt i undersøgelsen af hvordan denne nematode bestemmer, om at blive mandlige eller hermafrodit. Senere undersøgelser brugt de tilgængelige stammer til at undersøge vækst, gen dosis og regulering af synapsis under meiose i denne nematodeprøveudtagning21,24,25,26. Desværre, disse studier var begrænset af vanskeligheden i at generere nye tetraploide stammer og baggrunden genetiske markører disse stammer indeholdt. Vist her er en enkel og hurtig protokol til at generere stabile tetraploids, som er blevet brugt til at generere stammer for at studere regulering af synapsis under meiose27.
Som i naturen, kan der opstå polyploidization af dannelsen af diploid i stedet for haploide kønsceller. Vores konklusion, at en meiose-specifikke cohesin komponent mutant rec-8 genererer diploide sperm og oocyter oplyste, at banke ned rec-8 gen ville resultere i produktionen af tetraploide afkom (figur 1)27, 28,29. Generere tetraploide stammer blot indebærer banke ned rec-8 af RNA-interferens (RNAi) for to generationer for at phenocopy rec-8 mutant diploide kønsceller. Formodede polyploids let kan identificeres ved deres længere end normal kropsstørrelse. Polyploids er bekræftet som hel eller delvis tetraploids ved at tælle antallet af kromosomer per kerne, når stabil linjer er etableret.
Den strategi, der er beskrevet her gør det muligt for generation af stabil tetraploide Caenorhabditis ødelægge stammer fra indledende diploide genetiske baggrund eller karyotype uden brug af genetiske markører. Da denne protokol er mere effektive, alsidige og enkle end ordningen for tidligere brugt, vil det udvide de nødvendige værktøjer til forespørgsel polyploidization i fundamentale processer til udvikling, genom stabilitet og udviklingen i flercellede roller organismer. Kun overskuelig begrænsning i anvendelsen af denne protokol er i genetiske baggrunde resistente over for RNAi.
Protocol
1. indstilling op rec-8 RNAi (dag 1-3 i figur 2)
Denne protokol er ændret fra Kamath og Ahringer30.
- Til induktion af rec-8 dsRNA udtryk i Escherichia coli, forberede Nematode vækst Medium (NGM) agar plader31 suppleret med en endelig koncentration på 1 mM isopropyl-β-D-2-thiogalactopyranoside (IPTG) og 100 µg/mL ampicillin. Opbevares i mørke ved 4 ° C indtil brug, op til 4 uger.
- Stribe HT115 bakterier transporterer rec-8 (W02A2.6) klon fra Ahringer laboratorium bibliotek30 rec-8 klon på Luria bouillon (LB) plader suppleret med 100 µg/mL ampicillin og 50 µg/mL tetracyclin. Vokse natten over i en shaker ved 37 ° C.
- På dag 1, podes enkelt kolonier fra de frisk stribede enkelt kolonier af HT115 E. coli bakterier transporterer rec-8 RNAi klon i 4 mL LB indeholdende 100 µg/mL ampicillin og 50 µg/mL tetracyclin. Vokse bakterier kultur natten over i en shaker eller en roller tromle ved 37 ° C.
- Den næste morgen (dag 2), fremkalde produktion af dobbelt strenget (ds) RNA til rec-8 W02A2.6 i den HT115 bakterie kultur ved at tilføje en endelig koncentration på 1 mM IPTG og ryster i 40 min ved 37 ° C.
- Efter induktion, frø NGM/IPTG plader med 100-200 µL af HT115 rec-8 bakterier og gemme plader ved stuetemperatur i den mørke overnatning (dag 3).
- Den næste morgen (dag 4), tilføje den ønskede ødelægge stamme at induceret HT115 rec-8 bakterier plader som beskrevet i trin 2.1 nedenfor.
2. generering og isolere Tetraploids (dag 4-16 i figur 2)
- Dag 4, placere 3-4 unge L4 (fjerde larver) fase hermafroditter den ønskede diploide pres på NMG/IPTG plader seedede med HT115 rec-8 bakterier, der havde været induceret dagen før (trin 1,5, ovenfor). Vokse nematoder ved 15 ° C i mørke.
- Gentag trin 1.3 og 1.4 starter 3 dage efter trin 2.1, som vil være tre dage før de første afkom (F1s) fra dette trin bliver L4s. Timingen af dette trin vil afhænge af hvor hurtigt en nematodeprøveudtagning stamme vokser på 15 ° C. Nogle diploide mutantstammen er langsom avlere, og denne timing vil savn fine tuning for at isolere tetraploids.
- På dag 8 (efter 4 dage i rec-8 RNAi fodring behandling), overføre 20 (2 hermafroditter/petriskål) i F1 (første filial generation) L4 hermafroditter dyrkes i HT115 rec-8 bakterier på frisk induceret HT115 rec-8 RNAi og tillade dem til self-fertilize.
- Alternativt, overførsel 20 af F1 L4 hermafroditter dyrkes i HT115 rec-8 bakterier på frisk induceret HT115 rec-8 RNAi bakterier sammen med ubehandlet hanner af samme stamme (2 hermafroditter med 4-6 hanner/plade).
- På dag 13, start screening for F2 (anden filial generation) afkom, der vises lange (Lon) eller generelt større end vildtype; derefter overføre enkelte Lon dyr på regelmæssig OP50 eller HB101 stammer af E. coli bakterier. Fortsat screening F3 (tredje filial) afkom; men F3 afkom fra den samme plade kan ikke betragtes som uafhængige stammer, hvis de bliver etableret, fordi de kunne være søskende fra samme etablerede allerede F2 mor.
Bemærk: Formodede tetraploids identificeres nemt, fordi de er tydeligt længere end diploids. Vildtype hermafroditter er to tredjedele kortere end tetraploids. Fordi den er længere, gør en tetraploide krop en ekstra tur som det bevæger sig fremad ved at generere sinusformet krop-bøjning bølger fra hoved til hale (figur 3A). - Tillad Lon orme til self-fertilize og udbrede ved picking Lon afkom indtil kun Lon afkom er far i mangel af rec-8 RNAi behandling. Dette kan tage to til tre ekstra generationer. Lon orme ofte er steril og give ikke afkom.
3. kontrollere tetraploide stammer (film 1 og figur 3A, B)
Bemærk: Tetraploide stammer kan valideres ved at tælle antallet af kromosomer i deres ubefrugtede oocyter. Fluorescerende mikroskopi kan bruges til at screene for antallet af kromosom-par i ugoedet diploide oocyter (før meiotiske divisioner), hvis stammen har en fluorescerende markør for kromosomer. I mangel af fluorescerende kromosom markører, kan tetraploide nematoder screenes ved fastsættelse af nematoder og farvning med et DNA farvestof; Se nedenfor for en protokol for ethanol fastsættelse og hele dyr 4′, 6-Diamidine-2 '-phenylindole dihydrochlorid (DAPI) farvning.
- Hele dyr DAPI farvning
Bemærk: Tetraploide stammer transporterer 12 tilsluttede kromosom par kan valideres af DAPI farvning disse dyr og tælle antallet af DAPI organer i sin ubefrugtede oocyter.- Sted 5 til 10 µL af M9 buffer31 på et objektglas, derefter overføre 6-10 nematoder til drop.
- Under et dissekere mikroskop, trække de fleste af M9 på rullelisten uden at fjerne nematoder med en fnugfri rense væv. Derefter straks tilføje en 10 µL drop 90% ethanol på orme. Tillad orme til at tørre helt, men til længere end et par sekunder.
- Så snart ethanolen fordamper (dette kan ses som det sker under dissekere mikroskop), tilføje en ekstra 10 µL af 90% ethanol på orme.
- Gentag trin 3.1.3 tre flere gange.
- Når den sidste dråbe af ethanol er fordampet, tilsættes 6 µL af DAPI eller Hoechst farvning på anbefalede endelige koncentration i montering medier valg (for eksempel en 1:1,000 fortynding af en 2 ng/µL DAPI stock koncentration i M9). For langtidsopbevaring af diasene, kan der anvendes 0,5% p-phenylendiamin opløst i 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, i 90% glycerol som en antifade løsning, i stedet for M9 kun.
- Dække orme på dias med en coverslip og forsegle kanterne af coverslip med neglelak. Score i et fluorescens mikroskop (trin 3.1.7) mindst 10 min. efter tilsætning af coverslip. Dias uden antifade kan opbevares i et par dage ved 4 ° C før scoring, men kvaliteten af fluorescens begynder at falde efter et par dage.
- Ved hjælp af et mikroskop for fluorescerende på 100 X forstørrelse, score antallet af enkelt DAPI organer (formentlig enkelt kromosom par) i de mest modne ugoedet oocyt, som umiddelbart støder op til spermatheca og endnu ikke er trådt i spermatheca eller livmoderen.
- For at score enkelte DAPI organer inden for en oocyt kerne, skal du bruge mikroskopets fine fokus at bevæge sig langsomt fra toppen af oocyt kernen til bunden ved optællingen. Derefter fortælle den samme kerne mens du flytter fokus i den modsatte retning (dvs.fra bunden til toppen af kernen) at bekræfte det optalte antal DAPI organer.
- Score de mest modne ugoedet oocyt i hver af de to gonaderne i mindst ti hermafroditter pr. stabil Lon stamme. Vildtype oocyter har 6 DAPI organer på gennemsnittet, 5 autosome par og sex kromosom pair. Tilstedeværelsen af 12 DAPI organer i oocyt stabil Lon stammer angiver, at dyrene i denne stamme er enten delvis (4 sæt af autosome, 3 X-chromosomes) eller komplet (4 sæt af autosome, 4 X-chromosomes) tetraploids.
- Beregne det gennemsnitlige antal DAPI organisationer observeret fra flere (mindst 10) oocyter pr. stamme. Nogle kromosom par vil være rørende eller lige på toppen af hinanden, så antallet af DAPI organer i en oocyt er ofte mindre end det faktiske antal kromosom-par.
- (Valgfrit) Yderligere validere stabil Lon stammer hvor det gennemsnitlige antal DAPI organer er 12 at teste, om de er fuld (4A, 4 X) eller delvis (4A, 3 X) tetraploids ved immunfluorescens farvning mod kromosom akse proteiner som HTP-332. Denne farvning vil skelne kromosom par ved at vise en korsformet mønster fra enkelt usammenhængende kromosomer findes i den delvise tetraploide.
Representative Results
Forringelse af rec-8 meiotiske Cohesin komponent funktion resultater i diploide kønsceller:
Imaging cohesin komponent mutant rec-8 meiotiske afdelinger afslørede sperm og oocyter mulige mekanismer til at generere tetraploide dyr (figur 1)27,29,33. Mekanisk, er meiotiske deling defekter af rec-8 mutant sperm og oocyt forskellige; men både mandlige og kvindelige diploide kønsceller er produceret af rec-8 mutant.
I vildtype meiose, homologe kromosomer blive midlertidigt forbundet til en anden af crossover rekombination og indtaste den første meiotiske deling som en enhed eller bivalent (figur 1A)34. Under den første division, homologe kromosomer (homologs) adskille fra hinanden, mens Søster kromatider i hver homolog forblive sammen indtil anden division. Selvom mønster af kromosom segregation er den samme i kvindelige og mandlige gameter, er oocyt divisioner asymmetriske spermatocyte divisioner er symmetrisk og gennemgå en specialiseret cytokinesis. I hver division kasserer oocyt halvdelen af varens division ind i en lille polar krop. Således, hver oocyt forløber giver anledning til en enkelt haploide oocyt og to polar organer (figur 1B, C)35. Omvendt, en enkelt spermatocyte forløber giver anledning til fire funktionelle spermatider af gennemgår to symmetriske divisioner. Den anden afdeling kulminerer med fire spermatider spirende ud fra en residual krop. Denne cytokinesis er speciel, idet mønster og antallet af spermatider bestemmes af centrosomes36.
I forstadiet til rec-8 mutant mælke crossover rekombination mellem homologe kromosomer finder ikke sted og homologs er ikke tilsluttet som en bivalent i begyndelsen af den første meiotiske deling29,34. Søster kromatider af hver homolog udskille fra hinanden i første division i stedet for resterende sammen indtil anden division, som de gør i vildtype kønsceller. Interessant, er rec-8 mutant fænotype under anden division anderledes i mandlige og kvindelige mælke da oocyter undlader at gennemgå cytokinesis spermatocytes undergår en forholdsvis normal cytokinesis (figur 1B- F) 27 , 28 , 29. diploide oocyter opstår fordi de ikke i anden division både kromosom segregation og cytokinesis, derfor de ikke presse den anden polar krop (figur 1B, C). Spermatocytes i rec-8 germlines gennemgår spermatid spirende eller cytokinesis, men ofte adskille begge sæt af kromosomer til en af spermatider til at give en diploide spermatid og en spermatid mangler kromatin (fig. 1 d- F)27. Kvantificering af andelen af rec-8 sæd mangler kromatin er vist i figur 1F.
Dannelsen af kvindelige og mandlige diploide kønsceller i rec-8 mutanter foreslog, at denne mutant fænotype potentielt kunne bruges til at generere fuld genom tetraploide stammer.
Generation af tetraploide C. elegans stammer:
Tilstedeværelsen af en mutation i rec-8 genet i alle de genererede tetraploide stammer kan undgås ved forbigående banke ned rec-8 af RNAi29,37. Dette forudsætter, at reduktion af rec-8 funktion af RNAi ville generere diploide kønsceller, der potentielt kan give anledning til hele genom tetraploide dyr, som rec-8 mutanter gør29,37. Afgørende for denne protokol er at rec-8 mutanter både give anledning til diploide kønsceller og far et rimeligt stort antal unge, i modsætning til andre meiotiske mutanter, som giver anledning til aneuploid mælke og er for det meste sterile eller embryonale/larver dødbringende.
Flere tetraploide stammer blev genereret ved at fodre C. elegans bakterier udtrykker rec-8 dsRNA ved hjælp af enten en af to strategier (Se protokollen, figur 2og tabel 1)27. Tetraploids kan være genereret af selvstændige gødskning hermafroditter for to til tre generationer i petriskåle med bakterier at udtrykke rec-8 dsRNA. Ved denne strategi en hermafrodit placeres i frisk er gjort rec-8 RNAi plader og dens afkom overført et par dage senere på nye plader med frisk induceret rec-8 RNAi udtrykker bakterier (Se protokollen). Derudover kan tetraploids genereres gennem krydser den første generation af hermafroditter fodret bakterier udtrykker rec-8 dsRNA med ubehandlet hanner af samme genotype i petriskåle med bakterier at udtrykke rec-8 dsRNA ( Figur 2). I dette tilfælde er mænd i korset udsat til rec-8 RNAi bakterier fra L4 scenen og fremefter, under parring. Begge ordninger giver anledning til tetraploide dyr27. Tabel 1 viser tetraploide stammer, der er fremstillet ved hjælp af den ordning, der præsenteres her. Triploid og tetraploide C. elegans er større i størrelse end diploids, men triploid stammer er ustabile og har tendens til at blive diploide i en eller to generationer, mens tetraploide stammer er relativt stabil22,23. Formodede tetraploide stammer blev identificeret som større end de oprindelige stamme (Lon) hermafroditter, at far kun Lon afkom (figur 3A). Lon dyr identificeres nemt - vildtype diploide dyr er to tredjedele af længden af tetraploids og deres organer gør ikke en ekstra bend, der kan blive bemærket under dens sinusformet bevægelse fremad (figur 3A).
Tetraploide stammer blev bekræftet ved screening for tilstedeværelsen af 12 kromosom par i oocyter de tetraploide hermafroditter sammenlignet med seks kromosom par i oocyter diploide hermafroditter (figur 3B, C, og filmen 1).
Tetraploide klasser:
To typer af tetraploide hermafroditter blev identificeret: en far hanner på samme frekvenser som diploide hermafroditter og den anden far hanner ved meget højere frekvenser (tabel 1). Disse to slags tetraploide hermafroditter har vist sig at afvige i denne klasse producerer frekvenser svarer til diploide hanner er tetraploide for alle dens kromosomer (4A, 4 X), hvorimod klasse producerer høje frekvenser af hanner er hermafroditter, der er tetraploide autosome men triploide for sex kromosom (4, 3 X). Den senere klasse af tetraploids er stabil og producere 4A, 3 X hermafroditter og 4A, 2 X hanner.
Tetraploide stammer vokse langsommere og producerer reducerede kuld størrelse i forhold til de diploids, de var afledt af, som set i de stammer, der er genereret med den tidligere metode22,23. Madl og Herman22 foreslået, at den øgede andel af døde embryoner i de tetraploide stammer kan skyldes aneuploidi i oocyt, men overfladiske inspektion af tetraploide stammer ikke afsløre tilstrækkeligt forhøjet antal aneuploid oocytter heller ikke unormal oocyt eller spermatocyte divisioner for at tage højde for de observerede reduktion i kuld størrelse (Movie 2og figur 3 c, D).
Figur 1: Gametogenesis i rec-8 mutant indebærer mulige mekanismer til at generere stabile polyploide pletter. (A) Diagram kromosom organisation og segregation aftegning i vildtype og rec-8 mutant meiotiske divisioner. I vildtype meiose adskille homologe kromosomer i den første meiotiske deling. Søster kromatider i hver homolog orienteret mod den samme spindel-stang og forbliver sammen indtil anden division. I rec-8 mutanter, homologs danne ikke delefiltre, og dermed har forbindelse ikke. I modsætning til vilde type, rec-8 Søster kromatider orientere sig væk fra hinanden og separat i den første meiotiske deling. (B) Diagram af vildtype, og mutant oocyter viser de kvindelige pronucleus og ekstruderet polar organer (mandlige pronucleus ikke er afbildet). I vildtype oocytter resulterer to asymmetriske meiotiske divisioner i ekstrudering af to polar organer. I rec-8 mutanter men andet polar body ekstrudering mislykkes, hvilket resulterer i en diploide oocyt. (C) billeder af vildtype og rec-8 mutant oocyter udtrykker mCherry::histone H2B. Pilene indikerer to polar organer i vildtype oocyt og en i rec-8 mutant. Skalalinjen er 5 µm. (D og E) Live billeder af spermatider fra vildtype og rec-8 mutant dyr at udtrykke mCherry::histone H2B (magenta). Pilespidser angive anucleate spermatider. Skalalinjen er 2 µm. (D) Spermatocytes under den anden (spirende) division i vildtype og rec-8 mutant. Vildtype spermatocytes gennemgå symmetrisk divisioner resulterer i fire spirende spermatider, hver med en haploid kromosom supplement. I rec-8 mutant spermatocytes, er kromosom segregation forringet i anden division. Oftest forbliver en enkelt masse kromatin i den resterende krop (RB) eller i en af de to søster spermatider i den anden meiotiske deling. Dette giver anledning til anucleate rec-8 mutant sæd (angivet med pilespidser) eller diploide sperm. (E) levende billeder af post knopskydende spermatider i vildtype og rec-8 mutanter visualiseres ved hjælp af differential interferens kontrast (DIC) og Fluorescens mikroskopi. Vildtype spermatider alle har lignende chromatid masserne. REC-8 mutant spermatider danne anucleate sperm. (F) kvantificering af vildtype og rec-8 mutant anucleate sperm. REC-8 mutanter produceret 38,5% af anucleate sperm sammenlignet med mindre end 1,6% i vildtype. Fisher eksakt test indikerer, at en rec-8 mutant har betydeligt højere forekomst af anucleate sperm (p ≤0.0001) i forhold til vildtype. Fejllinjer udgør standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Ordningen for generering og isolere tetraploide C. elegans fra alle stamme. Pil til højre repræsenterer tidslinjen af protokollen fra dag 1 og går videre til dag 17. Lignende resultater kan opnås ved passage hermafroditter til ubehandlet hanner på dag 9. Parentes slut skildring af et skridt til tidslinjen. Ubehandlet dyr er orange, behandlede dyr er røde, Lon dyr er større i størrelse, rec-8 dsRNA udtrykker bakterier er afbildet som gennemsigtige plader med gennemsigtig rød baggrund og regelmæssig OP50 bakterier er afbildet på transparent grå baggrund plader. Proceduren er færdig ved 15 ° C, medmindre andet er angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: tetraploide eksempler. (A) lysfelt billede af en tetraploide (MSC2) dyr og den diploide stamme det var afledt af (AV740). Tetraploide C. elegans er generelt større og længere (Lon) end diploid. Denne forskel i kropsstørrelse resulterer i en yderligere sinusformet kurve af kroppen af den bevægelige tetraploide og kan bruges som et kriterium at skærmen for tetraploide derivater. Skalalinjen er 0.1 mm. (B, C) Fluorescens billeder af diploid (AV740) og tetraploide (MSC1) mest modne ugoedet oocyt nulcei, før de meiotiske divisioner. Sekundær screening udføres ved at iagttage antallet af kromosom-par i ubefrugtede oocyter af de etablerede Lon stammer, som vist i filmen 1 for en MSC1 stamme udtryk for Mcherry::H2B og GFP::β-Tubulin i germline. Skalalinjen er 5 µm. (D) billeder fra en tidsforskydning (Movie 2) tetraploide oocyt meiotiske divisioner skildrer en generelt normale meiose. Pilespidser markere polar organer og en punkteret streg, der markerer cortex af oocyt inde spermatheca og omgivet af sæd; t = tiden bortfaldet i minutter. Skalalinjen er 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Genotype | Tetraploide derivat (sæt autosome: # af X-chromosomes) * |
Forældrenes stamme (diploid) |
| meIs16 [pie-1p::mCherry:: hans-58 + unc-119(+)]; | MSC1 (4A:4 X) | MSC0 |
| ruIs57 [pie-1p::GFP::b-tubulin + unc-119(+)] | MSC2 (4A:3 X) | |
| MSC3 (4A:4 X) | ||
| MSC5 (4A:3 X) | ||
| MSC6 (4A:4 X) | ||
| MSC8 (4A:4 X) | ||
| UNC-119(ed3) III; ddIs6; ddIs6 [tbg-1::GFP + unc-119(+)]; ltIs37; ltIs37 [pAA64; pie-1p::mCherry::HIS-58 + unc-119(+)] IV | MSC14 (4A:3 X) | TMR17 |
| MSC15 (4A:3 X) | ||
| MSC16 (4A:4 X) | ||
| SPO-11 (me44) / nT1 IV; +/ nT1 [qIs51 [myo-2::gfp Ppes-10::gfp, PF22B7.9::gfp]] V | AV800& | AV776 |
| meIs8 [pie-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II; | AV809& | AV727 |
| ltIs37 [pie-1p::mCherry:: hans-58 + unc-119(+)] IV; | ||
| ltIs38 [pie-1p::gfp::ph(PLC1delta1) + unc-119(+)] | ||
| meIs8 [pie-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II; mnT12 (X; IV) | AV826& | AV695 |
| mIn1 [dpy-10(e128) mIs14 [myo-2::gfp pes-10::gfp]] / | AV810& | DR2078 |
| bli-2(e768) unc-4(e120) II | ||
| ruIs32 [pie-1::GFP::H2B + unc-119(+)] III | AV822& | AZ212 |
| AV823& | ||
| C. briggsae - mfIs42 [Cel-sid-2 + Cel-myo-2::DsRed] | AV824& | JU1018 |
Tabel 1: tetraploide stammer genereret. * Udledes ved at score antallet bivalents (tilsluttede homologe par) og univalents (enkelt homologs) i oocyter før de meiotiske divisioner ud over andelen af mænd far.
Movie 1: Screening for at bekræfte, hvorvidt stabil Lon stammer er fuld eller delvis tetraploids. Filmen starter med et diagram af en vildtype hermafrodit fremhæve regionen afbildet (ubefrugtede oocyter) til at identificere tetraploids ved at tælle kromosom par. Efter diagrammet, en serie af Z-stak film og fremskrivninger viser gonaderne diploide og tetraploide dyr fast og DAPI farves eller live billeder af stammer at udtrykke Mcherry::H2B Histon. Screening er gjort ved at tælle antallet af tilsluttede homologe kromosom-par i ubefrugtede oocyter. Optælling af enten MCherry eller DAPI farves organer er skakmat den ugoedet oocyt tættest på sæd lagring spermatheca ("-1 oocyt"). Kromosomer i denne oocyt er mest kondenseret og adskilt fra hinanden, giver mulighed for mere præcis homolog par tæller. Mere end 10 dyr pr. stamme blev screenet for at sikre-1 oocyt kromosom tæller var korrekte. Stak tykkelse er 0,2 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Movie 2: tetraploide oocyt divisioner vises normal. Tidsforskydning af dividere oocyt tetraploide overbelastes udtrykker Mcherry::H2B Histon og GFP::β-Tubulin. Timing og mønster af divisionerne vises normal. Billeder taget hver 2,5 min. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Discussion
Produktion af haploide (n) gameter er nøglen til at generere en diploid (2n) zygote på befrugtning. Denne reduktion af genomet er gennemført under meiose med to på hinanden følgende celledelinger efter en enkelt genome dobbeltarbejde. For at skabe haploide kønsceller, C. elegans, som med de fleste andre metazoans, adskille maternally og formynderisk afledt homologs i første division, mens Søster kromatider fra hver homolog adskille i anden division. En måde at hele genom polyploidi opstår i naturen er gennem generation af kønsceller, der undlader at halvdelen af deres genom størrelse under meiose.
Det har været kendt i over 50 år at tetraploide C. elegans nematoder er levedygtig og frugtbar. Nigon23, og senere Madl og Herman22, genereres og identificeret en håndfuld C. elegans tetraploids ved at forstyrre meiotiske kromosom adskillelse ved hjælp af heat-shock behandlinger og brug af genetiske markører, henholdsvis. En enkelt yderligere C. briggsae tetraploide stamme blev afledt ved hjælp af denne protokol over 30 år senere24. Disse tetraploids blev udnyttet til at undersøge, hvordan C. elegans bestemme, om at blive mandlige eller hermafrodit, hvordan Ploidi regulerer vækst og størrelse, og at analysere parring og synapsis i meiose25,26, 38 , 39 , 40. men disse og andre undersøgelser, kræver anvendelse af specifikke tetraploids eller triploid stammer var begrænset af vanskeligheden i at generere tetraploide stammer af denne metode.
Protokollen beskrevet her giver mulighed for generation af stabil fuld 4A, 4 X og delvis 4A, 3 X tetraploide Caenorhabditis nematodeprøveudtagning stammer fra en indledende diploide genetiske baggrund eller karyotype uden brug af genetiske markører.
Tetraploidy kan opstå ved mere end én mekanisme i C. elegans:
Madl og Herman foreslog at de tetraploide stammer de genererede sandsynligvis stammer fra en midlertidig tilstand mellem triploid. Deres stammer blev opnået gennem udvælgelse over flere generationer eller ved at krydse den formodede triploide mellemliggende med diploide hanner22. Defekter i kromosom partitionering i rec-8 mutanter, giver anledning til diploide oocyter og sperm foreslå en anden mulig mekanisme som tetraploide dyr kan opstå med rec-8 RNAi ordningen27.
Rec-8 RNAi behandlet hermafroditter kunne producere diploide oocyter og spermatocytes, der ville give anledning til tetraploide dyr efter befrugtning. Overensstemmelse med denne mulighed er det faktum, at nogle af de klonede F2 hermafroditter gav anledning til stabil Lon stammer i den næste generation, der tyder på, at de klonede Lon F2 hermafroditter hvor allerede tetraploide. I ordningen passage er den første generation af rec-8 RNAi behandlet hermafroditter krydset med ubehandlet hanner. Diploide spermatocytes kunne stadig opstå hos mænd fordi korset er gennemstegt i nærværelse af bakterier udtrykker rec-8 dsRNA og dermed, mænd er udsat for rec-8 RNAi under parring i mindst 3 dage. Derfor, Lon polyploids i horisontal ordningen kunne også have dannet fra befrugtning af diploide oocytter af diploide sperm. Stabil tetraploide stammer kan opstå fra enten befrugtning mellem diploide kønsceller eller krydser triploid dyr der indeholder oocytter af variable Ploidi med diploide dyr producerer haploide sædceller.
Vigtige overvejelser:
Self-versus krydsning ordninger:
Ordningen for selvstændige befrugtende rec-8 RNAi behandlet F1 hermafroditter og ordningen vedrørende krydsning af behandlede hermafroditter med ubehandlet hanner begge gav anledning til 4A, 4 X og 4A, 3 X tetraploide stammer. Selv om flere polyploids blev oprindeligt isoleret fra ordningen for selvstændige gødskning, flere af disse polyploide dyr var sterilt og dermed begge ordninger er ligeledes effektiv til at producere tetraploide stabil stammer. Årsag til øget succes og sterilitet hos den selvstændig gødskning ordningen er fortsat ukendt. Selv om begge ordninger er ligeledes effektiv, er ordningen for selvstændige gødskning lettere, da det ikke kræver isolering af hanner for parring. Derudover når stamme af interesse er ineffektive eller defekt på parring, ville den selvstændige gødskning ordning være at foretrække. Horisontal ordningen kan bruges til at generere komplekse tetraploids der indeholder mere end to versioner af et enkelt kromosom.
Ændringer og begrænsninger:
I øjeblikket, omfatter denne protokol rec-8 RNAi behandling af fodring bakterier at udtrykke dsRNA til rec-8 -genet. Denne protokol virker således ikke i Caenorhabditis arter ikke reagerer på RNAi af fodring eller i mutanter defekt i miljømæssige eller systemisk spredning af RNAi mellem væv41,42,43. Dette problem kunne potentielt løses ved at indføre RNAi behandling ved direkte injektion af dsRNA af interesse direkte i germline.
Triploid dyr skal genereres ved at krydse en tetraploide til en diploide dyr, hvorfra det stammer, fordi denne ordning ikke generere stabile triploid stammer44,45. Kun 15% af æggene far af triploids hatch, og deres afkom er for det meste sterile afkom på grund af aneuploidi. Derudover er få overlevende frugtbare afkom har tendens til at være fuldstændig eller i nærheden af diploids inden for et par generationer. Dette er sandsynligvis, i det mindste delvis, fordi oocyter delvist korrigere trisomi af adskillelse den tredje kromosom i selve polar i den første meiotiske deling.
En uovervindelig begrænsning af denne protokol er at det ikke virker for at gøre tetraploids af mutanter, der påvirker komponenter af RNAi-maskiner, fordi de er resistente over for RNAi behandling46.
Fejlfinding:
REC-8 RNAi:
Et par overvejelser er afgørende for denne protokol skal lykkes. Først er at bruge friske IPTG og frisklavet IPTG NMG plader til induktion af rec-8 dsRNA produktion i bakterier HT115 bakterier transporterer rec-8 (W02A2.6)-klon. IPTG er lysfølsomt og det er vigtigt at reducere lys eksponering til plader. IPTG plader kan lagres til én måned ved 4 ° C i mørke. Andet, rec-8 (W02A2.6) RNAi bakterielle HT115 stammer fra Ahringer biblioteket (Kamath og Ahringer 2003) givet en stærkere rec-8 fænotype end andre tilgængelige rec-8 HT115 kloner.
Tetraploide stamme vedligeholdelse:
Tetraploide stammer vokser meget langsomt og producere på de fleste 50 afkom pr. generation47. Alle identificerede tetraploide stammer er relativt stabile, men de kan bryde og blive diploide når understregede (Jonathan Hodgkin personlig kommunikation og vores upublicerede observationer). Derfor er det vigtigt at bemærke, at når tetraploide stammer er vokset ved 25 ° C, varme-chokeret, udsultet, eller frosset og optøet, de kan hurtigt vende tilbage til diploidy, så det er vigtigt at fortsætte med at vælge Lon dyr når optøning disse stammer, eller når udsætter disse stammer til stressende forhold, der kan få dem til at vende tilbage.
Mulige applikationer:
Undersøgelse af effekten eller rollen, som samlede genom polyploidization i evolution, celle cyklus, genekspression og udvikling i flercellede organismer har påberåbt sig sammenligninger mellem: celler i en organisme, der indeholder forskellige Ploidi, den samme celle typer i nært beslægtede arter med forskellige Ploidi eller arter, der har undergået evolutionært seneste polyploidization begivenheder og fysisk isolation3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. Selv om tetraploids kan udledes af zebrafisk og mus modelsystemer, er deres afkom sterile eller embryonically dødbringende16,17. Derudover disse modelsystemer har lange livscyklusser sammenlignet med C. elegans, og de tilgængelige metoder til at generere polyploide dyr er komplekse og ineffektive. C. elegans stammer, der er afledt af denne metode vil derfor være afgørende for at fremme enhver undersøgelse på effekter og roller af hele genom polyploidi i flercellede organismer.
Da en triploide kan være afledt af en tetraploide ved at krydse tetraploide til den oprindelige diploid, giver en sammenligning mellem diploids, triploids og tetraploids, der kun adskiller sig i antallet af kopier, genom, en unik og enestående mulighed for at evaluere tilsvarende dyr/organer/celler med forskellige genom størrelse (eller gen dosis). Fleksibiliteten og brugervenligheden af ordningen beskrevet her har tilladt os at generere snesevis af tetraploide stammer fra forskellige genetiske diploide baggrunde eller karyotypes. Nogle af disse stammer blev allerede brugt til forespørgsel mekanismer af homologe kromosom parring og synapsis under meiose27.
Vildtype og mutant tetraploide stammer transporterer fluorescerende markører vil give nye veje til undersøgelse for at forstå forholdet mellem genom størrelse og nukleare/cytosol ratio på intracellulære/cellulære/orgel og hele dyret skalering, samlede genom polyploidization om tilpasning, artsdannelse, gen dosis og udtryk og udvikling af væv og orgel. Ud over undersøgelsen af biologiske skalering vil generation af tetraploide stammer betydeligt yderligere forespørgsler af grundlæggende biologiske spørgsmål vedrører ekstracellulære signalering, genom ustabilitet, endoreduplikation, samlede genom dobbeltarbejde, gen dosering, tilpasning til stress, udvikling af resistens over for lægemidler, og mekanismen artsdannelse.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Caenorhabditis genetik Center (finansieret af National Institute of Health (NIH) Office for forskning infrastruktur programmer P40 OD010440) for stammer. Forfatterne vil gerne takke Baptiste Roelens og Eli Lessman, for at forsyne os med konstruktiv feedback og Mano Lab på CCNY, CUNY for brug af deres laboratorium for en del af optagelserne og for deres bistand. Dette arbejde blev støttet af en PSC-CUNY award TRADB-46-113 og NIH give 1SC2GM118275-01. M.S. blev delvist støttet af canadiske Institut for sundhed (CIHR) postdoc stipendium, og E.K. blev støttet af NIH/NIGMS STIGE give GM062981.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NGM agar plates | |||
| 60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3305 | |
| 35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3500 | |
| Bacteriological Agar, 5 kg | VWR | 89140-850 | |
| Sodium Chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
| Peptone, BD Bacto | VWR | 90000-368 | |
| Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
| IPTG, dioxane-free | Thermo Scientific | R0391 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Culture | |||
| LB Lennox Broth | IBI Scientific | 89126-176 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Agar plates | |||
| LB Agar Lennox | IBI Scientific | 89126-182 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics | |||
| Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
| DAPI | Biotium | 40011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol Fixation | |||
| Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Buffer | |||
| Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
| Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
| Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAi Clones | |||
| HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Source Bioscience | W02A2.6 | |
| HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Dharmacon | RCE1182-202299820 |
References
- Ricke, R. M., van Ree, J. H., van Deursen, J. M. Whole chromosome instability and cancer: a complex relationship. Trends Genet. 24, 457-466 (2008).
- Frawley, L. E., Orr-Weaver, T. L. Polyploidy. Curr Biol. 25, R353-R358 (2015).
- Orr-Weaver, T. L. When bigger is better: the role of polyploidy in organogenesis. Trends Genet. 31, 307-315 (2015).
- Otto, S. P. The evolutionary consequences of polyploidy. Cell. 131, 452-462 (2007).
- Davoli, T., de Lange, T. The Causes and Consequences of Polyploidy in Normal Development and Cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Adams, K., Wendel, J. Novel patterns of gene expression in polyploid plants. Trends Genet. 21, 539-543 (2005).
- Adams, K. L., Wendel, J. F. Polyploidy and genome evolution in plants. Curr Opin Plant Biol. 8, 135-141 (2005).
- Berman, J. Ploidy plasticity: a rapid and reversible strategy for adaptation to stress. FEMS Yeast Res. 16, (2016).
- Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of Intracellular Scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
- Breneman, A., Cande, J., Dunn, J., Burbank, K., O'toole, E. Genome-wide genetic analysis of polyploidy in yeast. Nature. 443, 541-547 (2006).
- Kuznetsova, A. Y., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell Cycle. 14, 2810-2820 (2015).
- Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Meyer, A. Genome duplication, divergent resolution and speciation. Trends Genet. 17, 299-301 (2001).
- Younis, A., Hwang, Y. -J., Lim, K. -B. Exploitation of induced 2n-gametes for plant breeding. Plant Cell Rep. 33, 215-223 (2014).
- Ihssen, P. E., McKay, L. R., McMillan, I., Phillips, R. B. Ploidy Manipulation and Gynogenesis in Fishes: Cytogenetic and Fisheries Applications. Trans Am Fish Soc. 119, 698-717 (2011).
- Stanley, J. G., Allen, S. K., Hidu, H. Polyploidy induced in the American oyster, Crassostrea virginica, with cytochalasin B. Aquaculture. 23, 1-10 (1981).
- Eakin, G. S., Behringer, R. R. Tetraploid development in the mouse. Dev Dyn. 228, 751-766 (2003).
- Heier, J., Takle, K. A., Hasley, A. O., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate cleavage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
- Arnold, B., Kim, S. -T., Bomblies, K. Single Geographic Origin of a Widespread Autotetraploid Arabidopsis arenosa Lineage Followed by Interploidy Admixture. Mol Biol Evol. 32, 1382-1395 (2015).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538, 336-343 (2016).
- Gallardo, M. H., Bickham, J. W., Honeycutt, R. L., Ojeda, R. A., Köhler, N. Discovery of tetraploidy in a mammal. Nature. 401, 341 (1999).
- Hodgkin, J. Primary sex determination in the nematode C. elegans. Development. 101, Suppl . 5-16 (1987).
- Madl, J. E., Herman, R. K. Polyploids and sex determination in Caenorhabditis elegans. Genetics. 93, 393-402 (1979).
- Nigon, V. Polyploidie experimentale chez un nematode libre, Rhabditis elegans maupas. Bull Biol Fr Belg. 95, 187-225 (1951).
- Woodruff, G. C., Eke, O., Baird, S. E., Félix, M. -A., Haag, E. S. Insights Into Species Divergence and the Evolution of Hermaphroditism From Fertile Interspecies Hybrids of Caenorhabditis Nematodes. Genetics. 186, 997-1012 (2010).
- Mlynarczyk-Evans, S., Roelens, B., Villeneuve, A. M. Evidence That Masking of Synapsis Imperfections Counterbalances Quality Control to Promote Efficient Meiosis. PLoS Genet. 9, e1003963 (2013).
- Lozano, E., Sáez, A. G., Flemming, A. J., Cunha, A., Leroi, A. M. Regulation of Growth by Ploidy in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 16, 493-498 (2006).
- Roelens, B., Schvarzstein, M., Villeneuve, A. M. Manipulation of Karyotype in Caenorhabditis elegans Reveals Multiple Inputs Driving Pairwise Chromosome Synapsis During Meiosis. Genetics. 201, 1363-1379 (2015).
- Martinez-Perez, E., et al. Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion. Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).
- Severson, A. F., Ling, L., van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes Dev. 23, 1763-1778 (2009).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
- Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).
- MacQueen, A. J., et al. Chromosome Sites Play Dual Roles to Establish Homologous Synapsis during Meiosis in C. elegans. Cell. 123, 1037-1050 (2005).
- Martinez-Perez, E., et al. Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion. Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).
- Schvarzstein, M., Wignall, S. M., Villeneuve, A. M. Coordinating cohesion, co-orientation, and congression during meiosis: lessons from holocentric chromosomes. Genes Dev. 24, 219-228 (2010).
- Kim, S., Spike, C., Greenstein, D. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. New York, NY. 277-320 (2013).
- Peters, N., et al. Control of mitotic and meiotic centriole duplication by the Plk4-related kinase ZYG-1. J Cell Sci. 123, 795-805 (2010).
- Pasierbek, P. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes Dev. 15, 1349-1360 (2001).
- Hodgkin, J. Primary sex determination in the nematode C. elegans. Development. 101, 5-16 (1987).
- Flemming, A. J., Shen, Z. -Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 5285-5290 (2000).
- Meneely, P. M. Sex determination in polyploids of Caenorhabditis elegans. Genetics. 137, 467-481 (1994).
- Whangbo, J. S., Hunter, C. P. Environmental RNA interference. Trends Genet. 24, 297-305 (2008).
- Imae, R., Dejima, K., Kage-Nakadai, E., Arai, H., Mitani, S. Endomembrane-associated RSD-3 is important for RNAi induced by extracellular silencing RNA in both somatic and germ cells of Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 28198 (2016).
- Tijsterman, M., May, R. C., Simmer, F., Okihara, K. L., Plasterk, R. H. A. Genes required for systemic RNA interference in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 14, 111-116 (2004).
- Cortes, D. B., McNally, K. L., Mains, P. E., McNally, F. J. The asymmetry of female meiosis reduces the frequency of inheritance of unpaired chromosomes. Elife. 4, e06056 (2015).
- Vargas, E., et al. Autosomal Trisomy and Triploidy Are Corrected During Female Meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207, 911-922 (2017).
- Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
- Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. , University of Oxford. (2005).
- Schoenfelder, K. P., Fox, D. T. The expanding implications of polyploidy. J Cell Biol. 209, 485-491 (2015).
- Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, a019166 (2015).
- Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Braasch, I., Meyer, A. Comparative genomics provides evidence for an ancient genome duplication event in fish. Philos Trans Royal Soc B. 356, 1661-1679 (2001).
