Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Published: March 15, 2018 doi: 10.3791/57296
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3, 1,2,3
1Brooklyn College, Biology Department, City University of New York, 2The Graduate Center, Biology Department, City University of New York, 3Advanced Science Research Center, City University of New York

Summary

שיטה זו מאפשרת לדור של נמטודות Caenorhabditis tetraploid ו- triploid של כל זן דיפלואידי. זני polyploid שנוצר על ידי שיטה זו השתמשו ללמוד אינטראקציות כרומוזום ב- meiotic prophase, שיטה זו שימושית לבחינת שאלות בסיסיות חשובות תא, התפתחותית, אבולוציונית, וביולוגיה סרטן.

Abstract

מנגנונים המערבות כל הגנום polyploidy תפקיד חשוב ב ההתפתחות והשינויים; כמו כן, דור חריג של תאים tetraploid נמצא קשור ההתקדמות של סרטן והן ההתפתחות של עמידות לתרופות. עד עכשיו, זה לא היה ריאלי לתמרן בקלות את פלואידיות של חיה multicellular ללא יצירת בעיקר סטרילי רומא. שהוצגו כאן הוא פרוטוקול פשוטה ומהירה ליצירת tetraploid Caenorhabditis elegans חיות מכל כל זן דיפלואידי. שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור דעה קדומה באזור הבידוד כרומוזום במהלך המיוזה, בסופו של דבר הגדלת פלואידיות C. elegans. אסטרטגיה זו מסתמכת על ההפחתה ארעית של ביטוי של הגן rec-8 לייצר גמטות דיפלואידי. מוטציה rec-8 מייצר גמטות דיפלואידי פוטנציאלי שיוכל לייצר את tetraploids על הפריה. ערכת צייתן זו שימש ליצירת זנים tetraploid נושאת מוטציות, כרומוזום rearrangements כדי לזכות בתובנה dynamics כרומוזומלית ואינטראקציות במהלך השיוך synapsis של מיוזה. שיטה זו יעילה ליצירת זנים tetraploid יציב ללא סמנים גנטיים, ניתן להחיל על כל זן דיפלואידי, יכול לשמש כדי להפיק triploid C. elegans. שיטה פשוטה זו שימושית עבור חוקרים אחרים השאלות הביולוגיות היסוד הרלוונטיים יציבות הגנום, ג'ין המינון, קנה מידה ביולוגית, איתות חוץ-תאית, הסתגלות ללחץ, התפתחות של עמידות לתרופות, ו מנגנונים של היווצרות המינים.

Introduction

Polyploidy כל הגנום קיימת ברחבי הטבע אשר לעתים קרובות צעד שנדרש לצורך הסתגלות היווצרות המינים, organogenesis, ריפוי פצעים, דרוג ביולוגי; זה ידוע גם לקדם סרטן והן עמידות בפני תרופות1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. תעשיות החקלאות, דוגה ליצור צמחים polyploid דגים, רכיכות על ידי טיפול כימי (למשל, קולכיצין ו- orzalin) כדי לקבל שיעורי צמיחה מהירה, מגושם היבול והמשק החי13, 14,15. ייצור ניסיוני ולא יעיל של tetraploids קיימת עבור דג זברה של עכבר דגם מערכות16,17. עם זאת, רוב או כל polyploid multicellular שנוצרו על ידי בעלי החיים embryonically קטלני או סטרילי, ולכן לא אידיאלי במחקרי מעבדה על ההשפעות של polyploidy האורגניזם multicellular. כתוצאה מכך, כל הבנה של כל הגנום polyploidization אורגניזמים רב תאיים הוגבלה מינים קרובים אבולוציונית האחרונות polyploidization אירועים18,19,20 . נתיב כדי לקדם שאילתות של תפקיד ביולוגי או ההשלכות של polyploidization הוא השימוש של מערכת דגם C. elegans . חשוב, C. elegans הוא מערכת גנטית צייתן בדרך כלל קיים דיפלואידי, מכילה רק 5 autosomes (א) וכרומוזום מין אחד (X) לכל הגנום, הוא שקוף ומאפשר ויוו השגחה של תהליכים ביולוגיים, ו יש מחזור חיים קצר של 3-4 ימים (מביצה לבוגר בגרו). C. elegans הוכח להיות מסוגל לשחזר כמו tetraploid, אשר הוא הסוג הנפוץ ביותר של כל הגנום polyploidy בטבע. Triploid בעלי חיים יכול להיווצר על ידי חציית tetraploids עם diploids, אבל פלואידיות שלהם אינו יציב, ולהיות הזנים דיפלואידי בתוך כמה דורות.

ב העשורים האחרונים רק קומץ של קיימא הפורה של C. elegans זנים tetraploids היו מבודדים במעבדה, באמצעות אסטרטגיה מפרך, יוצר רק מוגבל סוגי זנים21,22, 23. אסטרטגיה זו יוצר tetraploids C. elegans באמצעות טיפולי הלם חום, אשר ככל הנראה משפיע על כרומוזום ההפרדה גמטות, הקרנה לבעלי polyploid בשם באמצעות סמנים גנטיים. Tetraploids האלו היו מאוד שימושי בירור של איך זה תולעים נימיות קובע אם להיות זכר או אנדרוגינוס. לימודי מאוחר יותר להשתמש זנים זמין כדי לחקור את הצמיחה, מנה ג'ין, ורגולציה של synapsis במהלך המיוזה הזה24,25,של נמטודות21,26. למרבה הצער, מחקרים אלה היו מוגבל על ידי הקושי ביצירת זנים חדשים tetraploid, על רקע גנטיים זנים אלו הכילו. המוצג כאן הוא פרוטוקול פשוטה ומהירה ליצירת tetraploids יציב, אשר שימש ליצירת זנים ללמוד ויסות synapsis במהלך המיוזה27.

כמו בטבע, polyploidization יכול להיווצר על ידי היווצרות של דיפלואידי במקום גמטות הפלואידי. מציאת שלנו כי מוטציה רכיב rec-8 מיוזה ספציפי cohesin מייצר זרע דיפלואידי, oocytes עולה כי הורסים את הגן rec-8 יגרום בייצור של רומא tetraploid (איור 1)27, 28,29. יצירת זנים tetraploid פשוט כרוך הורסים rec-8 על ידי התערבות RNA (RNAi), במשך שני דורות על מנת phenocopy התכונה rec-8 גמטות דיפלואידי מוטציה. בשם polyploids ניתן לזהות בקלות על ידי שלהם יותר מאשר גודל גוף נורמלי. Polyploids מאושרות כמו tetraploids מלאה או חלקית על-ידי ספירת מספר כרומוזומים לכל גרעין יציב קווים הם הוקמה לאחר.

האסטרטגיה המתוארים כאן מאפשר את הדור של יציבה tetraploid Caenorhabditis נמטודות זנים מכל הראשונית הרקע הגנטי דיפלואידי או קריוטיפ ללא שימוש גנטיים. מאחר פרוטוקול זה יותר יעיל, תכליתי, ופשוט יותר ערכת בעבר, הוא יתרחב את הכלים הדרושים כדי לבצע שאילתה על התפקידים של polyploidization בתהליכי יסוד של פיתוח, יציבות הגנום באבולוציה multicellular אורגניזמים. המגבלה רק הנראה לעין בשימוש של פרוטוקול זה הוא עמיד בפני RNAi גנטי ברקעים.

Protocol

1. הגדרה על rec-8 RNAi (יום 1-3 באיור2)

פרוטוקול זה משתנה בין Kamath ו Ahringer30.

  1. עבור אינדוקציה של rec-8 dsRNA ביטוי Escherichia coli, להכין תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM) אגר צלחות31 בתוספת ריכוז סופי של 1 מ מ איזופרופיל-β-D-2-thiogalactopyranoside (IPTG) ו- µg 100/mL אמפיצילין. לאחסן בחושך ב 4 ° C עד השימוש, עד 4 שבועות.
  2. פס HT115 חיידקים נושאת את השיבוט rec-8 (W02A2.6) Ahringer המעבדה ספריה30 rec-8 השיבוט על גבי צלחות מרק לוריא (LB) בתוספת אמפיצילין µg/mL 100 ו- 50 µg/mL טטרציקלין. לגדול בין לילה ב שייקר ב 37 º C.
  3. יום 1, לחסן מושבות יחיד מן המושבות יחיד טרי מרוחים של החיידק HT115 e. coli נושא השיבוט RNAi rec-8 לתוך אמפיצילין המכיל 4 מ ל LB µg/mL 100 ו- 50 µg/mL טטרציקלין. לגדול התרבות חיידקים לילה ב מטרף או תוף רולר ב 37 º C.
  4. למחרת בבוקר (יום 2), זירוז ייצור של גדילי כפול (ds) RNA rec-8 W02A2.6 בתרבות חיידקי HT115 על-ידי הוספת ריכוז סופי של 1 מ מ IPTG, ומנענע למשך 40 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  5. לאחר אינדוקציה, זרע NGM/IPTG צלחות עם 100-200 µL של חיידקים rec-8 HT115 ואחסן צלחות בטמפרטורת החדר הלילה האפל (3 ביום).
  6. למחרת בבוקר (יום 4), להוסיף את המתח נמטודות הרצוי הלוחות חיידקים המושרה HT115 rec-8 כפי שמתואר בשלב 2.1 מתחת.

2. יצירת ובידוד Tetraploids (יום 4-16 באיור2)

  1. ביום הרביעי, מקום 3-4 צעירים L4 אנדרוגינוסים (הרביעי) הפרפרים והעשים של המתח דיפלואידי הרצוי על לוחות NMG/IPTG נזרע עם חיידקים rec-8 HT115 נפנתה יום לפני (שלב 1.5, לעיל). לגדול נמטודות ב 15 ° C בחושך.
  2. חזור על שלבים 1.3 ו 1.4 החל 3 ימים לאחר שלב 2.1, אשר יהיה שלושה ימים לפני (F1s) הוא צאצא ראשון מהשלב הזה הופכים L4s. העיתוי של שלב זה יהיה תלוי כמה מהר זן נמטודות גדל ב 15 º C. כמה זנים מוטציה דיפלואידי הן מגדלי איטי, תזמון זה צריך משובח כוונון על מנת לבודד tetraploids.
  3. יום 8 (לאחר 4 ימים של טיפול הזנה של RNAi rec-8 ), העברה-20 (2 אנדרוגינוסים/צלחת פטרי) אנדרוגינוסים L4 F1 (הדור הראשון שקבורה) גדל בתוך לחלילית-8 HT115 חיידקים על גבי HT115 טרי המושרה rec-8 RNAi ולאפשר אותם self-fertilize.
    1. לחלופין, העברת 20 אנדרוגינוסים F1 L4 גדל החיידק rec-8 HT115 על גבי טרי המושרה HT115 rec-8 RNAi חיידקים יחד עם זכרים ללא טיפול של המתח זהה (2 אנדרוגינוסים עם פלטה/זכרים 4-6).
  4. ביום 13, התחל הקרנה על F2 (דור שקבורה) רומא המופיעות ארוך (לון) או באופן כללי גדול יותר מאשר הסוג הפרוע; ואז להעביר חיות לון בודדות על זנים OP50 או HB101 רגיל של חיידקים e. coli . המשך הקרנת F3 רומא (שקבורה השלישי); אולם, F3 רומא מ באותה הצלחת יכולה להיחשב זנים עצמאית אם הם הופכים הוקמה, כי הם יכולים להיות אחים מאותו הוקמה כבר אמא F2.
    הערה: tetraploids בשם מזוהים בקלות כי הם בבירור יותר diploids. אנדרוגינוסים פראי סוג הם שני שלישים קצר יותר tetraploids. כי זה ארוך יותר, גוף tetraploid עושה סיבוב נוסף כפי שהוא נע קדימה על ידי יצירת גלים sinusoidal כיפוף הגוף מהראש עד זנב (איור 3 א).
  5. לאפשר לון תולעים self-fertilize, מופצים על-ידי בחירת לון רומא עד רק לון רומא הינם הוליד בהיעדר rec-8 טיפול RNAi. פעולה זו עשויה להימשך שלושה דורות נוספים. תולעים לון לעיתים קרובות סטרילי, לא תשואה רומא.

3. אימות Tetraploid זנים (סרט 1, איור 3 א, ב')

הערה: זנים Tetraploid הניתנים לאימות על ידי ספירת מספר הכרומוזומים שלהם oocytes מופרית. מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לשמש על המסך עבור מספר זוגות כרומוזום oocytes דיפלואידי מופרית (לפני לחטיבות meiotic), אם המתח יש סמן פלורסנט כרומוזומים. בהיעדרו של כרומוזום פלורסנט סמנים, נמטודות tetraploid יכולים להיות מוקרן על ידי תיקון של נמטודות מכתים עם צבע DNA; ראה להלן פרוטוקול לתיקון אתנול, חיית-כל 4 ′, צביעת dihydrochloride 6-Diamidine-2 ′-phenylindole (דאפי).

  1. צביעת דאפי כל בעלי חיים
    הערה: זנים Tetraploid נושא 12 זוגות כרומוזום מחוברים הניתנים לאימות מאת דאפי מכתימה את החיות האלה, ספירת מספר גופים דאפי שלה oocytes מופרית.
    1. מקום 5 כדי 10 µL של המאגר M931 בשקופית מיקרוסקופ, ואז להעביר נמטודות 6-10 המסירה.
    2. תחת מיקרוסקופ ויבתר, צייר רוב M9 מהמסירה מבלי להסיר את נמטודות עם טישו ניקוי נטולת מוך. לאחר מכן, מיד להוסיף טיפה 10 µL של 90% אתנול על התולעים. לאפשר את התולעים להתייבש לחלוטין, אבל לא יותר מכמה שניות.
    3. ברגע האתנול מתאדה (ניתן לראות זאת כפי שזה קורה מתחת למיקרוסקופ ויבתר), להוסיף µL 10 נוספים של 90% אתנול על התולעים.
    4. חזור על שלב 3.1.3 שלוש פעמים נוספות.
    5. ברגע הטיפה האחרונה של אתנול התאדו, להוסיף 6 µL של דאפי או Hoechst לצבוע הריכוז הסופי מומלץ בתקשורת הרכבה של בחירה (לדוגמה, 1:1,000 לדילול דאפי 2 ng/µL ריכוז מניות ב- M9). לאחסון לטווח ארוך של השקופיות, 0.5% p-phenylenediamine מומס 20 מ מ טריס-HCl, pH 8.8, גליצרול 90% כפתרון antifade, במקום M9 בלבד, עשוי לשמש.
    6. מכסה את התולעים בשקופית עם coverslip, לאטום את הקצוות של coverslip עם לק. הציון במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (שלב 3.1.7) לפחות 10 דקות לאחר הוספת את coverslip. ניתן לאחסן שקופיות ללא antifade לכמה ימים ב 4 ° C לפני הבקיע, אבל האיכות של קרינה פלואורסצנטית מתחיל לרדת לאחר מספר ימים.
    7. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה X 100, להבקיע במשחק oocyte מופרית הכי בוגרת, אשר נמצא בסמוך לגן spermatheca, טרם נכנס spermatheca את המספר של דאפי בודדים גופות (כרומוזום מהעשור זוגות) או הרחם.
      1. להבקיע בודדים גופות דאפי בתוך גרעין oocyte, השתמש להתמקד בסדר של המיקרוסקופ לנוע באיטיות מהחלק העליון של גרעין oocyte לתחתית במהלך ספירת. לאחר מכן, לספור מחדש באותו הגרעין תוך כדי הזזת המוקד בכיוון ההפוך (קרי, מהתחתית לצמרת של הגרעין) כדי לאשר את מספר הגופות דאפי שנספרו.
    8. ציון oocyte מופרית הבוגר ביותר של כל אחד הגונדות שני ב אנדרוגינוסים לפחות עשרה לכל זן לון יציב. Oocytes פראי סוג יש 6 גופות דאפי על ממוצע, 5 זוגות אוטוזום את זוג כרומוזום המין. הנוכחות של 12 גופים דאפי oocyte זנים לון יציב מצביע על כך החיות בגן זן זה הן או חלקית (4 סטים של Autosomes, 3 X-chromosomes) או (4 סטים של Autosomes, 4 X-chromosomes) tetraploids.
    9. לחשב את המספר הממוצע של גופים דאפי נצפתה מן oocytes (לפחות 10) מרובים לכל זן. אמנם אגע כמה זוגות כרומוזום או על העליון של אחד את השני, אז המספר של דאפי גופות ב oocyte לעיתים קרובות הוא קטן יותר מאשר המספר הממשי של כרומוזום זוגות.
    10. (אופציונלי) עוד יותר לאמת יציב זנים לון איפה המספר הממוצע של דאפי גופות 12 כדי לבדוק אם הם מלא (4A, 4 X) או חלקי (4A, 3 X) tetraploids על ידי immunofluorescence מכתים נגד כרומוזום ציר חלבונים כגון HTP-332. זה מכתים יבחין כרומוזום זוגות על-ידי הצגת תבנית בצורת צלב של כרומוזומים ינותק יחיד נוכח tetraploid חלקית.

Representative Results

ירידת ערך של rec-8 Meiotic Cohesin רכיב תוצאות הפונקציה גמטות דיפלואידי:

הדמיה של הדיביזיות meiotic של cohesin רכיב מוטציה rec-8 זרע ו- oocytes גילה מנגנונים אפשריים ליצירת חיות tetraploid (איור 1)27,29,33. . Mechanistically, הליקויים חטיבת meiotic של זרע מוטציה rec-8 ו oocyte שונים; עם זאת, גם זכר וגם נקבה גמטות דיפלואידי מופקים על ידי החשבונאי rec-8 .

ב פראי סוג מיוזה, כרומוזומים הומולוגיים להפוך זמנית המחוברים אחד לשני באמצעות כבל מוצלב רקומבינציה והזן לליגת העל meiotic יחידה או טרינארית (איור 1 א')34. במהלך לליגה הראשונה, כרומוזומים הומולוגיים (homologs) בנפרד אחד מהשני, ואילו האחות chromatids, כל homolog נשארים ביחד עד לליגה השניה, הארצית. למרות הדפוס של כרומוזום סגרגציה הוא זהה גמטות נשי, oocyte חטיבות הם אסימטרי ואילו חטיבות spermatocyte סימטרי, עוברים ציטוקינזה מיוחדים. בדיוויזיה כל oocyte מבטלת את חצי של המוצר חטיבת לתוך גוף קוטב קטנים. לפיכך, כל קודמן oocyte נותן עלייה oocyte הפלואידי יחיד, קוטב שני גופים (איור 1B, ג)35. לעומת זאת, הקדמה spermatocyte יחיד מעורר ארבע spermatids תפקודית על ביצוע שתי חטיבות סימטרי. החטיבה השנייה מגיע לשיאו עם ארבע spermatids הנצה מגוף שיורית. ציטוקינזה הזה הוא מיוחד בכך דפוס ומספר spermatids נקבעת על-ידי centrosomes36.

הקדמה גמטות מוטציה rec-8 , רקומבינציה מוצלב בין כרומוזום הומולוגי לא יעשה, homologs אינם מחוברים בתור טרינארית בתחילת29,meiotic החטיבה הראשונה34. Chromatids אחות של כל homolog בנפרד אחד מהשני בליגה הראשונה במקום הנותר יחד עד לליגה השניה, הארצית, כמו שעושים פראי סוג גמטות. מעניין, צילומי פוטו-8 פנוטיפ מוטציה במהלך הליגה השנייה הוא שונה גמטות זכר ונקבה כי oocytes נכשל לעבור את ציטוקינזה ואילו spermatocytes עוברים על ציטוקינזה רגיל יחסית (איור 1B– F) 27 , 28 , 29. oocytes דיפלואידי מתעוררות כי בליגה השנייה הם נכשלים כרומוזום סגרגציה והן ציטוקינזה, ולכן הם לא הבלטת הגוף הקוטב השני (איור 1B, ג). Spermatocytes בתוך לחלילית-8 germlines עוברים spermatid ניצני או ציטוקינזה, אך לעיתים קרובות הפרדת שני סטים של כרומוזומים לאחד spermatids להניב תשואה של spermatid דיפלואידי, spermatid חסר כרומטין (איור 1D– F)27. כימות של היחס של זרע rec-8 חסר כרומטין מוצג באיור 1F.

היווצרות של גמטות דיפלואידי הנקביים והזכריים בתוך לחלילית-8 מוטציות הציע כי זו מוטציה פנוטיפ שעלול לשמש ליצירת זנים tetraploid הגנום המלא.

דור של Tetraploid C. elegans זנים:

הנוכחות של מוטציה בגן המשחקים-8 ב כל זנים tetraploid שנוצר ניתן להימנע על ידי transiently הורסים rec-8 על ידי RNAi29,37. ההנחה היא כי ההפחתה של פונקציה rec-8 על ידי RNAi לייצר גמטות דיפלואידי כי יכול באופן פוטנציאלי להצמיח הגנום כולו tetraploid בעלי חיים, כמו מוטציות rec-8 29,37. חיוני פרוטוקול זה היא rec-8 המוטציות הן להצמיח גמטות דיפלואידי אדוני מספר גדול יחסית של צעירים, בניגוד מוטאנטים אחרים meiotic, אשר להצמיח גמטות aneuploid ואינם ניתנים בעיקר סטרילי או עובריים/זחל קטלני.

מספר זנים tetraploid נוצרו על ידי האכלת חיידקים C. elegans לבטא dsRNA rec-8 שימוש אחד של שתי אסטרטגיות (עיין פרוטוקול איור 2, טבלה 1)27. Tetraploids יכול להיווצר על ידי אנדרוגינוסים עצמית המפרה דורות 2-3 צלחות פטרי עם חיידקים לבטא dsRNA rec-8 . על ידי אסטרטגיה זו אנדרוגינוס ימוקם טריים תוצרת rec-8 RNAi צלחות על רומא שלו מועבר מספר ימים מאוחר יותר על גבי לוחיות הרישוי עם טרי המושרה rec-8 RNAi לביטוי חיידקים (ראה פרוטוקול). בנוסף, ניתן להפיק tetraploids דרך מעבר הדור הראשון של אנדרוגינוסים האכיל חיידקים לבטא rec-8 dsRNA עם זכרים ללא טיפול של גנוטיפ באותה בתוך צלחות פטרי עם חיידקים לבטא dsRNA rec-8 ( איור 2). במקרה זה, הזכרים בצלב נחשפים החיידק RNAi rec-8 מהבמה L4 ואילך, בעת ההזדווגות. שתי ערכות להצמיח חיות tetraploid27. טבלה 1 מציגה את tetraploid זנים שהושג באמצעות ערכת המוצג כאן. Triploid, tetraploid C. elegans גדולה יותר diploids, אבל זנים triploid אינם יציבים, נוטות להפוך דיפלואידי בדורות אחד או שניים, ואילו זנים tetraploid הם יציבים יחסית22,23. זני tetraploid בשם אותרו כ גדולה יותר אנדרוגינוסים זן (לון) המקורי, שהוליד רק לון רומא (איור 3 א). לון חיות מזוהים בקלות - חיות דיפלואידי פראי סוג שני שליש מאורכו של tetraploids, גופם לא עושים עיקול נוסף, אשר יכול להיות לב במהלך תנועתו sinusoidal קדמי (איור 3 א).

זני tetraploid שאושרו על-ידי הקרנת לנוכחות של 12 כרומוזום זוגות ב- oocytes אנדרוגינוסים tetraploid לעומת שישה זוגות כרומוזום oocytes של אנדרוגינוסים דיפלואידי (איור 3B, ג, ו 1 סרט).

Tetraploid מחלקות:

שני סוגים של אנדרוגינוסים tetraploid זוהו: אחד הזכרים הוליד בתדרים דומים כמו אנדרוגינוסים דיפלואידי והשני הוליד זכרים בתדרים גבוהים יותר הרבה (טבלה 1). שני סוגים אלה של אנדרוגינוסים tetraploid הוכחו שונים בכך התדרים מחלקה בהפקת דומים לאלה של זכרים דיפלואידי הם tetraploid עבור כל הכרומוזומים שלו (4A, 4 X), בעוד התדרים גבוה מחלקה בייצור של גברים אנדרוגינוסים כי הם tetraploid autosomes אבל triploid על כרומוזום המין (4, 3 X). מחלקת מאוחר יותר של tetraploids יציבים ומפיקים 4A, 3 X אנדרוגינוסים, 4A, 2 X הזכרים.

זני tetraploid לצמוח לאט יותר ולייצר מוקטנים שבוחרים בהשוואה את diploids שהם נגזרו, כפי שניתן לראות עבור זנים שנוצרו עם22,בשיטה הקודמת23. תלול בטירוף ו, הרמן22 הציע כי שיעור מוגבר של העוברים מת ב זנים tetraploid יכול להיות בגלל אנאפלואידיה ב oocyte, אולם בדיקה שטחית של זנים tetraploid לא חשפו מספיק מספרים גבוהות של aneuploid oocytes ולא oocyte חריג או חטיבות spermatocyte להביא בחשבון הפחתת שנצפה גודל ברוד(סרט 2ו- איור 3C, יח).

Figure 1
איור 1: Gametogenesis בתוך לחלילית-8 מוטציה מרמז על מנגנונים אפשריים ליצירת יציבה כתמים polyploid. (א) תרשים של כרומוזום הארגון, סגרגציה הדפוס ב פראי סוג ו- rec-8 חטיבות meiotic מוטציה. ב פראי סוג מיוזה, כרומוזומים הומולוגיים נפרדים meiotic במחלקה הראשונה. אחותי chromatids ב homolog כל אוריינט לכיוון הקוטב פלך אותו ולהישאר יחד עד לליגה השניה, הארצית. בתוך לחלילית-8 מוטציות, homologs לא עושים בצורת ג'יי ג'יי אברהמס, ולכן אינם מחוברים. לעומת זאת עד פראי סוג, האחות rec-8 chromatids אוריינט אחד מהשני, נפרדות meiotic במחלקה הראשונה. (B) דיאגרמה של פראי סוג של מוטציה oocytes מראה pronucleus הנשי וגופים קוטב עם הבלטה (pronucleus זכר לא מתואר). ב פראי סוג oocytes, שתי חטיבות meiotic אסימטרי לגרום ההבלטה של שתי גופות קוטב. בתוך לחלילית-8 מוטציות אולם ההבלטה הגוף הקוטב השני נכשל וכתוצאה מכך oocyte דיפלואידי. (ג) תמונות של פראי סוג ו- rec-8 oocytes מוטציה לבטא mCherry::histone ויזת עבודה H2B. חיצים מציינים שני גופים קוטב oocyte פראי סוג ואחד בתוך לחלילית-8 החשבונאי. סולם בר הוא 5 מיקרומטר. ( Eו-D ) חי תמונות של spermatids של חיות מוטציה פראי סוג ו- rec-8 לבטא mCherry::histone ויזת עבודה H2B (מגנטה). ראשי חצים מצביעות על anucleate spermatids. סולם בר הוא 2 מיקרומטר. (ד) Spermatocytes שעברו הליגה השנייה (ניצני) פראי סוג, מוטציה rec-8 . Spermatocytes פראי סוג עוברים חלוקה סימטרי וכתוצאה מכך ארבע spermatids ניצני, כל אחד עם מהווה השלמה כרומוזום הפלואידי. בתוך לחלילית-8 מוטציה spermatocytes, סגרגציה כרומוזום זה נפגעת בליגה השנייה. לרוב מסה יחידה של כרומטין נשאר בגוף שיורית (RB) או באחד האחות שני spermatids meiotic בליגה השנייה. זה נותן עלייה anucleate rec-8 מוטציה זרע (מסומן על ידי חץ) או זרע דיפלואידי. (E) תמונות בשידור חי של פוסט-הנצה spermatids פראי סוג, מוטציות rec-8 visualized באמצעות התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC) וכן קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. Spermatids פראי סוג כל יש גושים כרומטידה דומה. spermatids מוטציה rec-8 בצורת anucleate זרע. כימות (F) של הזרע anucleate מוטציה פראי סוג ו- rec-8 . מוטציות rec-8 המיוצר 38.5% של זרע anucleate לעומת פחות מ- 1.6% בסוג הפרוע. בדיקה מדוקדקת של פישר מציין כי מוטציה rec-8 יש שכיחות גבוהה יותר באופן משמעותי של anucleate הזרע (p ≤0.0001) יחסית לסוג הפראי. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ערכת עבור יצירת ובידוד tetraploid C. elegans מתוך מאמץ כלשהו. החצים בצד הימין מייצגת את ציר הזמן של פרוטוקול החל מ- 1 יום, ומתחזקים יום 17. תוצאות דומות יכולה להיות מושגת על ידי מעבר אנדרוגינוסים זכרים ללא טיפול יום 9. סוגריים מרובעים להתחבר תיאור של צעד אחד קדימה ציר הזמן. חיות לא מטופל כתומות, חיות שטופלו אדומות, לון חיות גדולה, rec-8 dsRNA לבטא חיידקים מתואר כמו לוחות שקופים עם רקע אדום שקוף וחיידקים OP50 רגיל מתואר על אפור שקוף הצלחות רקע. ההליך נעשה ב 15 ° C אלא אם צויין אחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: דוגמאות Tetraploid. (א) שדה בהיר תמונה של על חיים (MSC2) tetraploid, המתח דיפלואידי שזה נגזר מן (AV740). Tetraploid C. elegans הם בסך הכל גדול וארוך (לון) מאשר דיפלואידי. ההפרש בין גודל הגוף יוצרת מעגל sinusoidal נוספים של הגוף של tetraploid זז והוא יכול לשמש כקריטריון למסך בנגזרים tetraploid. סולם בר הוא 0.1 מ מ. (B, C) תמונות זריחה של דיפלואידי (AV740) tetraploid (MSC1) הכי בוגרת oocyte מופרית nulcei, לפני לחטיבות meiotic. משני ההקרנה מבוצעת על ידי התבוננות מספר זוגות כרומוזום oocytes מופרית של זנים לון הוקמה, כפי שמוצג בסרט 1 עבור זן MSC1 ביטוי Mcherry::H2B ו- GFP::β-טובולין germline. סולם בר הוא 5 מיקרומטר. (D) תמונות זמן לשגות (2 סרטים) של חטיבות meiotic tetraploid oocyte המתאר של מיוזה נורמליים בעקרם. ראשי חץ לסמן קוטב גופות ו קו מנוקד מסמן בקליפת oocyte פנימה spermatheca, מוקף הזרע; t = הזמן פג תוך דקות. סולם בר הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

גן # מושגים בסיסיים נגזרת tetraploid
(סטים של Autosomes: # של X-chromosomes) *		 זן הורים
(דיפלואידי)
meIs16 [עוגה-1p::mCherry:: שלו-58 + unc-119(+)]; MSC1 (4A:4 X) MSC0
ruIs57 [עוגה-1p::GFP::b-טובולין + unc-119(+)] MSC2 (4A:3 X)
MSC3 (4A:4 X)
MSC5 (4A:3 X)
MSC6 (4A:4 X)
MSC8 (4A:4 X)
unc-119(ed3) III; ddIs6; ddIs6 [tbg-1::GFP + unc-119(+)]; ltIs37; ltIs37 [pAA64; פאי-1p::mCherry::HIS-58 + unc-119(+)] הרביעי MSC14 (4A:3 X) TMR17
MSC15 (4A:3 X)
MSC16 (4A:4 X)
בוב ספ-11 (me44) / nT1 הרביעי; + nT1 [qIs51 [myo-2::gfp Ppes-10::gfp, PF22B7.9::gfp]] V AV800& AV776
meIs8 [עוגה-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II; AV809& AV727
ltIs37 [עוגה-1p::mCherry:: שלו-58 + unc-119(+)] הרביעי;
ltIs38 [pie-1p::gfp::ph(PLC1delta1) + unc-119(+)]
meIs8 [עוגה-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II; mnT12 (X; IV) AV826& AV695
mIn1 [dpy-10(e128) mIs14 [pes myo-2::gfp-10::gfp]] / AV810& DR2078
bli-2(e768) unc-4(e120) II

ruIs32 [עוגה-1::GFP::H2B + unc-119(+)] השלישי
 AV822& AZ212
AV823&
ג briggsae - mfIs42 [צ'ל-סיד-2 + צ'ל-myo-2::DsRed] AV824& JU1018

טבלה 1: זנים Tetraploid שנוצר. * להסיק כשקלע את המספר של bivalents (זוגות הומולוגי מחוברים) ואת univalents (homologs בודדים) ב- oocytes לפני לחטיבות meiotic בנוסף הפרופורציה של הזכרים הוליד.

Movie 1
סרט 1: הקרנה לאשר אם זנים לון יציבים מלאים או חלקיים tetraploids. הסרט מתחיל עם דיאגרמה של אנדרוגינוס פראי סוג סימון האזור עם תמונה (מופרית oocytes) כדי לזהות tetraploids על ידי ספירת כרומוזום זוגות. בעקבות הדיאגרמה, סדרת Z-מחסנית סרטים והקרנות הצג גונדות של חיות דיפלואידי, tetraploid קבוע, דאפי צבעונית או לחיות תמונות של זנים לבטא Mcherry::H2B היסטון. ההקרנה נעשה על ידי ספירת מספר זוגות מחוברים כרומוזום הומולוגי oocytes מופרית. ספירת MCherry או דאפי גופות מוכתם נעשית על oocyte מופרית הקרוב הזרע אחסון spermatheca ("-1 oocyte"). הכרומוזומים oocyte הזה הכי מרוכז, מופרדים אחד מהשני, מתן אפשרות עבור homolog מדויקת יותר זוגות ספירות. יותר מ- 10 בעלי חיים לכל זן הוקרנו על מנת להבטיח ספירת כרומוזום-1 oocyte היו מדויקים. עובי מחסנית הוא 0.2 µm. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Movie 2
2 הסרט: חטיבות Tetraploid oocyte נראים תקינים. זמן לשגות של חלוקת oocyte של זן tetraploid לבטא היסטון Mcherry::H2B ו- GFP::β-טובולין. תזמון ותבנית של הדיביזיות נראים תקינים. מתמונות שצולמו כל מינימלית 2.5 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Discussion

בייצור גמטות הפלואידי (n) הוא המפתח ליצירת זיגוטה דיפלואידי (2n)-הפריה. הפחתה זו של הגנום מתבצע במהלך המיוזה עם שתי חלוקות תאים עוקבים אחרי שכפול גנום יחיד. כדי ליצור הפלואידי גמטות, C. elegans, כמו עם רוב metazoans אחרים, הפרדת maternally, בטון אבהי-נגזר homologs בליגה הראשונה, ואילו האחות chromatids של כל homolog ולברים בליגה השנייה. אחת דרך את הגנום כולו polyploidy מתעוררת בטבע היא דרך הדור של גמטות להיכשל חצי גודל הגנום שלהם במהלך המיוזה.

זה ידוע כבר מעל 50 שנה את tetraploid C. elegans נמטודות הן קיימא ופורה. Nigon23, ו מאוחר יותר תלול בטירוף ו, הרמן22, שנוצר וזיהה קומץ של tetraploids C. elegans באמצעות שיבוש סגרגציה כרומוזום meiotic באמצעות טיפולי חום-הלם ושימוש גנטיים, בהתאמה. סינגל נוסף briggsae ג tetraploid זן נגזר באמצעות פרוטוקול זה למעלה מ-30 שנה מאוחר יותר24. Tetraploids אלה נוצלו לחקור איך C. elegans לקבוע אם להיות זכר או אנדרוגינוס, איך פלואידיות מווסת את קצב גדילתם וגודלם, וכדי לנתח זיווג ואת synapsis של מיוזה25,26, 38 , 39 , 40. אך אלה ומחקרים נוספים הדורשים שימוש tetraploids ספציפי או זנים triploid היו מוגבל על-ידי הקושי ביצירת זנים tetraploid בשיטה זו.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את הדור של 4A מלאים יציב, 4 X ושל חלקי 4A, 3 X tetraploid Caenorhabditis נמטודות זנים מכל הראשוני הרקע הגנטי דיפלואידי או קריוטיפ ללא שימוש גנטיים.

Tetraploidy עלולה להיווצר על ידי יותר מאשר מנגנון אחד C. elegans:

תלול בטירוף ו, הרמן הציע כי זנים tetraploid שהם יצרו כנראה נגזר מצב ביניים triploid. זנים שלהם התקבלו באמצעות בחירה דורות מרובים או על ידי חציית את triploid בשם ביניים עם זכרים דיפלואידי22. הליקויים בעבודת כרומוזום למחיצות בתוך לחלילית-8 מוטציות כי נותן לעלות oocytes דיפלואידי, זרע להציע מנגנון אפשרי אחר, שבו חיות tetraploid שעלולות להתעורר עם rec-8 RNAi ערכת27.

אנדרוגינוסים RNAi שטופלו rec-8 יכול לייצר דיפלואידי oocytes ו spermatocytes, אשר להצמיח בעלי חיים tetraploid על הפריה. בקנה אחד עם האפשרות הזו היא העובדה כי חלק אנדרוגינוסים F2 משובטים הולידה זנים לון יציב בהדור הבא, אשר עולה כי את אנדרוגינוסים לון F2 משובטים שם כבר tetraploid. לפי שיטת החצייה, הדור הראשון של אנדרוגינוסים RNAi מטופלים rec-8 הוא חצה עם זכרים ללא טיפול. Spermatocytes דיפלואידי יכול להיווצר עדיין אצל גברים כי הצלב נעשה בנוכחות חיידקים לבטא dsRNA rec-8 , לכן, גברים נחשפים rec-8 RNAi במהלך ההזדווגות לפחות 3 ימים. לכן, polyploids לון בערכת cross-fertilizing יכול גם יצרו מן ההפריה של oocytes דיפלואידי על ידי הזרע דיפלואידי. זני tetraploid יציב שעלולים להתעורר גם הפריה בין גמטות דיפלואידי או במעבר triploid חיות המכיל oocytes של פלואידיות משתנה עם חיות דיפלואידי בייצור הזרע הפלואידי.

שיקולים חשובים:

העצמי-לעומת ערכות הפרייה:

ערכת להפרות עצמית rec-8 RNAi F1 אנדרוגינוסים ובא ערכת המערבים מעבר של אנדרוגינוסים שטופלו עם לא מטופל בשני זכרים הולידה 4A, 4 X ו- 4A, זנים tetraploid X 3. למרות polyploids עוד היו בתחילה שבודד הערכה עצמית המפרה, יותר של בעלי חיים polyploid אלה היו סטרילי, ובכך הן ערכות יעילים באופן דומה לייצר זנים יציב tetraploid. הסיבות להצלחת מוגברת ו עקרות בערכת עצמית המפרה נותר עלום. למרות שתי ערכות יעילים באופן דומה, הערכה עצמית המפרה היא קלה יותר כאשר היא אינה דורשת את הבידוד של הזכרים להזדווגות. בנוסף, כאשר המתח עניין לא יעיל או פגומה-הזדווגות, הערכה עצמית המפרה. עדיף שלא ערכת cross-fertilizing עשוי לשמש ליצירת tetraploids מורכבים המכילים יותר מ שתי גרסאות של כרומוזום יחיד.

שינויים ומגבלותיה:

כיום, פרוטוקול זה כרוך rec-8 RNAi טיפול על ידי האכלת חיידקים לבטא dsRNA עבור הגן rec-8 . לפיכך, פרוטוקול זה לא עובד במינים Caenorhabditis להגיב RNAi מאכילים, או מוטציות פגומים ההתפשטות סביבתי או מערכתית של RNAi בין רקמות-41,-42,-43. פוטנציאל ניתן לפתור בעיה זו על ידי החדרת RNAi טיפול על ידי הזרקה ישירה של dsRNA עניין ישירות לתוך germline.

חיות triploid להפיקם באמצעות מעבר של tetraploid חיה דיפלואידי שממנו הופק, כי ערכה זו אינו יוצר יציב זנים triploid44,45. רק 15% מכלל הביצים הוליד triploids הפתח, הצאצאים שלהם בעיקר סטרילי רומא עקב אנאפלואידיה. בנוסף, הוא צאצא פורה ששרדו כמה נוטים להיות מלא או בסמוך diploids בתוך כמה דורות. זה סביר, לפחות בחלקו, כי oocytes חלקית מתקן טריזומיה מאת פנקסי כרומוזום השלישית לגוף קוטב meiotic במחלקה הראשונה.

מגבלה בלתי עבירים של פרוטוקול זה היא כי זה לא עובד עבור ביצוע tetraploids של מוטציות המשפיעות על רכיבים של מכונות RNAi כי הם עמידים בפני טיפול RNAi46.

פתרון בעיות:

RNAi rec-8:

כמה שיקולים מכריעים עבור פרוטוקול זה מוצלח. הראשונה היא להשתמש IPTG טריים וצלחות IPTG NMG טרי עבור אינדוקציה של ייצור dsRNA rec-8 חיידקים חיידקים HT115 נושא השיבוט rec-8 (W02A2.6). IPTG הוא רגיש אור וזה חשוב לצמצם חשיפה קלה צלחות. ניתן לאחסן IPTG צלחות עד חודש ב 4 ° C בחושך. שנית, rec-8 (W02A2.6) RNAi HT115 זני חיידקים מן הספריה Ahringer (Kamath ו- Ahringer 2003) הניב הפנוטיפ rec-8 חזקה יותר מאשר אחרים זמינים rec-8 HT115 שיבוטים.

זן tetraploid תחזוקה:

זני tetraploid גדלים באיטיות ומפיקים לכל היותר 50 progenies לכל דור47. כל זני tetraploid מזוהה יציבים יחסית, אך הם יכולים לשבור ולהפוך כאשר דיפלואידי הדגיש (תקשורת אישית ג'ונתן הודג'קין ותצפיות שלנו שלא פורסמו). לכן, חשוב לציין כי כאשר זנים tetraploid גדלים 25 ° c, חום-בהלם, מורעבים, או קפוא, מופשר, הם יכולים במהירות לחזור diploidy, לכן חשוב להמשיך לאסוף את החיות לון כאשר מפשירה זנים אלו או כאשר חשיפת זנים אלו בתנאים מלחיצים שעלולות לגרום להם לחזור.

יישומים אפשריים:

חקירה של האפקט או את התפקיד של כל הגנום polyploidization האבולוציה, מחזור התא, ביטוי גנים ופיתוח אורגניזמים רב תאיים הסתמכה על השוואות בין: תאים באורגניזם המכילים פלואידיות שונים, באותו התא סוגי קשר הדוק מינים עם פלואידיות שונים, או מינים אשר עברו האירועים polyploidization האחרונים אבולוציונית, בידוד פיזי3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. למרות tetraploids יכול להיגזר דג זברה ומערכות מודל של העכבר, הצאצאים שלהם הם סטרילי או קטלני embryonically16,17. בנוסף, המערכות הללו דגם יש מחזורי החיים הארוכים, בהשוואה ל- C. elegans, ואת השיטות הזמינות כדי ליצור חיות polyploid הן מורכבות ולא יעיל. לכן, זנים של C. elegans נגזר על ידי שיטה זו תהיה אינסטרומנטלי לקדם כל חקירה על תופעות ועל תפקידיה של כל הגנום polyploidy אורגניזמים רב תאיים.

מאז triploid הנגזרות של tetraploid על ידי חוצה את tetraploid המקורי דיפלואידי, השוואה בין diploids, triploids tetraploids זה רק נבדלים מספר העותקים הגנום, מספק הזדמנות ייחודי וחסר תקדים הערכת שווי ערך חיות/איברים/תאים עם גודל הגנום שונים (או מנה ג'ין). גמישות ונוחות ערכת המתוארים כאן אפשרה לנו ליצור עשרות זנים tetraploid מרקע גנטי דיפלואידי או karyotypes. כמה זנים אלה שימשו כבר למנגנונים שאילתה של כרומוזום הומולוגי זיווג, synapsis במהלך המיוזה27.

זני tetraploid פראי סוג של מוטציה נושא סמנים פלורסנט תספק דרכים חדשות חקירה כדי להבין את קשרי הגומלין בין יחס הגודל של גרעיני/ציטוזול הגנום על החיה תאיים/סלולרי/עוגב ו כל שינוי קנה מידה, הגנום כולו polyploidization על הסתגלות, היווצרות המינים, מנה ג'ין, ביטוי ופיתוח רקמות ו עוגב. בנוסף המחקר של שינוי קנה מידה ביולוגית, הדור של זנים tetraploid יהיה משמעותי נוסף שאילתות של שאלות עקרוניות ביולוגיים הרלוונטיים יציבות הגנום איתות, חוץ-תאית, endoreduplication, הגנום כולו שכפול, ג'ין המינון, הסתגלות ללחץ, התפתחות של עמידות סמים, ואת מנגנון היווצרות המינים...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למרכז גנטיקה Caenorhabditis (במימון המכון הלאומי לבריאות (NIH) במשרד של מחקר תשתית תוכניות P40 OD010440) עבור זנים. המחברים רוצה להודות בטיסט Roelens, אלי Lessman, סיפק לנו משוב בונה, המעבדה מנו ב CCNY, הנטר לשימוש של המעבדה שלהם עבור חלק הצילומים ועבור סיוע שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרס PSC-הנטר TRADB-46-113 ולהעניק NIH 1SC2GM118275-01. טרשת נפוצה מומן בחלקו על ידי מוסד קנדי מלגת פוסט-דוקטורט בריאות (CIHR), E.K. נתמכה על ידי עלייה NIH/NIGMS הענק GM062981.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Motic Microscopy SMZ171
Name Company Catalog Number Comments
NGM agar plates
60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile Tritech Research T3305
35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile Tritech Research T3500
Bacteriological Agar, 5 kg VWR 89140-850
Sodium Chloride, Biotechnology Grade VWR 97061-278
Peptone, BD Bacto VWR 90000-368
Ampicillin Trihydrate VWR 97062-300
IPTG, dioxane-free Thermo Scientific R0391
Name Company Catalog Number Comments
Growth Culture
LB Lennox Broth IBI Scientific 89126-176
Name Company Catalog Number Comments
LB Agar plates
LB Agar Lennox IBI Scientific 89126-182
Name Company Catalog Number Comments
Antibiotics
Ampicillin Trihydrate VWR 97062-300
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Name Company Catalog Number Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate Biotium 40045
DAPI Biotium 40011
Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP Koptec, VWR 89125-166
Name Company Catalog Number Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade VWR 97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade VWR 97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate Fisher Scientific AC271750025
Name Company Catalog Number Comments
RNAi Clones
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA Source Bioscience W02A2.6
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA Dharmacon RCE1182-202299820

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ricke, R. M., van Ree, J. H., van Deursen, J. M. Whole chromosome instability and cancer: a complex relationship. Trends Genet. 24, 457-466 (2008).
  2. Frawley, L. E., Orr-Weaver, T. L. Polyploidy. Curr Biol. 25, R353-R358 (2015).
  3. Orr-Weaver, T. L. When bigger is better: the role of polyploidy in organogenesis. Trends Genet. 31, 307-315 (2015).
  4. Otto, S. P. The evolutionary consequences of polyploidy. Cell. 131, 452-462 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The Causes and Consequences of Polyploidy in Normal Development and Cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Adams, K., Wendel, J. Novel patterns of gene expression in polyploid plants. Trends Genet. 21, 539-543 (2005).
  7. Adams, K. L., Wendel, J. F. Polyploidy and genome evolution in plants. Curr Opin Plant Biol. 8, 135-141 (2005).
  8. Berman, J. Ploidy plasticity: a rapid and reversible strategy for adaptation to stress. FEMS Yeast Res. 16, (2016).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of Intracellular Scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Breneman, A., Cande, J., Dunn, J., Burbank, K., O'toole, E. Genome-wide genetic analysis of polyploidy in yeast. Nature. 443, 541-547 (2006).
  11. Kuznetsova, A. Y., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell Cycle. 14, 2810-2820 (2015).
  12. Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Meyer, A. Genome duplication, divergent resolution and speciation. Trends Genet. 17, 299-301 (2001).
  13. Younis, A., Hwang, Y. -J., Lim, K. -B. Exploitation of induced 2n-gametes for plant breeding. Plant Cell Rep. 33, 215-223 (2014).
  14. Ihssen, P. E., McKay, L. R., McMillan, I., Phillips, R. B. Ploidy Manipulation and Gynogenesis in Fishes: Cytogenetic and Fisheries Applications. Trans Am Fish Soc. 119, 698-717 (2011).
  15. Stanley, J. G., Allen, S. K., Hidu, H. Polyploidy induced in the American oyster, Crassostrea virginica, with cytochalasin B. Aquaculture. 23, 1-10 (1981).
  16. Eakin, G. S., Behringer, R. R. Tetraploid development in the mouse. Dev Dyn. 228, 751-766 (2003).
  17. Heier, J., Takle, K. A., Hasley, A. O., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate cleavage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
  18. Arnold, B., Kim, S. -T., Bomblies, K. Single Geographic Origin of a Widespread Autotetraploid Arabidopsis arenosa Lineage Followed by Interploidy Admixture. Mol Biol Evol. 32, 1382-1395 (2015).
  19. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538, 336-343 (2016).
  20. Gallardo, M. H., Bickham, J. W., Honeycutt, R. L., Ojeda, R. A., Köhler, N. Discovery of tetraploidy in a mammal. Nature. 401, 341 (1999).
  21. Hodgkin, J. Primary sex determination in the nematode C. elegans. Development. 101, Suppl . 5-16 (1987).
  22. Madl, J. E., Herman, R. K. Polyploids and sex determination in Caenorhabditis elegans. Genetics. 93, 393-402 (1979).
  23. Nigon, V. Polyploidie experimentale chez un nematode libre, Rhabditis elegans maupas. Bull Biol Fr Belg. 95, 187-225 (1951).
  24. Woodruff, G. C., Eke, O., Baird, S. E., Félix, M. -A., Haag, E. S. Insights Into Species Divergence and the Evolution of Hermaphroditism From Fertile Interspecies Hybrids of Caenorhabditis Nematodes. Genetics. 186, 997-1012 (2010).
  25. Mlynarczyk-Evans, S., Roelens, B., Villeneuve, A. M. Evidence That Masking of Synapsis Imperfections Counterbalances Quality Control to Promote Efficient Meiosis. PLoS Genet. 9, e1003963 (2013).
  26. Lozano, E., Sáez, A. G., Flemming, A. J., Cunha, A., Leroi, A. M. Regulation of Growth by Ploidy in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 16, 493-498 (2006).
  27. Roelens, B., Schvarzstein, M., Villeneuve, A. M. Manipulation of Karyotype in Caenorhabditis elegans Reveals Multiple Inputs Driving Pairwise Chromosome Synapsis During Meiosis. Genetics. 201, 1363-1379 (2015).
  28. Martinez-Perez, E., et al. Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion. Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).
  29. Severson, A. F., Ling, L., van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes Dev. 23, 1763-1778 (2009).
  30. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
  31. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).
  32. MacQueen, A. J., et al. Chromosome Sites Play Dual Roles to Establish Homologous Synapsis during Meiosis in C. elegans. Cell. 123, 1037-1050 (2005).
  33. Martinez-Perez, E., et al. Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion. Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).
  34. Schvarzstein, M., Wignall, S. M., Villeneuve, A. M. Coordinating cohesion, co-orientation, and congression during meiosis: lessons from holocentric chromosomes. Genes Dev. 24, 219-228 (2010).
  35. Kim, S., Spike, C., Greenstein, D. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. New York, NY. 277-320 (2013).
  36. Peters, N., et al. Control of mitotic and meiotic centriole duplication by the Plk4-related kinase ZYG-1. J Cell Sci. 123, 795-805 (2010).
  37. Pasierbek, P. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes Dev. 15, 1349-1360 (2001).
  38. Hodgkin, J. Primary sex determination in the nematode C. elegans. Development. 101, 5-16 (1987).
  39. Flemming, A. J., Shen, Z. -Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 5285-5290 (2000).
  40. Meneely, P. M. Sex determination in polyploids of Caenorhabditis elegans. Genetics. 137, 467-481 (1994).
  41. Whangbo, J. S., Hunter, C. P. Environmental RNA interference. Trends Genet. 24, 297-305 (2008).
  42. Imae, R., Dejima, K., Kage-Nakadai, E., Arai, H., Mitani, S. Endomembrane-associated RSD-3 is important for RNAi induced by extracellular silencing RNA in both somatic and germ cells of Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 28198 (2016).
  43. Tijsterman, M., May, R. C., Simmer, F., Okihara, K. L., Plasterk, R. H. A. Genes required for systemic RNA interference in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 14, 111-116 (2004).
  44. Cortes, D. B., McNally, K. L., Mains, P. E., McNally, F. J. The asymmetry of female meiosis reduces the frequency of inheritance of unpaired chromosomes. Elife. 4, e06056 (2015).
  45. Vargas, E., et al. Autosomal Trisomy and Triploidy Are Corrected During Female Meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207, 911-922 (2017).
  46. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  47. Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. , University of Oxford. (2005).
  48. Schoenfelder, K. P., Fox, D. T. The expanding implications of polyploidy. J Cell Biol. 209, 485-491 (2015).
  49. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, a019166 (2015).
  50. Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Braasch, I., Meyer, A. Comparative genomics provides evidence for an ancient genome duplication event in fish. Philos Trans Royal Soc B. 356, 1661-1679 (2001).

Tags

גנטיקה גיליון 133 Polyploidy Caenorhabditis elegans rec-8 RNAi מיוזה endoreduplication שכפול הגנום כולו גודל הגנום מנה ג'ין ביולוגית קנה המידה אי יציבות גנומית
מניפולציה של פלואידיות ב <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Clarke, E. K., Rivera Gomez, K. A.,… More

Clarke, E. K., Rivera Gomez, K. A., Mustachi, Z., Murph, M. C., Schvarzstein, M. Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (133), e57296, doi:10.3791/57296 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter