Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Manipulering av Ploidy i Caenorhabditis elegans

Published: March 15, 2018 doi: 10.3791/57296
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3, 1,2,3
1Brooklyn College, Biology Department, City University of New York, 2The Graduate Center, Biology Department, City University of New York, 3Advanced Science Research Center, City University of New York

Summary

Denne metoden tillater generering av tetraploid og triploid Caenorhabditis nematoder fra diploide belastning. Polyploid stammer generert av denne metoden har blitt brukt til å studere kromosom interaksjoner i meiotic prophase, og denne metoden er nyttig for å undersøke viktige grunnleggende spørsmål i cellen, utviklingsmessige, evolusjonær, og kreft biologi.

Abstract

Mekanismer som involverer hele genomet polyploidy spille viktige roller i utviklingen og utvikling; en unormal generasjon av tetraploid celler har også vært forbundet med både progresjon av kreft og utvikling av resistens. Inntil nå har det ikke vært mulig å lett manipulere ploidy av flercellede dyr uten å generere mest sterilt avkom. Presentert her er en enkel og rask protokoll for å generere tetraploid Caenorhabditis elegans dyr fra diploide belastning. Denne metoden lar brukeren opprette en skjevhet i kromosom segregering under meiose, til slutt øke ploidy i C. elegans. Denne strategien er avhengig av forbigående reduksjon av uttrykk for rec-8 genet å generere diploide gameter. En rec-8 mutant produserer diploide gameter som kan potensielt produsere tetraploids etter befruktning. Denne medgjørlig ordningen har blitt brukt til å generere tetraploid stammer bærer mutasjoner og kromosom rearrangements å få innsikt i chromosomal dynamikk og interaksjoner under sammenkoblingen og Adept i meiose. Denne metoden er effektiv for å generere stabil tetraploid stammer uten genetiske markører, kan brukes på diploide belastning, og kan brukes til å utlede triploid C. elegans. Denne enkle metoden er nyttig for å undersøke andre grunnleggende biologisk spørsmål gjelder genomet ustabilitet, gene dosering, biologiske skalering, ekstracellulære signalering, tilpasning stress, utvikling av resistens mot narkotika, og mekanismer for artsdannelse.

Introduction

Hele genomet polyploidy finnes i naturen og er ofte et nødvendig skritt i tilpasning, artsdannelse, organogenesen, sårheling og biologiske skalering; Det er også kjent for å fremme både kreft og motstand mot narkotika1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. landbruks-og fiskeri generere polyploid planter, fisk og skalldyr ved kjemisk behandling (f.eks, colchicine og orzalin) å få raskere vekst og større avlinger og husdyr13, 14,15. Eksperimentelle og ineffektiv produksjon av tetraploids finnes for de mus og sebrafisk modell systemer16,17. Imidlertid er de fleste eller alle polyploid flercellede dyr generert embryonically dødelig eller sterile og dermed ikke ideelt for laboratoriestudier på effekter av polyploidy i en flercellet organisme. Derfor er noen forståelse av hele genomet polyploidization i multicellular organismer begrenset til nært beslektede arter evolusjonære siste polyploidization hendelser18,19,20 . En bane til å fremme spørsmål av rollen biologiske eller konsekvenser av polyploidization er bruk av C. elegans modell systemet. Viktigere, C. elegans er et tett genetisk system som vanligvis finnes som en diploide, inneholder bare fem autosomes (A) og en sex-kromosom (X) per genom, er gjennomsiktig tillater i vivo observasjon av biologiske prosesser, og har en kort livssyklus av 3-4 dager (fra egg til seksuell modne voksen). C. elegans har vist seg å kunne reprodusere som et tetraploid, som er den vanligste typen av hele genom polyploidy i naturen. Triploid dyr kan genereres ved krysset tetraploids med diploids, men deres ploidy er ikke stabil, og stammer blir diploide innen et par generasjoner.

I de siste tiårene bare en håndfull av levedyktig og fruktbare C. elegans tetraploids stammer ble isolert i laboratoriet, bruke en strategi som er arbeidskrevende og genererer bare begrenset typer stammer21,22, 23. denne strategien genererer C. elegans tetraploids av varme-sjokk behandlinger, som antagelig påvirker kromosom segregering i kjønnscellene, etterfulgt av en screening for antatte polyploid dyr med genetiske markører. Disse tetraploids var svært nyttige innlegg av hvordan denne Rundormer bestemmer om å bli mann eller Hermafroditt. Senere studier brukt de tilgjengelige stammene for å undersøke vekst, gene dose, og regulering av Adept under meiose i denne Rundormer21,24,25,26. Dessverre var disse studiene begrenset av vanskeligheten i å generere nye tetraploid stammer og bakgrunn genetiske markører disse stammer inneholdt. Vist her er en enkel og rask protokoll generere stabil tetraploids, som har blitt brukt til å generere stammer å studere regulering av Adept under meiose27.

Som i naturen, kan polyploidization oppstå ved dannelsen av diploide i stedet for haploid gameter. Våre funn at en meiose-spesifikke cohesin komponent mutant rec-8 genererer diploide sperm og oocytes indikerte at banket ned rec-8 genet vil føre til produksjon av tetraploid avkom (figur 1)27, 28,29. Genererer tetraploid stammer bare involverer banket ned rec-8 av RNA-interferens (RNAi) i to generasjoner for phenocopy rec-8 mutant diploide gameter. Antatte polyploids kan lett identifiseres av deres lengre enn normal kroppsbygning. Polyploids er bekreftet som fullstendig eller delvis tetraploids ved å telle antall kromosomer per kjerne når stabil linjer er etablert.

Strategien beskrevet her kan generering av stabile tetraploid Caenorhabditis Rundormer stammer fra første diploide genetisk bakgrunn eller karyotype uten bruk av genetiske markører. Siden denne protokollen er mer effektiv, allsidig og enkel enn ordningen tidligere, vil det utvide verktøyene som trengs spørre rollene til polyploidization i grunnleggende prosesser utvikling, genomet stabilitet og utviklingen i flercellet organismer. Bare overskuelig begrensning i bruk av denne protokollen er genetisk bakgrunn motstandsdyktig mot RNAi.

Protocol

1. sette opp rec-8 RNAi (dag 1-3 i figur 2)

Denne protokollen er endret fra Kamath og Ahringer30.

  1. For induksjon av rec-8 dsRNA uttrykk i Escherichia coli, forberede Rundormer vekst Medium (NGM) agar plater31 supplert med en siste konsentrasjon av 1 mM isopropyl-β-D-2-thiogalactopyranoside (IPTG) og 100 µg/mL Ampicillin. Lagre i mørket på 4 ° C før bruk, 4 uker.
  2. Strek HT115 bakterier bærer rec-8 (W02A2.6) klone fra Ahringer laboratorium biblioteket30 rec-8 klone på Luria kjøttkraft (LB) plater med 100 µg/mL ampicillin og 50 µg/mL tetracycline. Vokse over natten i en shaker på 37 ° C.
  3. På dag 1, vaksinere enkelt kolonier fra ferske stripete enkelt koloniene av HT115 E. coli bakterier frakte rec-8 RNAi klone inn 4 mL LB inneholder 100 µg/mL ampicillin og 50 µg/mL tetracycline. Vokse bakterier kulturen overnatter i en shaker eller en berg tromme på 37 ° C.
  4. Neste morgen (dag 2), indusere produksjon av dobbel strandet (ds) RNA rec-8 W02A2.6 i HT115 bakteriell kultur ved å legge en siste konsentrasjon av 1 mM IPTG og rister for 40 min på 37 ° C.
  5. Etter innledningen, frø NGM/IPTG plater med 100-200 µL HT115 rec-8 bakterier og lagre plater ved romtemperatur i den mørke natten (dag 3).
  6. Neste morgen (dag 4), legge til ønskede Rundormer belastningen indusert HT115 rec-8 bakterier platene som beskrevet i trinn 2.1 nedenfor.

2. generere og isolere Tetraploids (dag 4-16 i figur 2)

  1. På dag 4, plassere 3-4 unge L4 (fjerde) larvestadiet hermafroditter for ønsket diploide belastningen på NMG/IPTG platene plantet med HT115 rec-8 bakterier som var blitt indusert dagen før (trinn 1.5, ovenfor). Vokse nematoder på 15 ° C i mørket.
  2. Gjenta trinn 1.3 og 1.4 starter 3 dager etter trinn 2.1, som vil være tre dager før første avkommet (F1s) fra trinn blir L4s. Tidspunktet for dette trinnet avhenger av hvor raskt en Rundormer belastning vokser på 15 ° C. Noen diploide mutant stammer er treg dyrkere og dette tidspunktet vil trenger fine tuning for å isolere tetraploids.
  3. På dag 8 (etter 4 dager rec-8 RNAi fôring behandling), overføre 20 (2 hermafroditter/bensin fat) av F1 (første filial generasjon) L4 hermafroditter dyrket i HT115 rec-8 bakterier på fersk indusert HT115 rec-8 RNAi og la dem til self-fertilize.
    1. Alternativt indusert overføring 20 av F1 L4 hermafroditter dyrket i HT115 rec-8 bakterier på fersk HT115 rec-8 RNAi bakterier sammen med ubehandlet menn av den samme stammen (2 hermafroditter med 4-6 menn/plate).
  4. På dag 13, start screening for F2 (andre filial generasjon) avkom som vises lang (len) eller generelt større enn vill-type; deretter overføre enkelte Lon dyr på vanlige OP50 eller HB101 stammer av E. coli bakterier. Fortsette screening F3 (tredje filial) avkom; men F3 avkom fra samme plate kan ikke vurderes uavhengig stammer hvis de blir etablert, fordi de kan være søsken fra samme etablert allerede F2 mor.
    Merk: Antatte tetraploids identifiseres enkelt fordi de er klart mer enn diploids. Wild type hermafroditter er to tredjedeler kortere enn tetraploids. Fordi det er lengre, gjør en tetraploid kropp en ekstra sving når den beveger seg fremover ved å generere sinusformet kroppen-bøying bølger fra hodet til hale (figur 3A).
  5. Tillate Lon ormer self-fertilize og spre ved å plukke Lon avkom til bare Lon avkom er far i fravær av rec-8 RNAi behandling. Dette kan ta to til tre flere generasjoner. Lon ormer ofte er sterile og gir ikke avkom.

3. bekrefter Tetraploid stammer (film 1 og figur 3A, B)

Merk: Tetraploid stammer kan valideres ved å telle antall kromosomer i deres 5mas oocytes. Fluorescerende mikroskopi kan brukes til skjermen for antall kromosom par i 5mas diploide oocytes (før meiotic divisjonene), hvis belastningen har en fluorescerende markør for kromosomer. I fravær av fluorescerende kromosom markører, kan tetraploid nematoder bli vist ved å feste nematoder og flekker med en DNA fargestoff; se nedenfor for en protokoll for etanol feste og hele-dyr 4, 6-Diamidine-2 '-phenylindole dihydrochloride (DAPI) flekker.

  1. Hele dyr DAPI flekker
    Merk: Tetraploid stammer bærer 12 tilkoblede kromosom-parene kan valideres av DAPI flekker disse dyrene og telle antall DAPI organer i sin 5mas oocytes.
    1. Sted 5 til 10 µL av M9 buffer31 på et mikroskop lysbilde, deretter overføre 6-10 nematoder til drop.
    2. Under dissecting mikroskop, tegne mesteparten av M9 fra rullegardinmenyen uten å fjerne nematoder med en lofri rengjøring vev. Deretter umiddelbart legge en 10 µL dråpe 90% etanol på ormer. Tillate ormer tørke helt, men for ikke lenger enn et par sekunder.
    3. Så snart etanol fordamper (dette kan sees som det skjer under dissecting mikroskopet), legge til en ekstra 10 µL av 90% etanol på ormer.
    4. Gjenta trinn 3.1.3 tre ganger.
    5. Når den siste dråpen av etanol har fordampet, legge 6 µL DAPI eller Hoechst fargestoff på anbefalte siste konsentrasjonen i montering media valgfrihet (for eksempel en 1:1,000 fortynning av en 2 ng/µL DAPI lager konsentrasjon i M9). For langtidslagring av lysbildene, kan 0,5% p-phenylenediamine oppløst i 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, i 90% glyserol som en antifade løsning, i stedet for M9, brukes.
    6. Dekke ormer på lysbildet med en dekkglassvæske og forsegle kantene på dekkglassvæske med neglelakk. Score i fluorescens mikroskop (trinn 3.1.7) minst 10 min etter dekkglassvæske. Lysbilder uten antifade kan lagres i et par dager på 4 ° C før scoring, men kvaliteten på fluorescens begynner å synke etter noen dager.
    7. Bruke lysstoffrør mikroskop på 100 X forstørrelse, score antall enkelt DAPI organer (antagelig enkelt kromosom par) i de mest voksne 5mas oocyte, som ligger umiddelbart ved siden av spermatheca og har ennå ikke angitt i spermatheca eller livmoren.
      1. For å score personlige DAPI organer innen en oocyte kjernen, bruk visningskroppen finskruen for å flytte langsomt fra toppen av oocyte kjernen til bunnen under telling. Deretter telle samme kjernen mens du flytter fokus i motsatt retning (dvs.fra bunnen til toppen av kjernen) å bekrefte antall DAPI organer.
    8. Score de mest voksne 5mas oocyte i hver av de to gonader i minst ti hermafroditter per stabil Lon belastning. Wild type oocytes har 6 DAPI organer på gjennomsnittet, 5 autosome par og sex-kromosom paret. Tilstedeværelsen av 12 DAPI organer i oocyte stabil Lon stammer indikerer at dyrene i denne belastningen er delvis (4 sett med Autosomes, 3 X-chromosomes) eller komplett (4 sett med Autosomes, 4 X-chromosomes) tetraploids.
    9. Beregne gjennomsnittlig antall DAPI organer fra flere (minst 10) oocytes per belastning. Noen kromosom-parene vil berøre eller rett på toppen av hverandre, slik at antall DAPI organer i en oocyte er ofte mindre enn det faktiske antallet kromosom-parene.
    10. (Valgfritt) Videre validere stabil Lon stammer der gjennomsnittlig antall DAPI organer er 12 for å teste om de er fullt (4A, 4 X) eller delvis (4A, 3 X) tetraploids av immunofluorescence flekker mot kromosom aksen proteiner som HTP-332. Denne flekker vil skille kromosom-parene ved å vise en korsformet mønster fra enkelt usammenhengende kromosomer i den delvis tetraploid.

Representative Results

Nedskrivning av rec-8 Meiotic Cohesin komponent funksjon resultater i Diploid gameter:

Imaging av meiotic divisjoner av cohesin komponent mutant rec-8 avslørt sperm og oocytes mulig mekanismer for å generere tetraploid dyr (figur 1)27,29,33. Mechanistically, er meiotic divisjon defekter rec-8 mutant sæd og oocyte annerledes; men produseres både mannlige og kvinnelige diploide gameter av rec-8 mutant.

I vill type meiose, homologe kromosomer bli midlertidig koblet til hverandre med crossover rekombinasjon og angi første meiotic divisjon som en enhet eller bivalent (figur 1A)34. Under de første divisjonen, homologe kromosomer (homologs) skille fra hverandre, mens søster chromatids i hver homolog fortsatt sammen til divisjon. Selv om mønsteret av kromosom segregering er det samme i kvinnelige og mannlige gameter, er oocyte divisjoner asymmetrisk mens spermatocyte divisjoner er symmetrisk og gjennomgå en spesialisert cytokinesis. I hver divisjon forkaster oocyte halvparten av divisjon produktet i en liten polar kropp. Dermed gir hver oocyte forløper opphav til en enkelt haploid oocyte og to polar organer (figur 1B, C)35. Derimot gir en enkelt spermatocyte forløper opphav til fire funksjonelle spermatids ved gjennomgår to symmetriske divisjoner. Divisjon kulminerer med fire spermatids spirende av fra en gjenværende kroppen. Denne cytokinesis er spesielle i at mønsteret og nummeret av spermatids bestemmes av centrosomes36.

I forløperen til rec-8 mutant kjønnscellene, crossover rekombinasjon mellom homologe kromosomer finner ikke sted og homologs er ikke koblet som en bivalent i begynnelsen av den første meiotic divisjon29,34. Søster chromatids av hver homolog skille fra hverandre i de første divisjonen i stedet for gjenværende sammen til divisjon, som i vill type gameter. Interessant, er rec-8 mutant fenotypen under divisjon forskjellig i mannlige og kvinnelige gameter ved at oocytes mislykkes å gjennomgå cytokinesis mens spermatocytes gjennomgår en relativt normalt cytokinesis (figur 1B- F) 27 , 28 , 29. diploid oocytes oppstår fordi i divisjon mislykkes de både kromosom segregering og cytokinesis, derav de ikke extrude andre polar kroppen (figur 1B, C). Spermatocytes i rec-8 germlines gjennomgår spermatid spirende eller cytokinesis, men ofte skille settene av kromosomer til en av spermatids til en diploide spermatid og en spermatid mangler chromatin (figur 1 d- F)27. Kvantifisering av andelen rec-8 sperm mangler chromatin er vist i figur 1F.

Dannelsen av kvinnelige og mannlige diploide gameter i rec-8 mutanter foreslått at dette mutant fenotypen potensielt kan brukes til å generere full genomet tetraploid stammer.

Generasjon av Tetraploid C. elegans stammer:

Tilstedeværelsen av en mutasjon i rec-8 genet i alle de genererte tetraploid stammene kan unngås ved transiently banket ned rec-8 av RNAi29,37. Dette forutsetter at reduksjon av rec-8 funksjonen ved RNAi vil generere diploide gameter som potensielt kan gi opphav til hele genomet tetraploid dyr, som rec-8 mutanter29,37. Avgjørende for denne protokollen er at rec-8 mutanter både gi opphav til diploide gameter og sire rimelig mange unge, i motsetning til andre meiotic mutanter, som gir opphav til aneuploid gameter og mest sterile eller embryonale/larver dødelige.

Flere tetraploid stammer ble generert av fôring C. elegans bakterier uttrykke rec-8 dsRNA ved hjelp av én av to strategier (se protokollen, figur 2og tabell 1)27. Tetraploids kan genereres ved selv gjødslende hermafroditter i to til tre generasjoner i Petri retter med bakterier uttrykke rec-8 dsRNA. Denne strategien en Hermafroditt plasseres i ferske er laget rec-8 RNAi plater og dens avkom overført noen dager senere på nye plater med fersk indusert rec-8 RNAi uttrykke bakterier (se Protocol). I tillegg kan tetraploids genereres gjennom krysset den første generasjonen av hermafroditter matet bakterier uttrykke rec-8 dsRNA med ubehandlet menn av samme genotype Petri retter med bakterier uttrykke rec-8 dsRNA ( Figur 2). I dette tilfellet utsatt menn i korset for rec-8 RNAi bakterier fra L4 scenen, under paringen. Begge oppsettene gir opphav til tetraploid dyr27. Tabell 1 viser tetraploid stammer får ordningen presenteres her. Triploid og tetraploid C. elegans er større enn diploids, men triploid stammer ustabile og tendens til å bli diploide i en eller to generasjoner, mens tetraploid stammer er relativt stabil22,23. Antatte tetraploid stammer ble identifisert som større enn de opprinnelige belastning (len) hermafroditter som far bare Lon avkom (figur 3A). Lon dyr er lett identifiseres - wild type diploide dyrene er to tredjedeler av tetraploids og kroppen gjør ikke en ekstra bøy, noe som kan bli lagt merke til under sin frem sinusformet bevegelse (figur 3A).

Tetraploid stammer ble bekreftet av screening for tilstedeværelsen av 12 kromosom par i oocytes de tetraploid hermafroditter sammenlignet med seks kromosom par i oocytes diploide hermafroditter (figur 3B, Cog film 1).

Tetraploid klasser:

To typer tetraploid hermafroditter ble identifisert: en far menn på lignende frekvenser som diploide hermafroditter, og den andre far menn på mye høyere frekvenser (tabell 1). Disse to typer tetraploid hermafroditter har vist skiller seg ved at klasse produsere frekvensene ligner de av diploide menn er tetraploid for alle sine kromosomene (4A, 4 X), mens klasse produsere høye frekvenser av menn hermafroditter som er tetraploid for autosomes men triploid for sex-kromosom (4, 3 X). Senere klasse tetraploids er stabile og produsere 4A, 3 X hermafroditter og 4A, 2 X menn.

Tetraploid stammer vokser saktere og produsere redusert Foreldreomsorg og yngelens størrelse sammenlignet med diploids de er avledet fra, sett for stammer generert med den forrige metoden22,23. Madl og Herman22 antydet at økte andelen døde embryo i tetraploid toner kan være aneuploidy i oocyte, men overfladisk inspeksjon av tetraploid stammer ikke avsløre tilstrekkelig hevet antall aneuploid oocytes eller unormal oocytter og spermatocyte divisjoner til kontoen for den observerte reduksjonen i Foreldreomsorg og yngelens størrelse (Movie 2og Figur 3 c, D).

Figure 1
Figur 1: Gametogenesis i rec-8 mutant innebærer mulig mekanismer for å generere stabil polyploid flekker. (A) Diagram av kromosom organisasjon og segregering mønsteret i vill type og rec-8 mutant meiotic divisjoner. I vill type meiose separat homologe kromosomer i første meiotic divisjon. Søster chromatids i hver homolog orientere mot samme spindel pole og fortsatt sammen til divisjon. I rec-8 mutanter, homologs utgjør ikke overganger og dermed er tilkoblet ikke. I motsetning til wild type, rec-8 søster chromatids orientere fra hverandre og skille i første meiotic divisjon. (B) Diagram av naturen og mutant oocytes viser kvinnelige pronucleus og ekstrudert polar organer (mannlige pronucleus ikke er avbildet). I vill type oocytes resultere to asymmetrisk meiotic divisjoner i ekstruderingsprosessen to polar organer. I rec-8 mutanter imidlertid andre polar kroppen byggesystemer mislykkes som resulterer i en diploide oocyte. (C) bilder av vill type og rec-8 mutant oocytes uttrykke mCherry::histone H2B. Pilene angir polar kropper i vill type oocyte og en i rec-8 mutant. Skala er 5 µm. (D og E) Live bilder av spermatids fra vill type og rec-8 mutanter uttrykke mCherry::histone H2B (magenta). Pilspisser viser anucleate spermatids. Skala er 2 µm. (D) Spermatocytes gjennomgår (spirende) divisjon wild og rec-8 mutant. Wild type spermatocytes gjennomgå symmetrisk divisjoner som resulterer i fire spirende spermatids, hver med en haploid kromosom supplement. I rec-8 mutant spermatocytes, er kromosom segregering nedsatt i divisjon. Oftest fortsatt en enkelt masse chromatin i gjenværende kroppen (RB) eller i en av to søster spermatids i meiotic divisjon. Dette gir opphav til anucleate rec-8 mutant sperm (angitt med pilspisser) eller diploide sædceller. (E) levende bilder av post spirende spermatids i wild type og rec-8 mutanter visualisert ved hjelp av differensial forstyrrelser kontrast (DIC) og fluorescens mikroskopi. Wild type spermatids alle har lignende chromatid massene. REC-8 mutant spermatids danner anucleate sperm. (F) kvantifisering av vill type og rec-8 mutant anucleate sperm. REC-8 mutanter produsert 38,5% anucleate sæd sammenlignet med mindre enn 1,6% i naturen. Fishers eksakt test angir at en rec-8 mutant har signifikant høyere forekomst av anucleate sperm (p ≤0.0001) sammenlignet med vill-type. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Ordningen for generering og isolere tetraploid C. elegans fra belastning. Pilen til høyre representerer tidslinjen i protokollen fra dag 1 og går videre til dag 17. Lignende resultater kan oppnås ved krysset hermafroditter til ubehandlet menn på dag 9. Parentes koble beskrivelsen av et skritt til tidslinjen. Ubehandlet dyr er oransje, behandlede dyr er røde, Lon dyr er større, rec-8 dsRNA uttrykke bakterier er avbildet gjennomsiktig plater med gjennomsiktig rød bakgrunn og vanlig OP50 bacteria er avbildet på gjennomsiktig grått bakgrunn plater. Prosedyren er gjort på 15 ° C ikke annet er oppgitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Tetraploid eksempler. (A) lyse feltet bilde av en tetraploid (MSC2)-dyr og diploide belastningen er avledet fra (AV740). Tetraploid C. elegans er generelt større og lengre (len) enn diploide. Denne forskjellen i kroppsstørrelse fører til en ekstra sinusformet kurve av kroppen av den bevegelige tetraploid og kan brukes som et kriterium til skjermen for tetraploid derivater. Skala er 0,1 mm. (B, C) fluorescens bilder av diploide (AV740) og tetraploid (MSC1) de fleste eldre 5mas oocyte nulcei, før meiotic divisjonene. Sekundær screening utføres ved å observere antall kromosom par i 5mas oocytes av de etablerte Lon stammene, som vises i filmen 1 en MSC1 belastning uttrykke Mcherry::H2B og GFP::β-Tubulin i germline. Skala bar er 5 µm. (D) bilder fra en tid forfalle (Movie 2) av tetraploid oocyte meiotic divisjoner som viser et generelt vanlig meiose. Pilespisser merke polar organer og en prikket linje markerer cortex på oocyte inne spermatheca og omgitt av sæd; t = tid lapsed i minutter. Skala bar er 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Genotype Tetraploid derivat
(sett med Autosomes: antall X-chromosomes) *		 Foreldrenes stamme
(diploid)
meIs16 [pie-1p::mCherry:: hans-58 + unc-119(+)]; MSC1 (4A:4 X) MSC0
ruIs57 [pie-1p::GFP::b-tubulin + unc-119(+)] MSC2 (4A:3 X)
MSC3 (4A:4 X)
MSC5 (4A:3 X)
MSC6 (4A:4 X)
MSC8 (4A:4 X)
UNC-119(ED3) III; ddIs6; ddIs6 [tbg-1::GFP + unc-119(+)]; ltIs37; ltIs37 [pAA64; pie-1p::mCherry::HIS-58 + unc-119(+)] IV MSC14 (4A:3 X) TMR17
MSC15 (4A:3 X)
MSC16 (4A:4 X)
SPO-11 (me44) / nT1 IV; / nT1 [qIs51 [myo-2::gfp Ppes-10::gfp, PF22B7.9::gfp]] V AV800& AV776
meIs8 [pie-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II; AV809& AV727
ltIs37 [pie-1p::mCherry:: hans-58 + unc-119(+)] IV;
ltIs38 [pie-1p::gfp::ph(PLC1delta1) + unc-119(+)]
meIs8 [pie-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II; mnT12 (X; IV) AV826& AV695
mIn1 [dpy-10(e128) mIs14 [myo-2::gfp PE-10::gfp]] / AV810& DR2078
bli-2(e768) unc-4(e120) II

ruIs32 [pie-1::GFP::H2B + unc-119(+)] III
 AV822& AZ212
AV823&
C. briggsae - mfIs42 [Cel-sid-2 + Cel-myo-2::DsRed] AV824& JU1018

Tabell 1: Tetraploid stammer generert. * Utledet scoret antall bivalents (tilkoblet homologe par) og univalents (personlige homologs) i oocytes før meiotic divisjonene i tillegg til andelen menn far.

Movie 1
Film 1: Screening å bekrefte om stabile Lon stammer er full eller delvis tetraploids. Filmen starter med et diagram av en vill type Hermafroditt utheving regionen fotografert (5mas oocytes) til å identifisere tetraploids ved å telle kromosom-parene. Etter diagrammet, en rekke Z stabel filmer og anslag viser gonader diploide og tetraploid fast og DAPI farget eller live bilder av stammer uttrykke Mcherry::H2B histone. Screening gjøres ved å telle antall tilkoblede homologe kromosomer par i 5mas oocytes. Telling av MCherry eller DAPI farget organer er gjort i den 5mas oocyte nærmest sperm lagre spermatheca (den "-1 oocyte"). Kromosomer i denne oocyte er mest kondensert og atskilt fra hverandre, muliggjør mer nøyaktig homolog par teller. Mer enn 10 dyr per belastningen ble vist for å sikre-1 oocyte kromosom teller var nøyaktig. Stabel tykkelsen er 0,2 µm. Klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 2
Movie 2: Tetraploid oocyte divisjoner ser normal. Tidsforløp dele oocyte tetraploid belastning uttrykke Mcherry::H2B histone og GFP::β-Tubulin. Timing og mønster av inndelingene vises normalt. Bilder tatt hver 2,5 min. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

Produksjon av haploid (n) gameter er nøkkelen til å generere en diploide (2n) zygote ved befruktning. Denne reduksjonen i genomet oppnås under meiose med to påfølgende celledelinger etter en enkelt genomet duplisering. Generere haploid gameter, C. elegans, som med de fleste andre Metazoer, skille moderskap og farskap-avledede homologs i første divisjon, mens søster chromatids fra hver homolog skille i divisjon. En måte at hele genomet polyploidy oppstår i naturen er gjennom generasjon gameter som ikke halvparten genomet størrelsen under meiose.

Det har vært kjent i over 50 år som tetraploid C. elegans nematoder er levedyktig og frodig. Nigon23, og senere Madl og Herman22, genereres og identifisert en håndfull C. elegans tetraploids ved å forstyrre meiotic kromosom segregering bruke varme-sjokk behandlinger og genetiske markører, henholdsvis. Ett ekstra C. briggsae tetraploid belastning avledet bruker denne protokollen over 30 år senere24. Disse tetraploids ble benyttet for å undersøke hvordan C. elegans avgjøre om å bli mann eller Hermafroditt, hvordan ploidy regulerer vekst og størrelse, og analysere sammenkoblingen og Adept i meiose25,26, 38 , 39 , 40. men disse og andre studier som krever bruk av bestemte tetraploids eller triploid stammer var begrenset av vanskeligheten i å generere tetraploid stammer av denne metoden.

Protokoll beskrevet her kan generering av stabil full 4A, 4 X og delvis 4A, 3 X tetraploid Caenorhabditis Rundormer stammer fra noen innledende diploide genetisk bakgrunn eller karyotype uten bruk av genetiske markører.

Tetraploidy kan oppstå med mer enn én mekanisme i C. elegans:

Madl og Herman foreslått at de tetraploid stammene de generert sannsynlig avledet fra en triploid mellomstatus. Deres stammer ble innhentet gjennom valg over flere generasjoner eller ved å krysse den antatte triploid mellomliggende med diploide menn22. Feil i kromosom partisjonering i rec-8 mutanter som gir opphav til diploide oocytes og sperm foreslå en annen mulig mekanisme som tetraploid dyr kan oppstå med rec-8 RNAi ordningen27.

Rec-8 RNAi behandlet hermafroditter kunne produsere diploide oocytes og spermatocytes, som gir opphav til tetraploid dyr etter befruktning. Samsvar med denne muligheten er det faktum at noen av de klonede F2 hermafroditter ga opphav til stabile Lon stammer i neste generasjon, som antyder at de klonede Lon F2 hermafroditter der allerede tetraploid. I krysset ordningen, er den første generasjonen av rec-8 RNAi behandlet hermafroditter krysset med ubehandlet menn. Diploide spermatocytes kan fortsatt oppstå hos menn fordi korset er gjort i nærvær av bakterier uttrykke rec-8 dsRNA og derfor menn er utsatt til rec-8 RNAi under parring i minst 3 dager. Derfor kan Lon polyploids i cross-fertilizing ordningen også har dannet fra befruktning av diploide oocytes av diploide sperm. Stabil tetraploid stammer kan oppstå fra enten fertilisering mellom diploide gameter eller krysset triploid dyr med oocytes av variabel ploidy diploide dyr produserer haploid sperm.

Viktige hensyn:

Selv-versus cross-fertilization ordninger:

Ordningen med selv gjødsling rec-8 RNAi behandlet F1 hermafroditter og ordningen med kryssing av behandlet hermafroditter med ubehandlet menn både ga opphav til 4A, 4 X og 4A, 3 X tetraploid stammer. Selv om flere polyploids ble først isolert fra selv gjødslende ordningen, flere av disse polyploid dyrene ble sterile og dermed begge er like effektiv til å produsere tetraploid stabile stammer. Årsaken til økt suksess og sterilitet i selv gjødslende ordningen er ukjent. Selv om begge er like effektive, er selv gjødslende ordningen lettere som det ikke krever isolasjon av menn for mating. I tillegg når belastningen av interesse er ineffektiv eller defekt på parring, ville selv gjødslende ordningen være å foretrekke. Cross-fertilizing ordningen kan brukes for å generere komplekse tetraploids som inneholder mer enn to versjoner av et enkelt kromosom.

Modifikasjoner og begrensninger:

Foreløpig innebærer denne protokollen rec-8 RNAi behandling av fôring bakterier uttrykke dsRNA for rec-8 genet. Denne protokollen fungerer derfor ikke i Caenorhabditis arter ikke svarer til RNAi av mate, eller mutanter defekt i miljømessige eller systemisk spredning av RNAi mellom vev41,42,43. Dette problemet kan potensielt løses ved å innføre RNAi behandling av direkte injeksjon av dsRNA rundt direkte inn i germline.

Triploid dyr må genereres ved krysset en tetraploid til en diploide dyr som den var avledet, fordi denne ordningen ikke genererer stabil triploid stammer44,45. Bare 15% av eggene var far til ved triploids Luke, og deres avkom er hovedsakelig sterilt avkom på grunn av aneuploidy. I tillegg pleier få overlevende fruktbare avkommet å være full eller nær diploids innen et par generasjoner. Dette er sannsynligvis, iallfall delvis, fordi oocytes delvis retter Trisomi ved å segregere tredje kromosomet i polar kroppen i første meiotic divisjon.

En uoverstigelig begrensningen for denne protokollen er at det ikke fungerer for å gjøre tetraploids av mutanter som påvirker komponenter av RNAi-maskiner fordi de er resistente mot RNAi behandling46.

Feilsøking:

REC-8 RNAi:

Noen er avgjørende for denne protokollen skal lykkes. Først er å bruke fersk IPTG og nystekte IPTG NMG plater for induksjon av rec-8 dsRNA produksjon i bakterier HT115 bakterier bærer klone rec-8 (W02A2.6). IPTG er følsomt for lys, og det er viktig å redusere eksponering til plater. IPTG plater kan lagres til en måned på 4 ° C i mørket. Andre ga rec-8 (W02A2.6) RNAi bakteriell HT115 stammer fra Ahringer-biblioteket (Kamath og Ahringer 2003) en sterkere rec-8 fenotypen enn andre tilgjengelige rec-8 HT115 kloner.

Tetraploid belastning vedlikehold:

Tetraploid stammer vokser svært sakte og produsere minst 50 progenies per generasjon47. Alle identifisert tetraploid stammer er relativt stabile, men de kan bryte ned og bli diploide når stresset (Jonathan Hodgkin personlig kommunikasjon og våre upubliserte observasjoner). Derfor er det viktig å merke seg at når tetraploid stammer er dyrket ved 25 ° C, varme-sjokkert, sultet, eller frosset og tint, de raskt kan gå til diploidy, så det er viktig å velge Lon dyrene ved tining disse stammer eller når utsette disse stammer stressende forhold som kan føre dem til å gå tilbake.

Mulig programmer:

Undersøkelse av effekten eller rollen hele genomet polyploidization i utviklingen, celle syklus, genuttrykk og utvikling i multicellular organismer er basert på sammenligninger mellom: cellene i en organisme som inneholder forskjellige ploidy, samme celle typer i nærstående arter med forskjellige ploidy eller arter som har gjennomgått evolusjonært meritter polyploidization og fysisk isolasjon3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. Selv om tetraploids kan utledes fra sebrafisk og mus modellsystemer, er deres avkom sterile eller embryonically dødelig16,17. Dessuten, disse modellsystemer har lang levetid sykluser sammenlignet C. elegans, og de tilgjengelige metodene til å generere polyploid dyr er kom. C. elegans stammer avledet av denne metoden vil derfor være instrumentell for å fremme en undersøkelse på effekter og roller av hele genom polyploidy i multicellular organismer.

Siden en triploid kan være avledet fra en tetraploid ved å krysse tetraploid til den opprinnelige diploide, gir en sammenligning mellom diploids, triploids og tetraploids som bare avviker i antall genomet eksemplarer, en unik og enestående mulighet til å evaluere tilsvarende dyr/organer/celler med forskjellige genomet størrelse (eller genet dose). Fleksibilitet og brukervennlighet ordningen beskrevet her har tillatt oss å generere dusinvis av tetraploid stammer fra forskjellige genetisk diploide bakgrunner eller karyotypes. Noen av disse stammer var allerede brukt til spørringen mekanismer homologe kromosomer sammenkoblingen og Adept under meiose27.

Wild type og mutant tetraploid stammer bærer fluorescerende markører gir nye muligheter for forespørsel å forstå forholdet mellom genomet størrelse og kjernefysiske/stoffer ratio på intracellulær/mobil/orgel og hele dyr skalering, hele genom polyploidization på tilpasning, artsdannelse, gene dose og uttrykk og vev og organ utvikling. I tillegg til studiet av biologiske skalering vil generering av tetraploid stammer betydelig videre spørringer grunnleggende biologisk spørsmål gjelder ekstracellulære signalnettverk, genomet ustabilitet, endoreduplication, hele genom duplisering, gene dosering, tilpasning til stress, utvikling av resistens mot legemidler og mekanisme artsdannelse.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Caenorhabditis genetikk Center (finansiert av National Institute of Health (NIH) Office for forskning infrastruktur programmer P40 OD010440) for stammer. Forfatterne vil gjerne takke Baptiste Roelens og Eli Lessman, for å gi oss med konstruktive tilbakemeldinger og Mano Lab CCNY, CUNY for bruk av deres laboratorium for en del av filmingen og for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet av en PSC-CUNY award TRADB-46-113 og NIH gi 1SC2GM118275-01. M.S. ble delvis støttet av en kanadisk Institutt for Health (CIHR) postdoktorstipend, og E.K. ble støttet av NIH/NIGMS stige gi GM062981.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Motic Microscopy SMZ171
Name Company Catalog Number Comments
NGM agar plates
60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile Tritech Research T3305
35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile Tritech Research T3500
Bacteriological Agar, 5 kg VWR 89140-850
Sodium Chloride, Biotechnology Grade VWR 97061-278
Peptone, BD Bacto VWR 90000-368
Ampicillin Trihydrate VWR 97062-300
IPTG, dioxane-free Thermo Scientific R0391
Name Company Catalog Number Comments
Growth Culture
LB Lennox Broth IBI Scientific 89126-176
Name Company Catalog Number Comments
LB Agar plates
LB Agar Lennox IBI Scientific 89126-182
Name Company Catalog Number Comments
Antibiotics
Ampicillin Trihydrate VWR 97062-300
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Name Company Catalog Number Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate Biotium 40045
DAPI Biotium 40011
Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP Koptec, VWR 89125-166
Name Company Catalog Number Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade VWR 97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade VWR 97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate Fisher Scientific AC271750025
Name Company Catalog Number Comments
RNAi Clones
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA Source Bioscience W02A2.6
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA Dharmacon RCE1182-202299820

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ricke, R. M., van Ree, J. H., van Deursen, J. M. Whole chromosome instability and cancer: a complex relationship. Trends Genet. 24, 457-466 (2008).
  2. Frawley, L. E., Orr-Weaver, T. L. Polyploidy. Curr Biol. 25, R353-R358 (2015).
  3. Orr-Weaver, T. L. When bigger is better: the role of polyploidy in organogenesis. Trends Genet. 31, 307-315 (2015).
  4. Otto, S. P. The evolutionary consequences of polyploidy. Cell. 131, 452-462 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The Causes and Consequences of Polyploidy in Normal Development and Cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Adams, K., Wendel, J. Novel patterns of gene expression in polyploid plants. Trends Genet. 21, 539-543 (2005).
  7. Adams, K. L., Wendel, J. F. Polyploidy and genome evolution in plants. Curr Opin Plant Biol. 8, 135-141 (2005).
  8. Berman, J. Ploidy plasticity: a rapid and reversible strategy for adaptation to stress. FEMS Yeast Res. 16, (2016).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of Intracellular Scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Breneman, A., Cande, J., Dunn, J., Burbank, K., O'toole, E. Genome-wide genetic analysis of polyploidy in yeast. Nature. 443, 541-547 (2006).
  11. Kuznetsova, A. Y., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell Cycle. 14, 2810-2820 (2015).
  12. Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Meyer, A. Genome duplication, divergent resolution and speciation. Trends Genet. 17, 299-301 (2001).
  13. Younis, A., Hwang, Y. -J., Lim, K. -B. Exploitation of induced 2n-gametes for plant breeding. Plant Cell Rep. 33, 215-223 (2014).
  14. Ihssen, P. E., McKay, L. R., McMillan, I., Phillips, R. B. Ploidy Manipulation and Gynogenesis in Fishes: Cytogenetic and Fisheries Applications. Trans Am Fish Soc. 119, 698-717 (2011).
  15. Stanley, J. G., Allen, S. K., Hidu, H. Polyploidy induced in the American oyster, Crassostrea virginica, with cytochalasin B. Aquaculture. 23, 1-10 (1981).
  16. Eakin, G. S., Behringer, R. R. Tetraploid development in the mouse. Dev Dyn. 228, 751-766 (2003).
  17. Heier, J., Takle, K. A., Hasley, A. O., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate cleavage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
  18. Arnold, B., Kim, S. -T., Bomblies, K. Single Geographic Origin of a Widespread Autotetraploid Arabidopsis arenosa Lineage Followed by Interploidy Admixture. Mol Biol Evol. 32, 1382-1395 (2015).
  19. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538, 336-343 (2016).
  20. Gallardo, M. H., Bickham, J. W., Honeycutt, R. L., Ojeda, R. A., Köhler, N. Discovery of tetraploidy in a mammal. Nature. 401, 341 (1999).
  21. Hodgkin, J. Primary sex determination in the nematode C. elegans. Development. 101, Suppl . 5-16 (1987).
  22. Madl, J. E., Herman, R. K. Polyploids and sex determination in Caenorhabditis elegans. Genetics. 93, 393-402 (1979).
  23. Nigon, V. Polyploidie experimentale chez un nematode libre, Rhabditis elegans maupas. Bull Biol Fr Belg. 95, 187-225 (1951).
  24. Woodruff, G. C., Eke, O., Baird, S. E., Félix, M. -A., Haag, E. S. Insights Into Species Divergence and the Evolution of Hermaphroditism From Fertile Interspecies Hybrids of Caenorhabditis Nematodes. Genetics. 186, 997-1012 (2010).
  25. Mlynarczyk-Evans, S., Roelens, B., Villeneuve, A. M. Evidence That Masking of Synapsis Imperfections Counterbalances Quality Control to Promote Efficient Meiosis. PLoS Genet. 9, e1003963 (2013).
  26. Lozano, E., Sáez, A. G., Flemming, A. J., Cunha, A., Leroi, A. M. Regulation of Growth by Ploidy in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 16, 493-498 (2006).
  27. Roelens, B., Schvarzstein, M., Villeneuve, A. M. Manipulation of Karyotype in Caenorhabditis elegans Reveals Multiple Inputs Driving Pairwise Chromosome Synapsis During Meiosis. Genetics. 201, 1363-1379 (2015).
  28. Martinez-Perez, E., et al. Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion. Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).
  29. Severson, A. F., Ling, L., van Zuylen, V., Meyer, B. J. The axial element protein HTP-3 promotes cohesin loading and meiotic axis assembly in C. elegans to implement the meiotic program of chromosome segregation. Genes Dev. 23, 1763-1778 (2009).
  30. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
  31. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).
  32. MacQueen, A. J., et al. Chromosome Sites Play Dual Roles to Establish Homologous Synapsis during Meiosis in C. elegans. Cell. 123, 1037-1050 (2005).
  33. Martinez-Perez, E., et al. Crossovers trigger a remodeling of meiotic chromosome axis composition that is linked to two-step loss of sister chromatid cohesion. Genes Dev. 22, 2886-2901 (2008).
  34. Schvarzstein, M., Wignall, S. M., Villeneuve, A. M. Coordinating cohesion, co-orientation, and congression during meiosis: lessons from holocentric chromosomes. Genes Dev. 24, 219-228 (2010).
  35. Kim, S., Spike, C., Greenstein, D. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. New York, NY. 277-320 (2013).
  36. Peters, N., et al. Control of mitotic and meiotic centriole duplication by the Plk4-related kinase ZYG-1. J Cell Sci. 123, 795-805 (2010).
  37. Pasierbek, P. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes Dev. 15, 1349-1360 (2001).
  38. Hodgkin, J. Primary sex determination in the nematode C. elegans. Development. 101, 5-16 (1987).
  39. Flemming, A. J., Shen, Z. -Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 5285-5290 (2000).
  40. Meneely, P. M. Sex determination in polyploids of Caenorhabditis elegans. Genetics. 137, 467-481 (1994).
  41. Whangbo, J. S., Hunter, C. P. Environmental RNA interference. Trends Genet. 24, 297-305 (2008).
  42. Imae, R., Dejima, K., Kage-Nakadai, E., Arai, H., Mitani, S. Endomembrane-associated RSD-3 is important for RNAi induced by extracellular silencing RNA in both somatic and germ cells of Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 28198 (2016).
  43. Tijsterman, M., May, R. C., Simmer, F., Okihara, K. L., Plasterk, R. H. A. Genes required for systemic RNA interference in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 14, 111-116 (2004).
  44. Cortes, D. B., McNally, K. L., Mains, P. E., McNally, F. J. The asymmetry of female meiosis reduces the frequency of inheritance of unpaired chromosomes. Elife. 4, e06056 (2015).
  45. Vargas, E., et al. Autosomal Trisomy and Triploidy Are Corrected During Female Meiosis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207, 911-922 (2017).
  46. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  47. Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. , University of Oxford. (2005).
  48. Schoenfelder, K. P., Fox, D. T. The expanding implications of polyploidy. J Cell Biol. 209, 485-491 (2015).
  49. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, a019166 (2015).
  50. Taylor, J. S., Van de Peer, Y., Braasch, I., Meyer, A. Comparative genomics provides evidence for an ancient genome duplication event in fish. Philos Trans Royal Soc B. 356, 1661-1679 (2001).

Tags

Genetikk problemet 133 Polyploidy Caenorhabditis elegans rec-8 RNAi meiose endoreduplication hele-genome duplisering genomet størrelse gene dose biologiske skalering genomisk ustabilitet
Manipulering av Ploidy i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Clarke, E. K., Rivera Gomez, K. A.,… More

Clarke, E. K., Rivera Gomez, K. A., Mustachi, Z., Murph, M. C., Schvarzstein, M. Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (133), e57296, doi:10.3791/57296 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter