इस काम में, nanoprobe आधारित संवेदना के संकेत संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । प्रोटोकॉल मौजूदा nanoprobes कि सोने, चांदी, सिलिका या आयरन ऑक्साइड नैनोकणों से मिलकर की सतह पर chloroauric एसिड की कमी पर आधारित है ।
nanoprobes के उपयोग जैसे सोना, चांदी, सिलिका या आयरन-ऑक्साइड नैनोकणों के रूप में विश्लेषण परख में पहचान रिएजेंट के रूप में उच्च संवेदनशीलता और सुविधाजनक वर्णमिति readout सक्षम कर सकते हैं । हालांकि, नैनोकणों के उच्च घनत्व आम तौर पर पता लगाने के लिए आवश्यक हैं । उपलब्ध संश्लेषण आधारित वृद्धि प्रोटोकॉल या तो सोने और चांदी नैनोकणों तक ही सीमित है या सटीक एंजाइमी नियंत्रण और अनुकूलन पर भरोसा करते हैं । यहां, हम सोने, चांदी, सिलिका, और आयरन ऑक्साइड nanoprobes के वर्णमिति readout को बढ़ाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यह देखा गया कि वर्णमिति संकेत एक 10000 गुना कारक तक सुधार किया जा सकता है । इस तरह के संकेत वृद्धि रणनीतियों के लिए आधार au3 + को au0के रासायनिक कमी है । वहां कई रासायनिक प्रतिक्रियाओं कि au3 + के लिए au0की कमी को सक्षम कर रहे हैं । प्रोटोकॉल में है, अच्छा बफ़र्स और एच2हे2 का उपयोग किया जाता है और यह मौजूदा nanoprobes की सतह पर Au0 के जमाव एहसान, नई गोल्ड नैनोकणों के गठन की हानि में संभव है । प्रोटोकॉल chloroauric एसिड और 2 में एच2ओ2 से मिलकर समाधान के साथ microarray की मशीन के होते हैं-(N-morpholino) ethanesulfonic एसिड पीएच 6 बफर nanoprobe आधारित जांच परख के बाद । वृद्धि समाधान कागज और कांच आधारित सेंसर करने के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध immunoassays में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में एक वाणिज्यिक एलर्जी microarray के लिए विधि के आवेदन द्वारा प्रदर्शन किया । संकेत विकास वृद्धि समाधान और readout नग्न आंखों या कम अंत छवि अधिग्रहण उपकरणों जैसे कि एक टेबल टॉप स्कैनर या एक डिजिटल कैमरा के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है के साथ कम 5 से अधिक गर्मी की आवश्यकता है ।
गोल्ड नैनोकणों (AuNPs) या आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (IONPs) जैसे मैटीरियल्स के प्रयोग ने बेहतर संवेदनशीलता और बहुमुखी प्रतिभा के साथ इस तरह के आवेदनों को संवेदना में अनुमति दी है । 1 विभिन्न लाइगैंडों के साथ नैनोकणों की सतह की सजावट के लिए विकसित तरीकों के ढेर सारे, मात्रा अनुपात करने के लिए अपने उच्च सतह का लाभ लेने के लिए के रूप में, बेहतर संवेदनशीलता के साथ सेंसर के डिजाइन सक्षम है. 2 फिर भी, एक संवेदन उपकरण एक जासूस संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक nanoprobes की संख्या पर निर्भर है । उदाहरण के लिए, 40 एनएम AuNPs के मामले में, यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से एक संकेत प्राप्त करने के लिए, लगभग 90 × 106 nanoprobes के लिए प्रभावी रूप से ब्याज के लक्ष्य का पता लगाने के लिए आवश्यक है । 3 इस nanoprobe घनत्व सीमा संकेत प्रवर्धन के उपयोग के माध्यम से दरकिनार किया जा सकता है । ऐसी रणनीतियों4 कण एकत्रीकरण या ढेर के आधार पर किया जा सकता है, जहां प्रारंभिक nanoprobes के घनत्व पहले पर nanoprobes का एक दूसरा सेट जमा द्वारा वृद्धि हुई है । 5 एक सेंसर सतह पर एक दिए गए स्थान पर नैनोकणों की संख्या में वृद्धि दृश्य या यूवी विज़ संकेत अधिग्रहण की अनुमति देता है । हालांकि, परख की संवेदनशीलता स्वाभाविक nanoprobes के प्रारंभिक सेट की ओर नैनोकणों के दूसरे सेट की लक्ष्यीकरण क्षमता से जुड़ा होगा । अंय रणनीतियों या तो सोने और चांदी nanoprobes के दाग पर भरोसा करते हैं । ६ , 7 धुंधला नैनोकणों की सतह पर चांदी आयनों की कमी के माध्यम से हासिल की है, एक दृश्य या यूवी की तुलना का पता लगाने को सक्षम करने से । 8 ये विधियां मौजूदा गोल्ड या सिल्वर nanoprobes के सिग्नल को potentiating करके सतह अनुनाद plasmon सिग्नल को बढ़ाती हैं, जो कि पार्टिकल ढेर तरीकों के अनुसार द्वितीयक लक्ष्यीकरण घटनाओं पर निर्भर नहीं करती हैं । हालांकि, चांदी धुंधला तरीकों केवल सोने या चांदी nanoprobes के उपयोग के साथ सूचित किया गया है । 8 , 9
2005 में, Zayats एट अल। 10 गोल्ड nanoprobes की सतह पर Au आयनों की कमी की सूचना के लिए सतह plasmon अनुनाद संकेत वृद्धि हुई है । इस एंजाइम पर निर्भर काम में, हाइड्रोजन पेरोक्साइड ग्लूकोज oxidase catalysis द्वारा उत्पंन किया गया था और साथ में cetyltrimethylammonium क्लोराइड chloroauric एसिड की कमी की अनुमति दी ।
हाल ही में वांग एट अल. एक वृद्धि विधि जहां एक सोने की परत मौजूदा nanoprobes की सतह पर उत्पादन किया है की सूचना दी । 11 इन बढ़े nanoprobes सब्सट्रेट 3 ‘, 5, 5 ‘-tetramethylbenzidine (TMB) नग्न आंखों से एक चमकदार नीले रंग के दृश्य को सक्षम करने के खिलाफ उत्प्रेरक गतिविधि की तरह प्रदर्शित peroxidase ।
स्टीवंस एट अल. एक plasmonic एलिसा आधारित परख के विकास की सूचना दी । 12 एक पारंपरिक एलिसा रणनीति के माध्यम से एक प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) का पता लगाने के बाद, catalase के साथ लेबल एक माध्यमिक एंटीबॉडी सेंसर के साथ तैयार किया गया था जिसके बाद सेंसर हाइड्रोजन पेरोक्साइड युक्त समाधान में डूब गया था और chloroauric अम्ल. माध्यमिक catalase-संशोधित एंटीबॉडी की उपस्थिति (सकारात्मक परिणाम) हाइड्रोजन पेरोक्साइड की खपत को बढ़ावा देने, chloroauric एसिड की कमी को धीमा और एक लाल रंग के साथ अर्ध-गोलाकार monodispersed AuNPs उपज होगा । catalase के अभाव-संशोधित एंटीबॉडी (नकारात्मक परिणाम) हाइड्रोजन पेरोक्साइड एकाग्रता बरकरार रहने की अनुमति दी, इस प्रकार तेजी से chloroauric कमी को बढ़ावा देने और बीमार परिभाषित एक नीले रंग के लिए जिंमेदार morphologies के साथ AuNPs उपज/ . हाइड्रोजन पेरोक्साइड, catalase की गतिविधि द्वारा निर्धारित की एकाग्रता, ब्याज की analyte की एकाग्रता के लिए संबंधित होना करने के लिए दिखाया गया था । एक catalase संशोधित माध्यमिक एंटीबॉडी और उत्प्रेरक गतिविधि की शर्तों के नियंत्रण के लिए की जरूरत है कि इस पद्धति की सार्वभौमिकता में बाधा दो कारक हैं । इसके अलावा, सोने के समूहों के गठन, मौजूदा AuNPs से स्वतंत्र, प्रवर्धन रणनीति के लिए पृष्ठभूमि शोर मुद्दों को लागू कर सकते हैं ।
उपर्युक्त तकनीकों, के रूप में अच्छी तरह से कई दूसरों को13,14,15, यह संभव nanoprobe आधारित के लिए बनाया है के लिए पारंपरिक तकनीक के साथ सममूल्य पर पता लगाने की सीमा प्राप्त करने के लिए ।
यहां, एक उपंयास सोने की वृद्धि विधि का प्रदर्शन किया है, जहां एक मौजूदा nanoprobe के संकेत potentiating द्वारा परिलक्षित होता है या एक सतह plasmon अनुनाद संकेत शुरू । पता लगाने के बाद सोने, चांदी, सिलिका या आयरन ऑक्साइड नैनोकणों के उपयोग के साथ किया जाता है, सेंसर 2 में हाइड्रोजन पेरोक्साइड और chloroauric एसिड का एक मिश्रण का एक समाधान के साथ मशीन करने के लिए अनुमति दी है-(N-Morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) पीएच 6 बफर. वृद्धि समाधान में घटकों की सांद्रता मौजूदा nanoprobes की सतह पर Au0 के जमाव के पक्ष के लिए अनुकूलित किया गया । सभी अध्ययन के लिए nanoprobe प्रकार, यानी AuNPs, सिल्वर नैनोकणों (AgNPs), सिलिका नैनोकणों (SiNPs) और IONPs, एक बीमार परिभाषित परत के गठन की उपज या प्रकाश के बिखरने संवर्धित जो एक जासूसी या वृद्धि दिखाई संकेत के परिणामस्वरूप । एक 100 गुना प्रवर्धन कारक के साथ एक संकेत वृद्धि कागज और कांच आधारित microarrays में nanoprobes के लिए प्राप्त किया गया था और इस प्रक्रिया को एक संकेत प्राप्त करने के लिए 5 से कम मिनट लगते हैं । संकेत अधिग्रहण नग्न आंख द्वारा किया जा सकता है, यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी या इमेजिंग कम अंत उपकरण जैसे एक डिजिटल कैमरा या एक टेबल टॉप स्कैनर । इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया है कि इस वृद्धि प्रोटोकॉल आसानी से विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता के बिना एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलर्जी निदान परख में लागू किया जा सकता है ।
वर्तमान में, nanoprobe के साथ परख के लिए संकेत वृद्धि तकनीक आधारित पहचान या तो एंजाइम आधारित है12, नैनोकणों के एक दूसरे सेट की आवश्यकता का पता लगाने nanoprobes21 लक्ष्य या, धुंधला तकनीक के मामले में, करने के लिए सीमित कर रहे है डिटेक्शन जांच के रूप में AuNPs या AgNPs का उपयोग । 22 यहां, एक सरल, तेजी से और एंजाइम मुक्त विधि nanoprobe का पता लगाने के संकेत वृद्धि आधारित परख के लिए वर्णित है । इस विधि के साथ, यह nanoprobes के 4 प्रकार: AuNPs, AgNPs, IONPs और SiNPs द्वारा प्रदान की वर्णमिति संकेत को बढ़ाने के लिए संभव था.
nanoprobes के प्रत्येक सेट के लिए मनाया प्रवर्धन कारक 100 गुना का था, SiNPs के लिए छोड़कर जहां ठहराव वृद्धि कारक के पूर्व वृद्धि संकेतों की कमी के कारण संभव नहीं था । इस वृद्धि कारक पता चलता है कि प्रोटोकॉल की क्षमता nanoprobes के सभी प्रकार के पार समान है । इसके अलावा, जब वृद्धि प्रोटोकॉल बाहर एक कागज समर्थन पर किया गया था, जहां एक शेयर AuNPs निलंबन की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला मुद्रित किया गया था, यह एक 10000 गुना प्रवर्धन कारक मनाया गया । वृद्धि करने के लिए पिछले, AuNPs की सबसे कम संख्या के साथ दिखाई धब्बे थे, जहां लगभग 10000 नैनोकणों मुद्रित किए गए थे, वृद्धि के बाद स्पॉट बंदरगाह से कम 10 नैनोकणों दृश्य बन गया । 20
वृद्धि प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत के लिए स्थापित शर्तों au3 + की कमी का लाभ लेने के संकेत के लिए au0 की अनुमति दी है, जबकि एक ंयूनतम करने के लिए पृष्ठभूमि शोर को बनाए रखने । वृद्धि सही किया जा सकता है परख के बाद प्रदर्शन के रूप में अच्छी तरह के रूप में microarrays पर है कि कई महीनों तक के लिए संग्रहीत किया गया है के बाद परख प्रदर्शन किया गया है । वृद्धि समाधान 1 समाधान और समाधान 2 के एक 1:1 मिश्रण के होते हैं । दोनों समाधान पहले मिलाया जा सकता है या सीधे मिलाया जब microarray पर pipetted । पूर्व मिश्रण या प्रत्यक्ष मिश्रण के बीच अंतर केवल शेल्फ-वृद्धि समाधान के जीवन को प्रभावित करता है । जब पूर्व मिश्रित शेल्फ-जीवन 5-7 दिनों के 30-45 दिनों में वृद्धि की है अगर नहीं पूर्व मिश्रित ।
इसके अलावा परिणामों के विश्लेषण से पता चला है कि वृद्धि विधि का मात्रात्मक विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । तीव्रता के बीच एक रैखिक सहसंबंध मनाया गया और analyte की एकाग्रता बनाए रखा गया था (तालिका 1) । ग्लास आधारित एलर्जी घटक microarray immunoassay का उपयोग कर 4 पूर्व विशेषता नैदानिक नमूनों के लिए प्राप्त डेटा, मानक प्रतिदीप्ति पता लगाने और वर्णमिति पता लगाने के साथ, दो का पता लगाने के तरीकों के बीच एक अच्छा सामंजस्य दिखाया. मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) और मतलब वर्णमिति तीव्रता (एमसीआई) की तुलना, एक औसत आर2 = ०.७९ +/0.08 प्राप्त किया गया था जब डेटा 10-दोनों अक्षों पर लॉग इन है । इस प्रयोग से पता चला कि वृद्धि विधि एक वाणिज्यिक किट के लिए लागू किया जा सकता है अगर यह पता लगाने के लिए nanoprobes का उपयोग करता है या nanoprobe आधारित पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
वृद्धि विधि प्रभावकारिता दो महत्वपूर्ण पहलुओं पर निर्भर करता है । यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि समाधान 1 और समाधान 2 का मिश्रण समरूप है । एक समरूप मिश्रण के बिना, सेंसर वृद्धि समाधान के अंश के साथ संपर्क में हो जाएगा, जहां समाधान 1 या 2 प्रधान दूसरे के सापेक्ष है । कि au3 + au0की कमी की दक्षता कम हो जाएगा, इस प्रकार वृद्धि की क्षमता को नुकसान पहुँचाए । यह भी गर्मी की अवधि के दौरान वृद्धि समाधान के साथ संपर्क में microarray के हित के पूरे क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण है ।
एक संकेत के ultrasensitive वृद्धि को प्राप्त करने के लिए, एक लंबी गर्मी समय (लगभग 5 मिनट) वृद्धि समाधान के साथ की आवश्यकता होगी । पृष्ठभूमि शोर है कि संकेत अधिग्रहण के साथ हस्तक्षेप कर सकते है के विकास से बचने के लिए, microarray सतह पहले अवरुद्ध किया जाना चाहिए (जैसे BSA, खूंटी) Au0 और एक सोने के फलस्वरूप गठन के तेजी से विशिष्ट जमाव को रोकने के लिए परत.
वृद्धि विधि के लिए एक सीमा परख की आंतरिक प्रभावकारिता है । परख नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सुनिश्चित करने के लिए कि संकेत वृद्धि मनाया सच सकारात्मक परिणाम के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है की आवश्यकता है । यदि लक्ष्य के साथ nanoprobes की एक गैर विशिष्ट बातचीत है, तो वृद्धि के बाद अधिग्रहण किए गए सिग्नल मान्य नहीं होंगे ।
अंय वृद्धि तकनीक या तो nanoparticle एकत्रीकरण या एक सामग्री है कि सुधार संकेत अधिग्रहण की अनुमति देता है के साथ नैनोकणों के धुंधला पर आधारित हैं । पता लगाने साइट पर नैनोकणों की संख्या की सभा को बढ़ावा देने के द्वारा, संकेत अधिग्रहण या तो नेत्रहीन या यूवी विज़ माप संभव हो जाएगा । 5 ये सिग्नल वृद्धि तकनीक दो-चरणीय डिटेक्शन सिस्टम पर निर्भर करती है, ब्याज की analyte का प्रारंभिक पता लगाना और एक दूसरा चरण जहां रिपोर्टर को प्रारंभिक खोज का निर्माण करने के लिए बाइंड करना आवश्यक है । इस तरह की रणनीतियों परख के प्रत्येक प्रकार के लिए विशिष्ट वृद्धि प्रोटोकॉल अनुकूलन की आवश्यकता के कारण सार्वभौमिकता की कमी है ।
इस तरह के चांदी धुंधला के रूप में धुंधला बढ़ाने तकनीक, बहुत यहां प्रोटोकॉल की तरह प्रस्तुत की, संकेत का पता लगाने के निर्माण के प्रत्यक्ष वृद्धि की अनुमति । हालांकि, प्रोटोकॉल है कि यहां दिखाया गया है के विपरीत, चांदी धुंधला ही या तो AuNPs या AgNPs के लिए लागू किया जा दिखाया गया है । ६ , 7 , 8 , 9
इस विधि की प्रयोज्यता की संभावना किसी भी परख कि AuNPs का उपयोग करता है अवधि सकता है, AgNPs, IONPs या SiNPs का पता लगाने के एजेंटों के रूप में । इसके अलावा काम करने के लिए अंय सामग्री से मिलकर सेंसर में विधि के आवेदन का अध्ययन किया जा रहा है ।
The authors have nothing to disclose.
यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (एफ पी/2007-2013)/ERC अनुदान समझौते No ६१५४५८, स्वीडिश अनुसंधान परिषद और प्रोटीन प्रौद्योगिकी के लिए इनोवा उत्कृष्टता केंद्र के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद से धन (VINNOVA-स्वीडिश सरकारी एजेंसी नवाचार प्रणालियों के लिए) आभार स्वीकार किया है ।
Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
IgG antibody | Abcam | ||
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
Filter holder | Merck | XX3001200 | |
PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |