Summary
ここでは、脳を記録し、心臓の同時ビデオを用いたマウスで計測される生体信号プロトコルを提案脳波 (EEG) や心電図 (ECG)。また発作、パワー スペクトル、心機能および心拍変動の結果として得られる脳波心電図の分析手法について述べる.
Abstract
てんかんの発作は心拍数変化、伝導ブロック、asystoles、てんかん (SUDEP) における突然死のリスクが増加する可能性がある不整脈など心臓のリズム障害を呼び起こすことができます。脳波 (EEG) や心電図 (ECG) は、異常な脳の患者の心拍リズムを監視するため広く使用されている臨床診断ツールです。ここでは、同時に、それぞれの測定動作、脳や心臓の活動へのマウスでビデオ、脳波、心電図を記録する方法を説明します。記載法を利用して、つなぎ縄でつながれた (すなわち、有線) 録音設定マウスの頭に注入電極が録音機器に配線されています。無線テレメトリー システムの記録と比較して、つなぎ縄でつながれた整理は大きい可能な脳波や他の biopotentials; 録音するチャンネル数などのいくつかの技術的な利点を所有しています。電極コストの削減。録音の大きい帯域 (すなわち、サンプリング レート)。この手法の基本には、それぞれ筋電図 (EMG) や脈筋と呼吸活性の評価など、他の生体信号の記録に合わせて簡単に変更できます。脳波-心電図記録を実行する方法に加え、また、発作、脳波スペクトル パワー、心機能とマウスを使用して例を実験で示す心拍変動の結果として得られるデータを定量化する方法を詳細します。Kcna1遺伝子欠失によるてんかん。てんかんやその他の神経疾患のマウスモデルの監視ビデオ脳波心電図は、脳、心臓、または脳心の相互作用のレベルで障害を識別するために強力なツールを提供します。
Introduction
脳波 (EEG) 心電図 (ECG) は、それぞれ生体内で脳と心機能を評価するための強力かつ広く使用されている技術。脳波は、脳の電気的活動の記録を電極を頭皮に1に接続することによってです。非侵襲的な脳波で記録された信号は、主に大脳皮質の錐体細胞1,2によって生成された興奮性および抑制性シナプス後電位の電位から生じる電圧変動を表します。脳波は、評価およびてんかん3,4患者を管理するための最も一般的な neurodiagnostic テストです。それは、てんかん発作を伴わない欠神発作など非痙攣性ステータスてんかん重積5,6の痙攣行動症状が明らかなときに便利です。逆に、非てんかん関連ビデオ脳波モニタリング7のないてんかん発作と痙攣のエピソードや意識の喪失につながる条件可能性だってあります。てんかんの分野でその有用性だけでなく脳波は睡眠障害、脳症、記憶障害に関連する異常な脳活動を検出するに手術2中に全身麻酔を補完するために使用も広く,8,9。
脳波、心電図とは対照的 (またはそれとして心電図は時々 省略される)10心臓の電気的活動の記録です。心電図は通常、上肢下肢と胸壁は、収縮と弛緩の10、11の各心臓サイクル中に心筋によって生成される電圧の変化の検出を可能に電極を接続することによって実行されます。正常心臓周期の心電図波形の主要コンポーネントは、P 波、QRS の複合体、および T 波心房脱分極、心室脱分極および心室再分極、10、をそれぞれに対応する11. 心電図は不整脈や心臓伝導システム12の欠陥を識別するために使用します。てんかん13、突然の予想外の死と同様、突然の心停止のリスクが大幅に増加したので、てんかん患者心電図を使用して、潜在的に生命を脅かす不整脈を識別することの重要性を増幅します。 14,15。
臨床応用に加え脳波と心電図の録音は疾患のマウスモデルの脳や心臓の機能障害を特定するために欠かせないツールになっています。従来これらの録音は個別に実行されていましたが、ここで我々 はマウスで同時に心電図、脳波、ビデオを記録する手法をについて説明します。同時ビデオ脳波心電図法の詳しいはこちらはマウスの頭に注入電極が録音機器に配線されているテザーの録音設定を利用しています。歴史的に、これがテザリングや有線、構成が標準となって、脳波マウス; のため方法を最も広く使用しかし、無線の EEG テレメトリ システムも最近開発されて、16の人気を集めています。
無線脳波システムに比べ、テザーの配置はいくつかの技術的な利点があるため、目的のアプリケーションに応じて望ましいを所有しています。これらの利点は、脳波や他の biopotentials; 録音するチャネルの大きい数電極コストの削減。電極の使い捨て。信号損失の少ない感受性大きい頻度帯域幅 (すなわち。、サンプリング レート) 録音17。適切に行われて、ここで説明したテザー記録法は高品質、アーチファクト、脳波と心電図を提供できるデータ同時に行動を監視するための対応するビデオと共に。この脳波と心電図データは、神経、心臓を識別するために、採掘できるまたは neurocardiac 異常脳波の変化、発作などパワー スペクトル、心臓伝導ブロック (すなわち。、心臓の拍動をスキップ)、および心拍変動の変化。これらの脳波心電図の定量的方法のアプリケーションを示すためには、マウス (-/-) Kcna1ノックアウト実験例を紹介します。Kcna1-/-マウス不足電圧ゲート Kv1.1 α サブユニットと自発性発作、心臓機能障害、てんかん関連する劇物の同時の脳波心電図測定のための理想的なモデルを作るそれらの早すぎる死の結果として展示neurocardiac の機能不全。
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Protocol
機関の制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認された、すべて実験プロシージャの国立機関の健康 (NIH) のガイドラインに従い実施する必要があります。このプロトコルに必要な主な手術器具は、図 1のとおりです。
1. 注入用電極の準備
- 10 ソケット女性 nanoconnector (すなわち、電極の配置します。図 2 a)上向き 10 ワイヤと正面に黒の線で卓上万力。微細鉗子を使用すると、右側に最初 (黒) 線、左に 2 番目の (tan) 線を倒します。次に折る赤、オレンジ、青、および紫線交互に左右の方向 (図 2 b)。愛着の基部に黄色、緑、白、および灰色の線を切った。
- 心電図ワイヤを準備するのにには、電極のベースから ~3.5 cm ~3.2 cm で紫線と ~2.2 cm と ~2.5 cm (図 2) で青色の線でマークをするのに永久的なマーカーを使用します。万力から電極を削除し、メスの刃 (図 2 D) でワイヤーの 1 つの側面に断熱材を取り去ることによってマークされたエリア間銀のフィラメントを公開します。
注記: ワイヤをこするは、顕微鏡下で行ってください。警告を使用して、銀のフィラメントは断熱材を掻き、破損していないことを確認ください。 - 万力で電極を配置します。取り付けの両面テープ、瞬間接着剤の薄い層を使用してワイヤの上に、電極の幅と長さにプレカットの部分を貼ります。
注: テープを接着する前になり線が両側にまっすぐ突き出て、フラット横たわっていることを確認していないツイスト 1 つ別の上。 - 黄褐色と黒の線を切った、最短で約 7-9 mm の長さに若干 V 字の角度で脳波に使用する線をトリムします。心電図 (図 2 e) に使用する電線を切断しないでください。
- パッケージ化し、後で使用できる電極を滅菌します。
2. 手術のためマウスを準備
- マウスの重量を量る。カルプロフェンの 5 mg/kg を皮下注入 (サウスカロライナ州)。マウス麻酔カクテルのケタミン (80 mg/kg)、キシラジン (10 mg/kg)、アセプロマジン (1 mg/kg) を含む腹腔注射で動物を麻酔します。
- マウスが麻酔になります、一度獣医眼科用軟膏の細い線をそれぞれの目に適用します。電動トリマー、ひげをそる 2 つの小さな領域 (~ 2 cm2) マウスの幹の両側を使用すると、(図 3 a) 心電図の線がされるに対応する注入。
注: 右側の剃毛エリアに動物の権利「脇」のすぐ後ろに約背外側の位置にあります。左側にある、動物、しかし約 1 cm より右側にある (図 3 a) 剃毛エリアよりも後部の側面に沿ってより腹方向に剃毛エリアにあります。 - 切り取られた髪の毛を取り外して、クロルヘキシジン溶液で両方の剃毛地域をきれい。
3. 頭蓋骨に電極を取り付ける
- 腹臥位で解剖顕微鏡のステージ上にマウスを置くし、つま先ピンチ反射の不在によって適切な麻酔深度を確認します。
注: 手順 3.2 5.6 には、顕微鏡の助けを借りて行う必要があります。 - 親指と人差し指でヘッド安定して保持、綿棒で目の後ろにちょうど耳の間から頭の中心を毛皮部分は、(図 3 b) アルコールに浸した。
メモ: この手術は無菌とされるべきである、それはありません滅菌手順頭皮を剃毛することはできませんので、手術中に、マウスを操作する必要があります。 - メスを使用して、~ 1 cm 正中線切開目 (図 3D) の間だけ耳の正面から parted の毛皮の間頭皮を作る。
- 骨は乾燥が表示されるまで、頭蓋骨の上に粘液の膜をこすり優しくメスの側または綿の先端アプリケータを使用して、します。
- ハゲ皮の細い境界線を形成切開の周囲のまわりの毛をむしる。鉗子のペアで手術野に陥っている可能性があります任意の毛皮を慎重に取り外します。頭蓋骨の表面乾燥、滅菌綿棒、必要な場合、いくつかの秒の穏やかな圧力を適用します。
- ドリル (図 3E) バリ穴をされるサイトで滅菌永久的なマーカーと頭蓋骨に 4 つのマークを作る。参照と地面のワイヤーの前、約 4 mm 前方・前 (前頭葉)、上に 5 mm 外側前方矢状縫合の各側に 1 つ 2 つのマークを配置します。2 つの脳波記録線 (上記の parietotemporal 野)、前に 7 mm 横、前、約 2 mm 後方に後方矢状縫合の各側面上の 1 つ別の 2 つのマークを配置します。
注: これは、定位脳手術ではないと指定の距離が近似するマウスのサイズによって異なります。穴が置かれるまで簡単に矢状縫合 (図 3 f) に沿って正中線に貼られている電極インプラントの基盤を収容する横方向に十分なことを確認します。 - 0.8 mm 径のドリルで印の位置の小さなバリ穴を作る滅菌マイクロ ドリルを使用して。
- 顕著な場所それぞれに小さな凹部を作成する掘削中は、穏やかな圧力を適用します。穴が貫通し、根本的な脳組織の損傷につながる可能性があまりにも多くの圧力を適用しないように確認して完了に近づくドリル ビットをパルスによって頭蓋骨にドリルスルーします。
- 穴をすべて後、綿の先端アプリケータで領域を拭いてください。
- 頭蓋骨の上に電極を付着するには、電極の取り付けの両面テープの裏紙を削除します。テープに瞬間接着剤の薄い層を適用します。ピンセットのペアを使用して、万力から電極を削除します。矢状縫合線に沿って配置されたとき、に、短い脳波ワイヤが吻側、長く心電図の線が尾側などに、それに合わせます。
- 穴 (図 3 f) の間の矢状縫合の頭蓋骨に電極を付着します。
注: 頭蓋骨は固執する電極の接着剤のため完全に乾燥する必要があります。電極や接着剤で頭蓋骨のバリ穴を閉塞しないようにします。 - 簡単に言えば、頭蓋骨への密着性を確保し、5-10 分間乾燥して接着剤を許可する場所に電極を保持します。
- 穴 (図 3 f) の間の矢状縫合の頭蓋骨に電極を付着します。
4. 心電図のワイヤーを埋め込む
- 頭を直立した保ちながら若干の右側にマウスを回転させます。左側にある長い心電図ワイヤーを取るし、下側左側に剃毛エリアにマウスの拡張します。それは、皮膚の下にトンネルが一度露出配線が配置されますを視覚化します。
注: 参照の小さなマーク可能皮膚に永久的なマーカー。 - メスを使用して、露出配線が配置される場所の皮膚で 〜 1 cm の切開を作る。アドソン鉗子で切開オープンを保持している間、デュモン鉗子を使用してワイヤーのためのポケットを形成するのに根本的な結合組織から切開の周りの皮膚を緩めます。(つまり ~ 6 cm の長さに斜めのリーディング エッジにそれを切断することによって準備されている) 滅菌ポリエチレン チューブの切れ端で皮下トンネル動物側に切開部位から始まる、斜めの端、頭の上の切開が終了するまで (
図 4 a、B)。 - デュモン鉗子 (図 4) を用いたチューブを介して心電図ワイヤを通します。チューブを取り外し中、横切開から出るアドソン鑷子と電極ワイヤを把握します。ワイヤーの緊張 (図 4) を引き出します。
- 6-0 ナイロン (図 4E) と皮膚の下の組織に縫合場所で心電図の線を修正します。鉗子とオルセン Hegar ニードル ホルダーを使用すると、露出部分の前後に露出したフィラメントと別の縫合 one 縫合が適用されます。
- 電極線最後の縫合過去 2-3 mm 程度をカットし、皮膚形成以前のポケットに最後を押し込みます。切開の 2 つの側面を一緒にプルし、Crile 木針ホルダー (図 4 階) を使用して適用された傷クリップを閉じます。
- 鼻が反対の方向で指すように、マウスの電源を入れます。まだ直立の腹臥位で頭の左側に少しマウスを回転させます。
- 対側の心電図ワイヤを配置する上記の手順を繰り返します。
注: リード II 心電図記録構成ではを正しい心電図を近似するには、やや背側と少し腹側と後にする必要があります左の心電図線より前方ワイヤを配置する必要があります。
5. 脳波のワイヤーを埋め込む
- 脳波用ワイヤをインプラント、腹臥位でフラットにマウスを置くし、非利き手の人差し指と親指を開いて頭皮切開を保持.
- 鉗子、チューブで皮膚の下に引き出されている可能性があります任意の毛皮を取り外します。必要に応じて、綿の先端アプリケータと頭蓋骨を再び乾燥します。デュモン鉗子を使用して、慎重にえぐり、残骸またはばり穴で収集した血液凝固を削除します。
- 1 つの側面の最も前方の穴から始まる、穴の真上がまだ挿入されていませんので、その穴に最も近いはワイヤーを曲げます。線の下の端をつかみ、できるだけ水平にそれをフィード 2 ~ 3 まで穴にワイヤの mm は頭蓋骨 (図 5 a)。
注: ワイヤーは、頭蓋骨と脳の表面との間水平にうそする必要があります。ワイヤは、脳を動けなく必要があります。 - 穴にセキュリティで保護されたワイヤーの端、頭蓋骨に対して平らになるようには、ゆっくりワイヤーの残りの部分を折る。
- 同じ側に後方の線と同じ方法で続行します。反対側 (図 5 b) に前部と後部の配線について繰り返します。
注: ワイヤー構成は図 5のとおりです。
6. 歯科用セメントと頭切開を閉じる
- ポリカルボン酸塩液 〜 5 滴とポリカルボン酸系粉体の 2 つのスクープを混ぜます。目的の粘度のペーストを作るためにつまようじとの混合物をかき混ぜなさい。
注: 以降手順 6.2 に 6.4 は、混合後 1 分以内の歯科用セメントが乾くのですぐに実行する必要があります。 - 楊枝でセメント ペーストの大規模なドロップを拾うし、尾側に始まり電極 (図 6 a) のベースの周りにそれを適用します。(図 6 b) インプラント周囲のキャップを成形線以上の点滴をセメントを許可する電極の周りを継続します。
- デュモン鉗子を使用すると、セメント キャップ上切開部の端で毛皮を引き上げ、下に注入した線の邪魔にならないように注意しながら、一緒に押します。閉鎖のためセメントに毛皮を押し込みます。
- 歯科用セメント (図 6) と毛皮を接合させることで目の切開をシールします。
7. 手術後の回復を助ける
- 循環熱パッドの空ケージにマウスを配置します。それは意識を取り戻すし、胸骨の横臥を維持することができますまでは、マウスを監視します。
- Post-surgically、家の餌ペレットと保湿ゲルとケージで個別にマウスは、ケージの床に置かれて。トップ マイクロ アイソレータふた付きかご。
- 手術、24 h 後で (サウスカロライナ) カルプロフェンの 5 mg/kg のマウスを注入します。
- ≥ 48 時間録画の前に手術後の回復を許可します。
8. 記録脳波心電図信号つなぎ縄でつながれたマウスから
- 次の回復、ビデオ監視を容易にする透明な壁とレコーディング室に注入されたマウスを転送します。テザーに (すなわち、「プラグイン」) マウス (図 7 a) 優しくしっかりとマウスを押したまま片方の手でマウス頭に脳波心電図電極インプラント (メス) ソケット ガイドポストと 10 ピン (オス) nanoconnector を挿入する他の手を使用している間。
- 支持ロッドを用いた室の上の配線を確保、配線が部屋の床をドラッグ、しかしそんなに自由に移動するマウスを許可するワイヤーに十分な余裕があることを確認します。
- 同期録画図 7 bのように、10 ピン nanoconnector からコンピューター接続信号集録インタ フェース ユニットに配線を接続します。
- ≥ する録音のためのサンプリング レートを設定心電図の ≥ 2 KHz 500 Hz の脳波 (すなわち、少なくとも 2 回、1 つ周波数に興味がある勉強)。
- 信号波形の最適な表示、前述18次のフィルターを適用: すべてのデータのための 60 Hz のノッチ フィルター、脳波、75 Hz 低と 0.3 Hz ハイパス バンド フィルター、心電図の 3 Hz のハイパス フィルター。
- 同時ビデオと脳波-心電図 (図 7) を記録し、信号処理ソフトウェアでオフライン解析のデジタル化されたデータを保存します。
- 録音が完了したら、慎重にマウスをフックをその家のケージに戻ります。
9. 脳波の分析
- 発作定量化分析を行います。
- 5 を超える持続的な律動性アノキシア放電高振幅 (ベースラインの少なくとも 2 倍)、としてこのモデルで定義されている発作のエピソードを手動で識別する脳波記録全体を目視で確認 s (図 8 a)。発作関連する動作を識別するためにエレクトロ グラフの発作に対応するビデオを確認します。
- 発作頻度 (発作/h) を計算するには、録音時間の合計数によって発作の数を割ります。
- 発作期間の計算にスパイク (図 8 a) の停止までアノキシア発作の発症からの経過時間を測定します。
- 発作の負担を時速では、強制時間として定義されているを計算するには、発作期間の合計、合計記録時間で割ります。
- 前および後発作時脳波のスペクトル解析を実行します。
- 30 分 (またはその他の目的の時間の期間) を選択検討する発作エピソードを中心とした周術期発作の脳波データのセグメント。ASCII データ ファイルまたはパワー スペクトル ソフトウェアといくつか他のファイル タイプの互換性として (削除するフィルター設定) の生のデータをエクスポートします。
- ASCII ファイルを単純なテキスト エディター アプリケーションを使用してテキスト ファイルに変換します。
- パワー スペクトル ソフトウェアで脳波セグメントの結果のテキスト ファイルを開き、次の設定を指定する:""非数値の行を無視する;「データの区切り文字としてのコンマ」;1000 Hz 既定のサンプリング レート。
- 脳波信号は、それぞれのチャネルのパワー スペクトル ソフトウェアで表示される、チャネルのドロップ ダウン メニューをクリックし、「デジタル フィルター」を選択分析に必要な周波数範囲に対応するデジタル帯域通過フィルターを適用します。
- メニュー パネルから「スペクトル ビュー」を開く、分析されるべき適切な脳波表示チャンネルを選択し、「設定」をクリック「設定」の下でスペクトロ グラムの次のパラメーターを指定してクリックして「閉じる」スペクトロ グラム (図 8) を生成する: FFT サイズ: 8192、データ ウィンドウ: ウェルチは、オーバー ラップ ウィンドウ: 93.75%、表示モード: 電力密度、スペクトロ グラム色: 虹違います。色: 64、PSD の平均: 1、削除ゼロ周波数成分:"on"でチェックします。
- スペクトロ グラムの最適な可視化に必要な比色スケールを調整します。
- メニュー パネルから「解析マネージャー」を開きます。クリックして「+ 新しい分析」分析する前および後に発作時脳波のセグメントに対応する 2 つの分析 (分析 1 と解析 2) を作成します。スペクトロ グラム上希望の前およびポスト発作時のセグメントを指定し、それぞれ分析 1 分析 2 とそれらを関連付けます。
注: 唯一の脳波データのノイズやアーチファクトなしを考慮すべき、重要な成果物と脳波の期間は分析対象から除外する必要があります。 - 解析セグメントが作成されるは、メニュー画面から「データ パッド ビュー」を開きます。適切な脳波チャネルをそのチャネルの「データ パッド列セットアップ」メニュー開くをクリックします。
- データ パッド列、「セットアップ」の「スペクトル」のオプションを選択し、「割合合計パワー」を選択
- 「データのパッドの列設定、」で「オプション」をクリックし、検討する周波数範囲を指定します。「データのパッドの列セットアップ,」、「スペクトル データ パッド オプション」で"OK"をクリックし、特定の周波数帯域の割合 (%) 電源で指定されている選択した解析セグメント (すなわち、分析 1 または分析 2) のデータ パッド ビューに表示されます、"分析マネージャー."
注: % 電源、または各バンドの相対的な力は、指定された周波数範囲内の合計スペクトル電力の割合として表されます。 - 分析される周波数バンドごとに前の手順を繰り返します。
注: 多用の範囲の 5 つの主要な脳波周波数バンド18: δ バンド = 0.5-3 Hz の帯域 3.5-7 Hz = α バンド = 8-12 Hz β バンド = 13-20 Hz と γ バンド = 21 50 Hz。
10. 心電図の解析
- スキップした心臓の拍動を定量化します。
- 手動でスキップした心臓の拍動、房室の非実施の P 波直説法に関連付けられて多くの場合 ≥ 1.5 倍前の R R 間隔に等しい RR 間隔の延長として定義を識別するために心電図記録全体を目視で確認します。伝導ブロック (図 9 a)。
- 時速スキップした心臓の拍動の頻度を計算するには、録音時間の合計時間が記録セッション中にスキップ ビートの総数を割ります。
- 心拍変動 (HRV) 解析を実行します。
- データ集録ソフトウェアで ECG のチャネル 1 のエポックにログ設定を変更します。心電図記録のパーサー セグメントを生成: 1 つ 5 分心電図セグメントごとの 3 の 4 つのセグメントの合計 12 時間光フェーズ期間中時間。
注: 選択した心電図は時動物は静止と運動の成果物のデータが無いはずです。 - 選択した解析心電図 R-R 間隔値のセグメントをクリックして"解析派生データ保存します"スプレッドシートを生成します。不足しているデータや不良データのスプレッドシートを確認し、R-R 間隔データを除く他のすべての数値を削除します。「タブの区切り」のオプションを選択テキスト ファイルとしてこの変更されたスプレッドシートを保存します。
- HRV のソフトウェアは、次のオプション: ヘッダー行の数を指定することでカスタム ASCII ファイルとしてテキスト ファイルを開く: 0、列の区切り文字: タブ/スペース、データ タイプ: RR、データ列: 1、データ単位: ms、および時間インデックス列: なし。
- メニューの [基本設定] セクションには、下記のとおりオプションを設定します。
- 前述の分析オプションを設定します。心電図 R-R 間隔のトレンド除去、トレンド除去法: smoothn 前科、平滑化パラメーター: 500、心拍変動周波数バンド19, 非常に低い周波数: 0 0.15 Hz、低周波: 0.15 1.5 Hz と高周波: 1.5-5 Hz
- 前述のように高度な設定を設定します。スペクトル推定オプション、補間の RR シリーズ: 20 Hz の周波数ポイント: 500 ポイント/Hz、FFT スペクトラム Welchs ピリオド グラム方法、ウィンドウの幅を使用して: 32 秒とウィンドウの重複: 50%
- RR の意味、STD RR (すなわち、SDNN)、HF パワー、LF パワー、そして LF/HF パワーの比率を RMSSD と周波数ドメイン解析値のタイム ドメイン解析値を生成する HRV 解析を実行します。必要な場合は、PDF ファイルとして結果を保存します。
- データ集録ソフトウェアで ECG のチャネル 1 のエポックにログ設定を変更します。心電図記録のパーサー セグメントを生成: 1 つ 5 分心電図セグメントごとの 3 の 4 つのセグメントの合計 12 時間光フェーズ期間中時間。
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Representative Results
Neurocardiac の異常を識別するために脳波心電図のデータを分析する方法を示すためには、結果が表示されますKcna1-/-マウス (2 ヶ月) の 24 時間脳波心電図記録のため。彼らは信頼性が高く、頻繁に一般化された強直間代発作活動の開始を示すために、電圧ゲート Kv1.1 α-サブユニットKcna1遺伝子によってエンコードの不足のために設計、これらの突然変異体の動物がてんかんの頻繁に使用される遺伝学的モデル年齢20の約 2-3 週間でさらに自発性発作、 Kcna1-/-マウスも展示、てんかんの発症と一致として発作間欠期の早すぎる死と心機能低下の発作関連21, 22. したがって、 Kcna1-/-マウスも頻繁に使用されるてんかん (SUDEP)、てんかん関連の主要な原因の突然の予想外の死の基になる潜在的な病態生理学的プロセスの研究死亡率、発作関連まだ、心肺停止を伴うと考えられているは、機構23をよくわかっていません。
この実験では、録音Kcna1-/-マウスからの脳波成分を示した簡単な電圧が続く発作発症時の初期大規模なスパイクとして通常見られる頻繁に自発性発作うつ病、高振幅スパイクとの終了への遷移抑制パターン (図 8 a) のバースト。同時に録画したビデオを使用して、これらアノキシア発作が発作のような行動、その後全身強直間代痙攣に発展した飼育と前肢のクローヌスが特徴と一致する見つかりました。注記のうち、脳波の主な利点の 1 つは明白な動作、彼らは得点だけで行動に基づく発作観察者によって見逃されることの意味に関連付けられていない「サイレント」のアノキシア発作を特定する機能です。この特定Kcna1-/-マウスの発作発生率の定量化 (図 8 b) 24 h 録画期間 15 発作を明らかにしました。これらの発作の期間平均 〜 60 s、まで約 15-105 s (図 8 b)。前と後の発作期間の相対的な分光電力密度解析を示すためには、80 s の期間の発作はパワー スペクトル ソフトウェアを使用して評価に選ばれた、ペリ発作スペクトロ グラム生成 (図 8)。デルタ周波数帯域の発作後の相対的なスペクトルの力 ~ 50% (図 8) の発作前のベースラインと比較して増加しました。さらに、他より高い周波数の脳波バンドの発作後の相対的な力は (図 8) の発作前の期間と比較して対応する減少を出展しました。発作後のデルタ力の増加と他のバンドの後発作時のパワーの減少は減速、このモデル18の長い、激しい発作性脳波を表しています。
Kcna1-/から記録の心電図コンポーネントを分析-マウス、発作間欠期のスキップした心臓の拍動数では前述の通り手動で数えていた。このKcna1-/-マウスでスキップした心臓の拍動の頻度は 5.84/h (表 1) は、> 5-fold 増加私たちの以前の研究の18,21で WT マウスと比較されました。Kcna1-/-マウスの心電図スキップした心臓の拍動は多くの場合、図 9 aを示す房室 (AV) 伝導ブロック21に示すように、QRS 波が後ろがない P 波を示します。次に、hrv 制御ソフトウェアを使用して、HRV を行ったこの動物における心機能の自律神経系の影響の測定を提供します。Kcna1-/-マウスの HRV の次の時間ドメイン対策を求めた: ビート-ビート間隔 (SDNN) の標準偏差を合計自律神経の変動; のインデックスであります。副交感神経の指標である連続したビートにビートの違い (RMSSD) の根平均二乗。Kcna1-/-マウス (図 9 b) を用いた信号集録ソフトウェアによって生成された心電図 R-R 間隔値24 HRV ソフトウェア計算 737 ビート/分 (表 1) の心拍数、私たちの以前の研究18WT マウスに似ています。SDNN と RMSSD の値が 2.4 ms と 3.2 ms と計算されたそれぞれ (表 1)、約 2 〜 3 倍通常の WT マウス18よりも高い。このKcna1-/-マウスにおけるドメイン HRV 対策を示す心の自律制御の異常を示唆して、増加副交感神経の調子上昇の時間。次に、我々 は表 1に要約して周波数領域心拍変動の次の値を計算する HRV ソフトウェアを使用: 低周波の電力の割合 (LF);高周波電力の割合 (HF);LF/HF 比。LF 成分は交感神経と副交感神経の組み合わせ25の影響を反映すると考えに対し、副交感神経の変調を反映する HF 成分が考えられています。LF/HF 比は、副交感神経と交感神経活動の相対的なバランスをキャプチャするために使用されます。
最後に、神経、心臓機能障害の定量的な対策を派生する、に加えて脳波心電図もについて分析できる質的 neurocardiac の潜在的な障害を識別するために脳波と心電図異常の時間的関係、前述21,26。たとえば、脳波では、発作や発作間欠期のてんかん放電が特定、対応する心電図は伝導ブロックや不整脈、てんかん脳の活動によって誘発することができるなどの心臓異常を検査できます。Kcna1-/-マウスの発作時に徐脈や心静止致死21,22に進行することを呼び起こします。別のてんかんモデルにおけるKcnq1変異マウス、伝導ブロック、asystoles 示唆病理 neurocardiac 相互作用26の結果、発作間欠期の脳波放電と同時発生します。したがって、脳波や心電図を同時記録は、脳や心臓発作の可能性がある致命的な心機能低下を呼び起こすことができるのでてんかんで特に重要であるとの相互作用のより完全な画像を提供します。
図 1。手順に必要な外科的ツールです。(1)外科ブレード #15;(2)メス ハンドル #3。(3)アドソン鑷子;(4)オルセン Hegar 針ホルダー;(5)高級はさみ;(6) ・ デュモン #7 鉗子。(7)ミシェル ・傷クリップ;(8) Crile 木針ホルダー;0.8 mm ビット(9)マイクロ ドリル(10)電気トリマー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。注入用電極を準備します。10 ソケット女性 nanoconnector (すなわち、電極) の(A)の例です。(B)脳波と心電図の植え付けられるワイヤで卓上万力で電極を折った。線の色が表示されます。上向きに指摘したが、残りのワイヤーが切断されます。はめ込みは、電極から出てくる線の拡大ビューを示しています。(C)は、断熱材を除去するための場所を示す青い心電図ワイヤー マーキング。(D)では、メスの刃を使用して、内銀のフィラメントを明らかに絶縁電線をストリップします。(E)トリミングの脳波を示す準備の電極の最終的な構成の配線し、取り付けテープで裸の心電図の線が上部に付着します。はめ込みは、取付テープと電極から出てくる線の拡大ビューを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。頭蓋骨に電極の外科の添付ファイル。(A)両側にマウスの例坊主 (矢印によって示される) 心電図ワイヤが注入。(B)目と切開のパスを作るために耳の毛皮の別れ。(C)では、メスを使用して頭皮切開にします。(D)頭皮の切開。(E)ドリルのサイトを示すために使用する頭蓋の 4 つのマークの例です。(F)バリ穴を掘削後頭骨の電極の配置。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。トンネリングと心電図の線の注入します。(A)約 6 cm にカットされており、皮下トンネルを容易にする 1 つの端に面取りポリエチレン管の例です。(B)横切開部位から始まるポリエチレン管と皮下トンネル。(C)は、管を通って頭に電極から心電図ワイヤーを供給します。(D)は、チューブを削除した後ピンと張ったワイヤーを引っ張る。(E)は、基になる組織上の場所に保持するために心電図ワイヤの絶縁露出部分に縫合糸を適用します。(F)傷クリップ側切開の閉鎖。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。脳波ワイヤーを埋め込みます。(A)脳波レッドワイヤーを把握し、頭蓋内のバリの穴に水平に送る、黒の次の配置はアース線。(B)次の注入 nanoconnector 線材の最終的な構成。二国間の脳波と心拍の(C)図表示配置線、参照 (REF)、およびワイヤをグランド (GND)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。頭の切開を閉じる。(A)から尾側と吻方に進む電極の基地周辺の歯科用セメントの応用。(B)周囲の全体 nanoconnector とワイヤー、切開の最終的な閉鎖の直前に歯科用セメント キャップの例です。(C)最終封印された切開の例です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7。ビデオ脳波心電図の記録。(A)記録中につなぎ縄でつながれたマウスの例。(B)回路図は生体内でつながれたビデオ脳波心電図記録装置の構成を示します。頭蓋骨に埋め込まれた女性の nanoconnector に差し込む、10 ピンの男性 nanoconnector からの配線は 12 チャンネル分離生体ポッド インターフェイスに接続されている 1.5 mm 女性ケーブルにはんだ付け。このポッドは、シリアル リンク ケーブルを転送データ集録ソフトウェアがデスクトップ コンピューターに接続されている信号集録インタ フェース ユニット (ACQ) にデータをデジタル化デジタル通信モジュール (DCOM) にリンクされています。外に配置され、ケージに隣接するネットワーク ビデオ カメラを使用してビデオも同時に取得します。カメラは、over Ethernet スマート スイッチ、電源を介してコンピューターにリンクされます。(C)典型的な脳波と心電図の代表的な痕跡信号の次のフィルターを使用してデータの適用: 60 Hz のノッチ、脳波; 75 Hz 低と 0.3 Hz ハイパス バンド フィルター心電図の 3 Hz のハイパス フィルター。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8。脳波信号の解析。代表的な自然発作を示す(A)の脳波トレース、 Kcna1-/-マウス。(B) 24 h 記録セッション中に観察された各発作の時間のプロット、 Kcna1-/-マウス。バーは、平均 ± 標準偏差に対応します。(C)周術期発作スペクトロ グラム、および代表的な発作前後後に周波数及び電力密度を示す(D)前と後発作期間中にある脳波の各周波数バンドの相対的な力の比較相対デルタ力の増加を明らかにし、シータ、アルファ、ベータ、ガンマ力の減少します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9。心電図の解析。(A)からサンプル ECG トレース、 Kcna1-/-複雑なマニフェスト、QRS が続かない P 波としてする房室伝導ブロックの前正常洞調律を示すマウス。参考のため P 波、QRS の複合体、R-R 間隔が付きます。(B)の心電図の記録から得られる心電図 R-R 間隔シリーズの代表的なプロット、 Kcna1-/-ビートの間時間の変動を示すマウス。赤い線は、低周波数次のトレンド除去 R-R 間隔時系列から削除されるトレンド成分を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 心臓の拍動をスキップ/h | 心拍変動 (HRV) | |||||
| タイム ドメイン | 周波数ドメイン | |||||
| HR | SDNN | RMSSD | LF | HF | LF/HF 比 | |
| (拍/分) | (ms) | (ms) | (%) | (%) | ||
| 5.84 | 736.8 | 2.4 | 3.2 | 52.27 | 46.38 | 1.127 |
表 1.スキップされた心の定量化を打つ心拍数 (HR)、および心拍変動 (HRV)で、 Kcna1-/- マウスします。HRV の次の時間ドメイン措置を与えられている: ビート-ビート (SDNN) 間隔の標準偏差と連続したビートにビートの違い (RMSSD) の二乗。周波数領域で次の HRV 対策が表示されます: 低周波の電力の割合 (LF %); 高周波電力の割合 (HF %) と高周波電源 (LF/HF 比) に低周波電力の比。
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Discussion
成果物から解放された高品質脳波心電図記録を得るためには、劣化や注入電極とワイヤの緩みを防ぐためにあらゆる予防措置を取られるべき。脳波頭インプラントがルーズになると、脳と線の接触は減らされた信号の振幅につながるを低下します。緩やかなインプラントや貧しいワイヤ接点運動成果物とバック グラウンド ノイズを録音に導入、電気信号の歪みもあります。最大強度と密着性を確保するため頭皮切開を閉じるとき頭インプラントの潜在的なゆるみを防ぐため、歯科用セメント、インプラントの基盤のまわりの寛大な量を適用します。注意は、頭蓋骨からの毛皮の完全な除去を確保するため、毛皮の残党は、インプラント周囲の腫れにつながると早期手術後の炎症を引き起こす可能性がのでインプラントの剥離にもすべき。時間をかけて、頭のインプラントによる繰り返し差し込むと動物の取り外しに関連するストレスを緩和する可能性があります。したがって、可能であれば、複数の短時間録画ではなく、1 つの長期間録画を実行することによって動物が差し込まれているアンプラグド回数を最小限にましょう。術後インプラントの破損およびそれに続く動物傷害の別の潜在的なソースは、インプラントと動物のホーム ケージで wiretop との間の物理的な接触です。Wiretops、食品の必要性を除去するためにペレットと保湿ゲルがケージの床に配置できます。最後に、心電図リードの整合性を維持するために動物の取扱い心電図ワイヤを実行する体の両側に沿って特に必要があります最小。
インプラントやワイヤーの接点の劣化に加え、つなぎ縄でつながれた記録構成の別の潜在的な合併症信号損失につながる実験中に (すなわち、アンプラグドまたはホックを外した) 一戸建てなって動物の可能性であります。剥離は、特に面倒なマウスを実行して、バウンスと重度のけいれん発作を経験することができます。一戸建てなってマウスの可能性を最小限に抑える、ワイヤー テザー内の余裕期間の量を最適化します。最適なワイヤーの長さは通常、剥離を促進できるワイヤーでケージの隅々 を探索する動物の十分な余裕がないのでする必要はない、少しの緊張感を提供することの間のバランスです。最適なワイヤ長を決定するには、そんなにないあることを確認マウスが、ワイヤが壊れている場合に信号の損失につながることができる線でかむことができます容易に緩めます。少なくともによるインプラント用電極 nanoconnector を使用して 10 細線 (すなわち、10 ピン/ソケット ペア) も未満 10 線がより頻繁に外す傾向がある nanoconnectors として、連結接続する余分な安定性を提供するため重要です。一戸建てなって動物の可能性をさらに減らすためには、このプロトコルはマウスの頭から録音室の上に懸低トルク整流子にワイヤーを接続することによって簡単に変更できます。整流子は回転を抜いてからマウスを防ぐワイヤーでねじりひずみの蓄積を緩和するためにマウスを移動して動作します。
このテザーのビデオ-脳波-心電図プロトコルの主要な強さは、追加のアプリケーションのメソッドを変更する機能です。前述のように、利用可能な 10 電極線のわずか 6 が利用されています。しかし、残りの 4 つの線は、追加 4 脳波は脳の活動のよりよい空間分解能を提供するリードとしても移植でした。または、未使用のワイヤーの 2 つは脳波との組み合わせでスリープ/スリープ解除の状態を調べるために重要である筋活動の測定を提供する筋電図 (EMG) を記録する首の筋肉を縫合することができます。別の可能な変更は、ワイヤ テザーに合わせて変更全身脈チャンバ内で動物を記録するでしょう。脈で小さい圧力の変化は、インスピレーションに関連付けられている、有効期限は、呼吸波形に変換されます。そのため、脈を組み込むことによって、ビデオの同時記録を達成するために技術的には可能だと脳波・心電図、筋電図、呼吸は、読み出し時の動作と脳、心臓、筋肉、肺の活動を表します。このような包括的な生体内の生理学的な録音は、テレメトリーでは事実上不可能です連結アプローチを行う今日のシステムはマウスで複数の生体信号の同時の尋問のための特に強力なツールをここで説明します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、市民てんかん (許可番号 35489) の研究のため米国によって支えられました。健康の国民の協会は、(許可番号 R01NS100954、R01NS099188)。ルイジアナ州立大学健康科学センター マルコム ・ ファイスト員。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VistaVision stereozoom dissecting microscope | VWR | ||
| Dolan-Jenner MI-150 microscopy illuminator, with ring light | VWR | MI-150RL | |
| CS Series scale | Ohaus | CS200 | for weighing animal |
| T/Pump professional | Stryker | recirculating water heat pad system | |
| Ideal Micro Drill | Roboz Surgical Instruments | RS-6300 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set | Cell Point Scientific | 60-1000 | only need the 0.8-mm size |
| electric trimmer | Wahl | 9962 | mini clipper |
| tabletop vise | Eclipse Tools | PD-372 | PD-372 Mini-tabletop suction vise |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | ToughCut, Straight, Sharp/Sharp, 11.5 cm |
| Crile-Wood needle holder | Fine Science Tools | 12003-15 | Straight, Serrated, 15 cm, with lock - For applying wound clips |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools | 11297-00 | Standard Tips, Curved, Dumostar, 11.5 cm |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Serrated, Straight, 12 cm |
| Olsen-Hegar needle holder with suture cutter | Fine Science Tools | 12002-12 | Straight, Serrated, 12 cm, with lock |
| scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| surgical blades #15 | Havel's | FHS15 | |
| 6-0 surgical suture | Unify | S-N618R13 | non-absorbable, monofilament, black |
| gauze sponges | Coviden | 2346 | 12 ply, 7.6 cm x 7.6 cm |
| cotton-tipped swabs | Constix | SC-9 | 15.2-cm total length |
| super glue | Loctite | LOC1364076 | gel control |
| Michel wound clips, 7.5mm | Kent Scientific | INS700750 | |
| polycarboxylate dental cement kit | Prime-dent | 010-036 | Type 1 fine grain |
| tuberculin syringe | BD | 309623 | |
| polyethylene tubing | Intramedic | 427431 | PE160, 1.143 mm (ID) x 1.575 mm (OD) |
| chlorhexidine | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Puralube vet ointment | Dechra Veterinary Products | opthalamic eye ointment | |
| mouse anesthetic cocktail | Ketamine (80 mg/kg), Xylazine (10 mg/kg), and Acepromazine (1 mg/kg) | ||
| carprofen | Rimadyl (trade name) | ||
| HydroGel | ClearH20 | 70-01-5022 | hydrating gel; 56-g cups |
| Ponemah software | Data Sciences International | data acquisition and analysis software; version 5.2 or greater with Electrocardiogram Module | |
| 7700 Digital Signal conditioner | Data Sciences International | ||
| 12 Channel Isolated Bio-potential Pod | Data Sciences International | ||
| fish tank | Topfin | for use as recording chamber; 20.8 gallon aquarium; 40.8 cm (L) X 21.3 cm (W) X 25.5 cm (H) | |
| Digital Communication Module (DCOM) | Data Sciences International | 13-7715-70 | |
| 12 Channel Isolated Bio-potential Pod | Data Sciences International | 12-7770-BIO12 | |
| serial link cable | Data Sciences International | J03557-20 | connects DCOM to bio-potential pod |
| Acquisition Interface (ACQ-7700USB) | Data Sciences International | PNM-P3P-7002 | |
| network video camera | Axis Communications | P1343, day/night capability | |
| 8-Port Gigabit Smart Switch | Cisco | SG200-08 | 8-port gigabit ethernet swith with 4 power over ethernet supported ports (Cisco Small Business 200 Series) |
| 10-pin male nanoconnector with guide post hole | Omnetics | NPS-10-WD-30.0-C-G | electrode for implantation on the mouse head |
| 10-socket female nanoconnector with guide post | Omnetics | NSS-10-WD-2.0-C-G | connector for electrode implant |
| 1.5-mm female touchproof connector cables | PlasticsOne | 441 | 1 signal, gold-plated; for connecting the wiring from the head-mount implant to the bio-potential pod |
| soldering iron | Weller | WESD51 BUNDLE | digital soldering station |
| solder | Bernzomatic | 327797 | lead free, silver bearing, acid flux core solder |
| heat shrink tubing | URBEST | collection of tubing with 1.5- to 10-mm internal diameters | |
| heat gun | Dewalt | D26960 | |
| mounting tape (double-sided) | 3M Scotch | MMM114 | 114/DC Heavy Duty Mounting Tape, 2.54 cm x 1.27 m |
| desktop computer | Dell | recommended minimum requirements: 3rd Gen Intel Core i7-3770 processor with HD4000 graphics; 4 GB RAM, 1 GB AMD Radeon HD 7570 video card; 1 TB hard drive; Windows 7 OS | |
| permanent marker | Sharpie | 37001 | black color, ultra fine point |
| toothpicks | for mixing and applying the polycarboxylate dental cement | ||
| LabChart Pro software | ADInstruments | power spectrum software; version 8.1.3 or greater | |
| Kubios HRV software | Univ. of Eastern Finland | HRV analysis software; version 2.2 | |
| Notepad | Microsoft | simple text editor software |
References
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