Summary

Incorporando um grânulo de célula endotelial brotando ensaio pericitos

Published: February 16, 2018
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Summary

Este apresenta protocolo um grânulo de romance em vitro ensaio que mais apropriadamente modela o processo na vivo brotando angiogênese incorporando pericitos. Esta modificação permite que o ensaio de grânulo mais fielmente recapitular as interações heterotypic celulares entre células endoteliais e células murais que são críticas para a angiogênese.

Abstract

Angiogênese é o crescimento de novos vasos da vasculatura pré-existentes e é um importante componente de muitos processos biológicos, incluindo a embriogênese e desenvolvimento, cicatrização de feridas, crescimento tumoral e metástase e doenças oculares e cardiovasculares. Eficaz em vitro modelos que recapitular a biologia da angiogênese são necessários apropriadamente estudar esse processo e identificar mecanismos de regulação que pode, finalmente, ser alvo de novas estratégias terapêuticas. O ensaio de angiogênese grânulo tem demonstrado anteriormente para recapitular os múltiplos estágios de germinação endotelial in vitro. No entanto, uma limitação deste teste é uma falta de endotelial – interações célula mural, , que são fundamentais para a regulação fenotípica e molecular da célula endotelial funcionam na vivo. O protocolo dado aqui apresenta uma metodologia para a incorporação de células murais o ensaio da angiogênese do grânulo e demonstra uma associação apertada de células endoteliais e pericitos durante a germinação em vitro. O protocolo detalha também uma metodologia para a eficaz silenciamento de genes-alvo usando siRNA em células endoteliais para estudos mecanicistas. No total, este protocolo fornece um ensaio em vitro que mais apropriadamente modela os tipos de célula diversos envolvidos na angiogênese de brotação e fornece uma plataforma mais fisiologicamente relevantes para avaliação terapêutica e romance descoberta de mecanismos de regulação de angiogênese.

Introduction

Angiogênese é vital para a embriogênese apropriado e cicatrização de feridas, e também desempenha papel chave em inúmeras doenças, incluindo câncer doença1 e artéria coronária de progressão. 2 , 3 ter uma melhor compreensão de como a angiogênese ocorre durante o desenvolvimento normal, e como ele é reativado em contextos patológicos, é crítico para o desenvolvimento do romance, terapêutica eficaz. Fiel em vitro modelos que recapitular as etapas importantes e tipos de células envolvidos na angiogênese na vivo são necessários para permitir que os pesquisadores para melhor caracterizar os mecanismos moleculares, dirigindo a angiogênese e fazer novas descobertas no Regulamento endotelial.

Nakatsu e Hughes otimizaram a um ensaio de grânulo brotos que demonstraram ter submetido os vários estágios conhecidos da angiogênese que brota. 4 , 5 o objetivo do método apresentado aqui é construir sobre o ensaio otimizado por Nakatsu e Hughes incorporando perictyes para o ensaio, para que as funções parácrina e juxtracrine de células murais na célula endotelial brotação podem ser incorporadas em estudos de romance angiogênese. Pericitos são células murais que são definidas pelo seu papel como células que mantêm fechem contato físico com células endoteliais devido sua sendo incorporado na membrana vascular do porão. 6 pericitos e células endoteliais engajar em cruz-conversa complexo através de sinalização de vias, incluindo entalhe sinalização, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ e muitos outros. 7 , 8 modelos de Mouse deficientes nessas vias de sinalização demonstram Pericito pobre cobertura de desenvolver vasculatura na embriogênese, levando a remodelação vascular pobre e vasculatura disfuncional. 7 além disso, o papel de pericitos em angiogênese patológica é importante, mas muitas vezes subestimado. Por exemplo, uma característica única da vasculatura do tumor é que os vasos são mais imaturos, gotejantes e disfuncional devido à cobertura de pobre Pericito. 9 foi proposto que a presença ou ausência de pericitos dramaticamente impacta o fenótipo dos vasos sanguíneos do tumor e é um importante mediador das respostas a terapias antitumorais e antiangiogênica. 9 assim, incluindo o papel de pericitos em ensaios em vitro é chave para capturar mais completamente os importantes mecanismos de regulação endotelial.

Embora existam muitos ensaios in vitro e ex vivo atualmente empregados para estudar a angiogênese, existem deficiências a considerar em cada um. Algumas, como a proliferação endotelial e ensaios de migração endotelial, são excessivamente simplificadas e concentrar-se em uma função endotelial em um ambiente isolado na cultura do tecido plástico. 10 outros ensaios ocorrem num mais 3 dimensional (3D) cenário, tais como o ensaio de formação de tubo Matrigel,10 mas estes ensaios são ainda muito simplificados e focar mais na capacidade das células endoteliais, migrar e formar de novo vascular estruturas, em oposição a brotação da vasculatura pré-existente. Além disso, nenhum destes ensaios incorporar tipos de células do mural. Há ex vivo modelos tais como o ensaio de aorta do anel que incorporam pericitos presentes no órgão hospedeiro, mas manipulação genética destes modelos é muito mais difícil devido à necessidade de gerar modelos de rato transgénico ou nocaute do percursos de interesse. O grânulo brotando do ensaio é ideal porque ele modela brotando endotelial, proliferação, migração e formação nem anastomose e lúmen em uma matriz 3D. 4 o ensaio fielmente permite avaliação mecanicista das muitas diferentes fases de brotação, enquanto ainda permitindo a modificação genética direta das células endoteliais ou pericitos em um ambiente mais controlado. Os coágulos de fibrina contendo os grânulos de germinação podem ser facilmente corrigidos, manchados e fotografados em diferentes fases de brotação; esses brotos também podem ser colocados em uma câmara ao vivo de imagem para executar em tempo real imagens de brotação. A metodologia apresentada aqui é ideal para estudar os mecanismos básicos da angiogênese através na fenotipagem de profundidade e análise exaustiva das vias ativado durante a angiogênese.

Protocol

Dia 1: 1. transiente transfecção de células endoteliais Se desejado, realizar uma transfecção transiente de humano Umbilical veia endoteliais células (HUVEC) usando oligonucleotídeos gene regulamentares (por exemplo, micro-RNAs ou RNA de interferência pequeno (siRNA)) e o reagente lipofectamine apropriado de acordo com instruções do fabricante.Nota: Este protocolo também teve grande sucesso, realizando transfections reversos com sequências de…

Representative Results

Este protocolo permite uma associação apertada da dois célula tipos in vitro, e a presença dos pericitos complementa a ocorrência de germinação (figura 1A, B). O protocolo também permite eficaz silencioso (por exemplo, através da interferência do RNA) de um gene de interesse em um tipo de célula de interesse, tais como (VEGFA especificamente nas células endoteliais) ou PDGFRβ em pericitos7</sup…

Discussion

Este protocolo apresenta um método para caracterizar a fases complexas e interacções celulares heterotypic de brotação angiogênese, permitindo que o pesquisador empregar abordagens genéticas e da imagem latente para conduzir investigações mecanicistas minuciosos. Ao realizar o ensaio, é essencial que eficiente revestimento endotelial dos grânulos ocorre durante o grânulo passos de agitação. Revestimento endotelial pobre será feito evidente, se os grânulos parecem não ter uma superfície áspera, como bol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos os Drs Victoria Bautch e Joshua Boucher discussões úteis e conselhos sobre como otimizar padrão do grânulo brotando condições de ensaio e um ensaio de germinação do protocolo de coloração. S.H.A. foi apoiada em parte por uma concessão do Instituto Nacional de General Medical Ciências, sob 5T32 GM007092 de prêmio.

Materials

Sterile Pipette tips VWR
Pipettors Eppendorf
Complete EGM2 Media Bullet Kit Lonza CC-3162 HUVEC Media
MEM Gibco 11095114 10T1/2 Media
DMEM Gibco 11965118 NHLF Media
Tissue culture-grade PBS Gibco 14190-144 Magnesium and calcium free
Accutase Life Technologies A1110501 For lifting HUVEC
Trypsin Life Technologies 15050065 For lifting 10T 1/2 and NHLF
Customs siRNAs Sigma
Lipofectamine RNAiMax Life Technologies 13778150
HUVEC Lonza C2517A
10T 1/2 ATCC
NHLF ATCC
Cytodex 3 microcarrier beads Sigma C3275
Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates Corning
Fibrinogen from bovine plasma Sigma F8630
Thrombin Sigma t9549
Aprotinin Sigma a3428
Falcon Round-Bottom Tubes Corning
Tissue culture incubator and hood
24-well glass bottom plates MatTek P24G1.513F Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.
Sterile Filtration Device

References

  1. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
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Cite This Article
Azam, S. H., Smith, M., Somasundaram, V., Pecot, C. V. Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay. J. Vis. Exp. (132), e57309, doi:10.3791/57309 (2018).

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