Summary

Perisitlerden tahlil filizlenen bir endotel hücre boncuk birleşmeyle

Published: February 16, 2018
doi:

Summary

Bir roman vitro boncuk tahlil bu protokolü sunar daha uygun modelleri perisitlerden dahil ederek angiogenez çimlenme vivo içinde süreci. Bu değişiklik daha sadakatle heterotypic hücresel etkileşimlerin endotel hücreleri ve anjiogenezi için kritik olan duvar hücreler arasındaki özetlemek boncuk tahlil sağlar.

Abstract

Angiogenez önceden varolan damarlara yeni gemileri büyüme ve oküler ve kardiyovasküler hastalıklar ve embriyo ve geliştirme, yara iyileşmesi, tümör büyüme ve metastaz, gibi birçok biyolojik süreçleri önemli bir bileşenidir. Biyoloji angiogenez özetlemek etkili vitro modelleri uygun şekilde bu işlem çalışma ve sonuçta hedeflenebilir düzenleme mekanizmaları için yeni tedavi stratejileri belirlemek için gereklidir. Boncuk angiogenez tahlil daha önce birden fazla aşamalarında endotel çimlenme özetlemek için göstermiş olduğu tüp bebek. Ancak, bu testin bir sınırlama bir olmaması, endotel – duvar hücre etkileşimleri, endotel hücre moleküler ve fenotipik Yönetmeliği anahtarıdır vivoişlev. Burada verilen protokol duvar hücreleri birleşme boncuk angiogenez tahlil içine bir metodoloji sunar ve sıkı Derneği endotel hücreleri ve perisitlerden çimlenme içinde vitrosırasında gösterir. Protokol Ayrıca siRNA endotel hücrelerinde mekanik çalışmaları için kullanarak hedef genlerin etkili susturulması için bir metodoloji ayrıntıları. Özet olarak, bu iletişim kuralı daha uygun farklı hücre tipleri angiogenez çimlenme dahil modelleri ve terapötik değerlendirme ve roman keşfi için daha fizyolojik-alakalı bir platform sağlayan bir vitro tahlil sağlar angiogenez düzenleme mekanizmaları.

Introduction

Angiogenez uygun embriyo ve yara iyileşmesi için hayati önem taşımaktadır ve bu da kanser ilerleme1 ve koroner arter hastalığı da dahil olmak üzere çok sayıda hastalıklarda kilit rolü oynar. 2 , 3 daha iyi anlamak nasıl angiogenez normal gelişim sırasında oluşur ve nasıl patolojik bağlamlarda yeniden sahip roman, etkili tedavi gelişimi için önemlidir. Önemli aşamaları ve hücre tipleri angiogenez vivo içinde içinde yer alan özetlemek sadık vitro modelleri araştırmacılar daha iyi angiogenez sürüş moleküler mekanizmaları karakterize ve yeni keşifler yapmak için izin vermek için gerekir endotel yönetmelikte.

Nakatsu ve Hughes angiogenez çimlenme, çok bilinen aşamaları uğrar göstermiştir filizlenen bir boncuk tahlil optimize. 4 , 5 burada sunulan yöntemin amacı parakrin ve juxtracrine rollerinin çimlenme endotel hücre duvar hücrelerinin içinde dahil edilebilir Nakatsu ve Hughes tarafından perictyes tahlil içine dahil ederek optimize tahlil üzerine inşa etmektir roman angiogenez çalışmalar. Perisitlerden kendi içinde damar membran gömülü nedeniyle endotel hücreleri ile fiziksel temas korumak hücreleri kapatmak gibi onların rol tarafından tanımlanan duvar hücrelerdir. 6 perisitlerden ve endotel hücreleri karmaşık çapraz-hadis yollar çentik dahil olmak üzere sinyal aracılığıyla sinyal, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ ve diğer pek çok meşgul. 7 , 8 fare modelleri bu sinyal yollar eksik embriyogenez, zavallı vasküler remodeling için önde gelen damarlara ve işlevsel olmayan damarlara geliştirme zavallı pericyte kapsama göstermektedir. 7 Ayrıca, önemli ama oftentimes altında takdir perisitlerden patolojik angiogenez rolü vardır. Örneğin, bir benzersiz tümör damarlara damarları daha olgunlaşmamış, sızan ve zavallı pericyte kapsamı nedeniyle işlevsiz özelliğidir. 9 perisitlerden olup önemli ölçüde tümör kan damarlarının fenotip etkileri ve yanıt anjiogenik ve antitümör tedaviler önemli bir arabulucu olduğunu önerilmiştir. 9 böylece, vitro deneyleri perisitlerden rolü dahil olmak üzere daha eksiksiz endotel Yönetmeliğin önemli mekanizmalar yakalamak için anahtardır.

Şu anda angiogenez çalışmaya istihdam birçok vitro ve ex vivo deneyleri olmakla birlikte, her göz önünde bulundurulacak eksiklikler bulunmaktadır. Endotel proliferasyon ve endotel geçiş deneyleri, gibi bazı aşırı Basitleştirilmiş ve odak üzerinde doku kültürü plastik yalıtılmış bir ortamda bir endotel fonksiyonları üzerine. 10 Matrigel tüp oluşumu tahlil,10 ama bu deneyleri hala oversimplified ve daha fazla göç ve de novo vasküler endotel hücreleri yeteneği üzerinde odaklanmak gibi diğer deneyleri bir daha fazla 3 boyutlu (3D) ayarı, ortaya yapıları, önceden varolan damarlara çimlenme aksine. Ayrıca, bu deneyleri hiçbiri duvar hücre tipleri dahil. Perisitlerden ana organ mevcut dahil ex vivo modeli yüzük aort tahlil gibi ama bu modellerin genetik manipülasyon olduğunu çok daha nakavt veya transgenik fare modelleri üreten gerekliliği nedeniyle zor yollar ilgi. Endotel çimlenme, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve 3D matris bile anastomoz ve Lümen oluşumunda modelleri çünkü tahlil çimlenme boncuk idealdir. 4 tahlil Sadakatle çimlenme, hala doğrudan genetik değişiklik endotel hücreleri veya daha kontrollü bir ortamda perisitlerden için izin verirken birçok farklı aşamalarında mekanik değerlendirmesini sağlar. Çimlenme boncuk içeren fibrin pıhtısı kolayca sabit, lekeli ve çimlenme farklı aşamalarında görüntüsü; Bu lahanası da çimlenme, gerçek zamanlı görüntüleme gerçekleştirmek için canlı bir görüntüleme odasında yerleştirilebilir. Burada sunulan metodoloji angiogenez derinlik fenotipleme ile temel mekanizmaları ve anjiogenezi sırasında aktif yollar ayrıntılı analizi eğitimi için idealdir.

Protocol

1. gün: 1. geçici Transfection endotel hücrelerinin İstenirse, geçici transfection, insan göbek damar endotel hücreleri (gen düzenleyici oligonucleotides (örneğin mikro RNA’lar veya küçük müdahale RNA (siRNA)) ve uygun lipofectamine reaktif göre kullanarak HUVEC) gerçekleştirmek prosedürü yerine getirin.Not: Bu protokol özel siRNA dizileri ve ticari transfection reaktifi (bkz: malzemeler tablo) ile ters transfections gerçekleştirme …

Representative Results

Bu iletişim kuralı iki hücre türleri in vitro sıkı bir Derneği için izin verir ve perisitlerden varlığı çimlenme (şekil 1A, B) oluşumunu tamamlar. Sağlayan protokol Ayrıca etkili susturmak (örneğin RNA müdahale yoluyla) bir genin bir hücre tipi faiz (özellikle de endotel hücreleri VEGFA) veya perisitlerden PDGFRβ gibi7,12 ilgi tahlil sırasınd…

Discussion

Bu iletişim kuralı için karmaşık aşamaları ve araştırmacı ayrıntılı mekanik soruşturma yapma genetik ve görüntüleme yaklaşımlar istihdam sağlayarak angiogenez çimlenme heterotypic hücresel etkileşimlerin karakterize bir yöntem sunuyor. Tahlil gerçekleştirirken, verimli endotel kaplama boncuk boncuk sırasında ajitasyon adımlar yer alır gereklidir. Zavallı endotel kaplama boncuklar bir golf topu gibi pütürlü yüzeyi jel implantasyon öncesinde ertesi sabah olması ve bunun yerine tamamen d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz yararlı tartışmalar için Drs. Victoria Bautch ve Joshua Boucher teşekkür ederim ve standart boncuk en iyi duruma getirme konusunda tavsiye tahlil koşulları ve filizlenen bir tahlil Protokolü boyama, çimlenme. S.H.A. kısmen bir hibe–dan ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü altında tarafından desteklenen 5T32 GM007092 ödül.

Materials

Sterile Pipette tips VWR
Pipettors Eppendorf
Complete EGM2 Media Bullet Kit Lonza CC-3162 HUVEC Media
MEM Gibco 11095114 10T1/2 Media
DMEM Gibco 11965118 NHLF Media
Tissue culture-grade PBS Gibco 14190-144 Magnesium and calcium free
Accutase Life Technologies A1110501 For lifting HUVEC
Trypsin Life Technologies 15050065 For lifting 10T 1/2 and NHLF
Customs siRNAs Sigma
Lipofectamine RNAiMax Life Technologies 13778150
HUVEC Lonza C2517A
10T 1/2 ATCC
NHLF ATCC
Cytodex 3 microcarrier beads Sigma C3275
Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates Corning
Fibrinogen from bovine plasma Sigma F8630
Thrombin Sigma t9549
Aprotinin Sigma a3428
Falcon Round-Bottom Tubes Corning
Tissue culture incubator and hood
24-well glass bottom plates MatTek P24G1.513F Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.
Sterile Filtration Device

References

  1. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
  2. Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
  3. Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
  4. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
  5. Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
  6. Sims, D. E. The pericyte–a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
  7. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  8. Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
  9. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  10. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
  11. Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
  12. Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
  13. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).

Play Video

Cite This Article
Azam, S. H., Smith, M., Somasundaram, V., Pecot, C. V. Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay. J. Vis. Exp. (132), e57309, doi:10.3791/57309 (2018).

View Video