ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए nanoliter आकार के नमूना संस्करणों की तैयारी के लिए एक साधन और तरीके प्रस्तुत किया गया है । कोई कागज सोख्ता कदम की आवश्यकता है, इस प्रकार हानिकारक परिणाम यह प्रोटीन के लिए हो सकता से परहेज, काफी नमूना हानि को कम करने और दृश्य प्रोटियोमिक् के लिए एकल कोशिका lysate के विश्लेषण को सक्षम करने.
हाल ही में तकनीकी प्रगति के कारण, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) तेजी से परमाणु संकल्प करने के लिए प्रोटीन परिसरों के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए एक मानक विधि बनता जा रहा है । हालांकि, प्रोटीन अलगाव तकनीक और उनके लिए नमूना तैयारी तरीकों एक अड़चन बने हुए हैं । एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या (१००,००० कुछ लाख के लिए) व्यक्तिगत प्रोटीन कणों के एक कण EM दृष्टिकोण द्वारा प्रोटीन के उच्च संकल्प के विश्लेषण के लिए छवि बनने की जरूरत है, लघुकृत नमूना हैंडलिंग तकनीक और microfluidic सिद्धांतों बनाने संभव.
एक लघुकृत, कागज-सोख्ता-मुक्त उंहें नमूना पूर्व कंडीशनिंग के लिए ग्रिड तैयारी विधि, उंहें ग्रिड भड़काना और पोस्ट प्रोसेसिंग कि केवल nanoliter-नमूना की मात्रा की खपत प्रस्तुत की है । विधि उप nanoliter परिशुद्धता के साथ एक वितरण प्रणाली तरल और em ग्रिड भड़काना, ग्रिड तापमान जिससे EM ग्रिड के ऊपर सापेक्ष आर्द्रता का निर्धारण नियंत्रित करने के लिए, और एक पिकअप और डुबकी-तंत्र के लिए नमूना नियंत्रण का उपयोग करता है vitrification । क्रायो के लिए उंहें, एक em ग्रिड तापमान नियंत्रित चरण पर रखा गया है और नमूना एक केशिका में aspirated है । केशिका टिप ग्रिड सतह के लिए निकटता में तैनात है, ग्रिड नमूना के साथ भरी हुई है और अधिक microcapillary में फिर से aspirated है । बाद में, नमूना फिल्म स्थिर और थोड़ा नियंत्रित पानी ओस-बिंदु के सापेक्ष मंच तापमान की भरपाई द्वारा विनियमित वाष्पीकरण द्वारा thinned है । एक दिया बिंदु पर लेने और डुबकी तंत्र शुरू हो रहा है, तेजी से नमूना vitrification के लिए तरल एतान में प्रधानमंत्री EM ग्रिड स्थानांतरित. वैकल्पिक रूप से, नमूना कंडीशनिंग विधियों नकारात्मक दाग (NS) EM के लिए nanoliter-आकार नमूना वॉल्यूम तैयार करने के लिए उपलब्ध हैं ।
के तरीके बहुत नमूना खपत को कम करने और इस तरह के फिल्टर कागज पारंपरिक तरीकों में इस्तेमाल किया सोख्ता के रूप में संभावित प्रोटीन के लिए हानिकारक दृष्टिकोण से बचने के । इसके अलावा, नमूना आवश्यक की मामूली राशि इस तरह के तेजी से नमूना कंडीशनिंग के रूप में उपंयास प्रयोगात्मक रणनीतियों, की अनुमति देता है, के लिए एकल सेल lysis के साथ संयोजन “दृश्य प्रोटियोमिक्,” या “” दोषरहित “के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कुल नमूना तैयारी जटिल नमूने ।
हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) द्वारा प्रोटीन परिसरों के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए हाल के वर्षों के दौरान बड़े पैमाने पर उन्नत है । सुधार एक “संकल्प क्रांति”1,2 के लिए मार्ग प्रशस्त किया और मौलिक संरचनात्मक अनुसंधान बदल दिया है । क्रांति क्रायो के आगमन के साथ शुरू इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM)3,4, शारीरिक स्थितियों के करीब के तहत जैविक नमूनों की तैयारी की अनुमति जबकि विकिरण संवेदनशीलता को कम करने और रोकने संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के उच्च निर्वात में नमूना वाष्पीकरण5. अगले वर्षों में, वृद्धिशील प्रौद्योगिकीय प्रगति धीरे से संकल्प प्राप्त वृद्धि हुई । इन नवाचारों के बीच क्षेत्र के आवेदन-उत्सर्जन बंदूकें6,7थे, और, हाल ही में, बेहतर डेटा विश्लेषण एल्गोरिदम, जैसे अधिकतम संभावना8तरीके,9। प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर कैमरा10,11,12,13, मूवी मोड इमेजिंग और साथ सॉफ्टवेयर विकास14,15, 16 , 17, अंतिम सफलता प्रदान की एकल कण विश्लेषण द्वारा जैविक नमूनों के लिए परमाणु संकल्प प्राप्त करने के लिए आवश्यक (एक समीक्षा के लिए चेंग, Grigorieff, एट अल देखें । 18). क्रायो-EM के महत्व को हाल ही में रसायन विज्ञान के लिए नोबेल पुरस्कार के पुरस्कार द्वारा मांयता प्राप्त अग्रदूतों में से तीन को किया गया ।
उनि द्वारा एक जैविक नमूना छवि के लिए, नमूना के साथ EM ग्रिड लोड करने के लिए इस्तेमाल किया विधि (बाद में “ग्रिड तैयारी” के रूप में संदर्भित) यह सुनिश्चित करना चाहिए कि परिणामी नमूना परत (i) काफी पतली है (< 100 एनएम) से बचने के लिए व्यापक शोर से लोचदार या गुणा बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों, (ii) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के उच्च निर्वात को झेलने, और (iii) विकिरण क्षति से अधिक अणुओं की रक्षा करता है । दो मुख्य तरीके इन अनुलाभ को पूरा करने के लिए उपयोग किया जाता है: नकारात्मक दाग(एन एस)19,20 प्रक्रियाओं (चित्रा 1एक) adsorb एक पतली कार्बन फिल्म के लिए नमूना, को अमली भारी धातु में एंबेड अणुओं एम्बेड और फिर विधानसभा को हवा में सूखने दें । यह सरल और जल्दी है, और भरी हुई EM ग्रिड (बाद में “नमूना ग्रिड” के रूप में निर्दिष्ट) को स्टोर करने के लिए आसान कर रहे हैं और समय की विस्तारित अवधि के लिए रखा जा सकता है (आम तौर पर साल). उनि में, तैयारियां उच्च एन एस के कारण विपरीत प्रदर्शन और क्रायो की तुलना में उच्च इलेक्ट्रॉन खुराक बर्दाश्त-तैयारी है, लेकिन संकल्प लगभग 20 Å. क्रायो-EM प्रक्रियाओं को सीमित है (1 आंकड़ाख) छेद कार्बन का समर्थन करता है काम करते हैं । नमूना समाधान की एक पतली फिल्म छेद भर में फैले और EM ग्रिड एक cryogen में डूब जाता है, आमतौर पर तरलीकृत एतान, तेजी से इसे नीचे-150 डिग्री सेल्सियस शांत करने के लिए । परिणाम एक अमली, vitrified, ५० के लिए १०० एनएम समर्थन छेद में समाधान की मोटी फिल्म है । यह पतली, अमली फिल्म इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में उच्च वैक्यूम का सामना करती है और, आदर्श मामले में, अपने पैतृक राज्य में जैविक संरचनाओं को बरकरार रखता है । प्रक्रिया जैविक नमूनों उच्च संकल्प पर छवि में होना करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि, नमूना ग्रिड devitrification से बचने के लिए हर समय-१५० डिग्री सेल्सियस नीचे तापमान पर रखा जाना चाहिए । यह अपेक्षाकृत उच्च इलेक्ट्रॉन कम तापमान के कारण खुराक का उपयोग कर imaged किया जा सकता है, लेकिन इसके विपरीत और संकेत करने वाली शोर अनुपात फिर भी कम है । इसलिए, औसत तकनीक के विपरीत बढ़ाने के लिए कार्यरत है और प्रदान की, नमूना अलग कोणों से imaged है, एक उच्च संकल्प तीन आयामी (3 डी) नक्शा खंगाला जा सकता है । अब के रूप में 3 डी पुनर्निर्माण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया और अत्यधिक सफल तरीका एकल कण दृष्टिकोण है । हाल ही में एक समीक्षा के लिए, अल.18पर चेंग देखें ।
नकारात्मक दाग उनि (एन एम) स्क्रीनिंग और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है, जब उच्च कंट्रास्ट की जरूरत है या जब नमूना की केवल सीमित मात्रा में उपलब्ध है (सोखना कार्बन फिल्म के लिए आम तौर पर नमूना ध्यान केंद्रित) । एकल कण क्रायो-EM सोने के मानक विधि अगर उच्च संकल्प प्रोटीन संरचना के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए उद्देश्य से कर रहे हैं ।
चित्रा 1: उनि ग्रिड की तैयारी और शास्त्रीय (पैनल ए, बी) और एक microfluidic दृष्टिकोण (पैनल सी, डी) के बीच तुलना के सिद्धांतों । क) शास्त्रीय एनएस-em ग्रिड की तैयारी: नमूने के बारे में 3 µ एल हाथ से एक EM एक सतत कार्बन फिल्म के साथ कवर ग्रिड पर pipetted है (बाद में एक ‘ एन एस के रूप में संदर्भित-em ग्रिड ‘) (i) । लगभग 10 एस के लिए मशीन के बाद, फिल्टर कागज दूर पक्ष से अतिरिक्त तरल दाग के लिए प्रयोग किया जाता है (द्वितीय), एक पतली पानी फिल्म में adsorbed के अणुओं को छोड़कर । बाद में, प्रोटीन एक भारी धातु नमक समाधान में मशीन है, उदाहरणके लिए, 2% uranyl एसीटेट, 20 एस के लिए (iii), और फिर से तरल सोख्ता द्वारा साइड से हटा दिया जाता है फिल्टर पेपर (iv) का उपयोग कर । अंत में, EM-ग्रिड हवा में शुष्क करने के लिए छोड़ दिया है । ख) शास्त्रीय क्रायो-EM ग्रिड तैयारी: नमूना के बारे में 3 µ एल एक हाथ से एक छेद कार्बन फिल्म पर pipetted हैं । पतली नमूना फिल्म बनाने के लिए, एक या दोनों पक्षों (ii) से पेपर-सोख्ता फेस-ऑन द्वारा अधिशेष तरल निकाल दिया जाता है । अंत में, ग्रिड तेजी से तरल एतान में vitrification (iii) के लिए डुबकी लगाई है । ग) एनएस-EM ग्रिड cryoWriter सेटअप का उपयोग कर तैयारी: एक 5 nL मात्रा एक microcapillary (i) का उपयोग कर नमूना स्टॉक से aspirated है । नमूना कंडीशनिंग के लिए, microcapillary टिप कंडीशनिंग समाधान में डूब जाता है, उदाहरणके लिए, 2% अमोनियम एसीटेट । आयनों और छोटे अणुओं प्रसार (द्वितीय) द्वारा विमर्श कर रहे हैं । ध्यान दें कि microcapillary के आयामों को सुनिश्चित करना है कि पूरी प्रक्रिया प्रसार प्रेरित है । प्रोटीन नमक आयनों की तुलना में बहुत कम प्रसार स्थिरांक है और24खो काफी नहीं हैं । अंत में, नमूना ग्रिड पर तिरस्कृत और (iii) शुष्क करने की अनुमति दी है । घ) क्रायो के सिद्धांतों-em ग्रिड तैयारी cryoWriter-आधारित विधि का उपयोग कर: एक EM ग्रिड एक छिद्रित कार्बन फिल्म के साथ कवर एक तापमान नियंत्रित मंच की सतह पर रखा गया है और चिमटी द्वारा आयोजित किया जाता है । मंच के तापमान ग्रिड पर्यावरण के ओस बिंदु तापमान से एक ऑफसेट पर नियंत्रित किया जाता है । ग्रिड नमूना युक्त microcapillary के सापेक्ष ले जाया गया है और microcapillary जब तक यह ग्रिड के ऊपर कुछ micrometers है कम है । बाद में, नमूना के कुछ nanoliters इसे से तिरस्कृत कर रहे हैं, जबकि मंच एक सर्पिल पैटर्न में ले जाया जाता है; अतिरिक्त तरल re-aspirated (आई) है । EM ग्रिड भड़काने के बाद, microcapillary वापस ले लिया है और ग्रिड तापमान नियंत्रित मंच पर रहता है (बाद में एक कम समय के लिए ओस बिंदु (डीपी) चरण के रूप में भेजा) के लिए एक नियंत्रित राशि के नमूने को वाष्पित करने की अनुमति है । डुबकी ठंड के लिए, ग्रिड तेजी से चिमटी (द्वितीय), ऊर्ध्वाधर स्थिति में ९० डिग्री से फ़्लिप का उपयोग कर मंच से वापस ले लिया है, और एक cryogen स्नान (iii) (बाद में के रूप में संदर्भित करने के लिए ‘ उठाओ और डुबकी ‘ तंत्र) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
क्योंकि वे का आविष्कार किया गया दुर्भाग्य से, ग्रिड तैयारी एन एस और क्रायो-EM के लिए इस्तेमाल किया तरीकों काफी सुधार नहीं किया है । वर्तमान कमियां उच्च नमूना खपत (लगभग 1 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन के 3 µ एल) और बड़ी राशि (> ९९%) नमूना खोया (चित्रा 1ए, बी) । इसके अलावा, शास्त्रीय विधि क्रायो के लिए ग्रिड तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन के लिए एक कठोर प्रक्रिया है: पहला, यह कागज पर एक व्यापक चेहरे शामिल-सोख्ता कदम (चित्रा 1बी, द्वितीय), और, दूसरा, प्रोटीन हवा के संपर्क में है पानी इंटरफ़ेस 21समय की एक महत्वपूर्ण राशि के लिए । यहां, नमूना पूर्व कंडीशनिंग के लिए एक वैकल्पिक विधि, नमूना ग्रिड की तैयारी और पोस्ट-प्रोसेसिंग (ग्रिड सुखाने या vitrification) के लिए एनएस-em (चित्रा 1C) या क्रायो-em (चित्रा 1D) प्रस्तुत किया है । में घर बनाया सेटअप, कहा जाता है “cryoWriter”, लघुकृत नमूना हैंडलिंग प्रौद्योगिकी और microfluidic सिद्धांतों का उपयोग करता है महाप्राण, हालत और नमूना वितरण, कागज सोख्ता से परहेज पूरी तरह से और के लिए पतली नमूनों के लिए वैकल्पिक तरीके प्रदान क्रायो-EM । यह काफी नमूना खपत कम कर देता है और एक पूरे के रूप में नमूना तैयारी पर उपयोगकर्ता नियंत्रण में सुधार । इसके अलावा, विधि उपंयास प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की अनुमति देता है; जैसे एक दृष्टिकोण में व्यक्तिगत कोशिकाओं के पृथक जैविक घटकों की तैयारी के रूप में कहा जाता है “एकल कक्ष दृश्य प्रोटियोमिक्”22,23,24,25।
‘ cryoWriter ‘ उपकरण और एन एस के लिए नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल और क्रायो-EM से nL आकार कुल नमूना मात्रा और पूरी तरह से बचने शास्त्रीय कागज-सोख्ता कदम प्रस्तुत कर रहे हैं. Microfluidic सिद्धांतों और एक micromechanical प्रणाली cryoWriter में संयुक्त कर रहे है यह संभव बनाने के लिए ।
हमारे अनुभव से पता चलता है कि जब लघुकृत तरीकों इस पांडुलिपि में प्रस्तुत किया जाता है, EM-ग्रिड तैयारी के लिए पैरामीटर अंतरिक्ष शास्त्रीय तरीकों की तुलना में बड़ा है, और कडे उपयोगकर्ता नियंत्रण के अंतर्गत । महत्वपूर्ण बात, वृद्धि हुई reproducibility हासिल यह संभव नमूना बफर प्रणाली के साथ पूर्व स्क्रीन, एक आसानी से उपलब्ध परीक्षण प्रोटीन के साथ पूरित, इष्टतम मापदंडों निर्धारित करने से पहले वास्तविक प्रयोग किया जाता है । यह ब्याज का नमूना निरपेक्ष ंयूनतम करने के लिए की खपत रखता है और अत्यधिक की सिफारिश की है । एनएस-और क्रायो-EM ग्रिड तैयारी के लिए महत्वपूर्ण चरण हैं: (i) पंप सिस्टम का भड़काना; उप nanoliter मात्रा वितरण के लिए, प्रणाली तरल (पानी) degassed और बुलबुला मुक्त होना चाहिए । (ii) चमक निर्वहन या प्लाज्मा सफाई कदम का सटीक नियंत्रण; EM ग्रिड की सतह विशेषताओं reproducible परिणामों के लिए महत्वपूर्ण हैं । (iii) नमूना कंडीशनिंग; कंडीशनिंग के लिए आवश्यक समय, जैसे, एन एस के साथ, बफर प्रकार पर निर्भर करता है, नमक सामग्री और एकाग्रता (चित्रा 3), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से microcapillary24के नोजल ज्यामिति पर । (iv) मात्रात्मक em के लिए एनएस-em तैयारी के लिए वाष्पीकरण दर; कॉफी-रिंग प्रभाव एनएस-EM तैयारी का मात्रात्मक विश्लेषण निषेध कर सकते हैं, और डीपी-चरण द्वारा नियंत्रित धीमी वाष्पीकरण दरों द्वारा दबा दिया जाना चाहिए ।
प्रस्तुत ग्रिड तैयारी विधियों के विभिंन पहलुओं को आज़ादी से विशिष्ट नमूनों के लिए बहुमुखी प्रोटोकॉल के विकास की अनुमति संयुक्त किया जा सकता है । ठेठ उदाहरण एक पदार्थ है कि उच्च संकल्प उंहें रोकता है, जैसे, ग्लिसरॉल, क्रायो के लिए ग्रिड तैयार करने से पहले एक कंडीशनिंग कदम से हटाने का होगा; लाइगैंडों के रूप में मध्यस्थ अणुओं का परिचय, ग्रिड तैयार कर रहे हैं पहले कंडीशनिंग द्वारा; या एनएस-या क्रायो-EM (चित्रा 6) द्वारा एकल कोशिका lysate की परीक्षा ।
प्रस्तुत विधियों में microfluidics और न्यूनतम नमूना मात्राओं का उपयोग कागज़-सोख्ता चरणों की आवश्यकता को पूरी तरह से निकाल देता है. यह एक महान लाभ है, क्योंकि कागज सोख्ता प्रोटीन के लिए एक कठोर उपचार है, संभावित अवांछित आयनों के साथ नमूना दूषित और स्वाभाविक बड़े पैमाने पर नमूना नुकसान के लिए अग्रणी. दूसरी ओर, संभावित प्रभाव क्रायो-EM नमूने शास्त्रीय तरीके से तैयार किए जाते हैं जब cryoWriter का उपयोग किया जाता है जब का गठन पतली नमूना फिल्म का हवा-पानी इंटरफेस की वजह से. क्रायो-EM के लिए उपयुक्त ग्रिड नमूना अनुप्रयोग और vitrification (दिखाया नहीं गया डेटा) के बीच एक से कम ०.२ s प्रतीक्षा समय के साथ तैयार किया जा सकता है । हालांकि, के रूप में प्रोटीन प्रसार द्वारा कुछ नैनोसेकंड में एक नैनोमीटर के कुछ दसवें यात्रा, वहां अभी भी पर्याप्त समय के लिए उंहें एक १०० एनएम मोटी नमूना फिल्म के हवा पानी अंतरफलक के साथ टकराने के लिए कई बार है । हालांकि, हवा पानी अंतरफलक से चिपके प्रोटीन की राशि काफी इन कम समय अंतराल से कम हो सकता है और प्रोटीन विकार या प्रतिबंधित कण उंमुखीकरण को रोकने सकता है । एक और आशाजनक दृष्टिकोण है कि हवा से संवेदनशील प्रोटीन की रक्षा कर सकते है पानी अंतरफलक को कम आणविक भार सतह सक्रिय पदार्थों द्वारा नमूना फिल्म को कवर है । इन यौगिकों तेजी से ग्रिड तैयारी से पहले cryoWriter में एक कंडीशनिंग कदम से शुरू किया जा सकता है । microfluidic प्रणालियों के उच्च सतह से मात्रा अनुपात cryoWriter की एक और सीमा है, के रूप में नमूना संभावित microcapillary सतह के लिए विशिष्ट सोखना द्वारा खो दिया जा सकता है और कण गिनती द्वारा मात्रात्मक विश्लेषण परेशान । समस्या दो तरीकों से संबोधित किया है: पहले, नमूना microcapillary के भीतर लंबी दूरी की यात्रा नहीं करता है । दरअसल, nanoliter नमूना मात्रा प्रसंस्करण भर में केशिका टिप पर रहता है । दूसरा, मात्रा अनुपात करने के लिए सतह और अपेक्षाकृत बड़े भीतरी व्यास के साथ microcapillaries का उपयोग करके कम है, जैसे, १८० µm. तीसरा, microcapillaries की सतहों आसानी से passivated जा सकता है यदि आवश्यक हो, जैसे, उन्हें इलाज के द्वारा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध polylysine इथेनॉल glycols (पीएलएल-खूंटी) के साथ ।
एकल कण दृष्टिकोण द्वारा प्रोटीन के उच्च संकल्प विश्लेषण EM में इस्तेमाल केवल व्यक्तिगत प्रोटीन कणों के कुछ लाख छवियों के लिए १००,००० की आवश्यकता है । इसका मतलब यह है कि microfluidic तकनीक संरचनात्मक जांच के लिए पर्याप्त प्रोटीन परिसरों प्रदान कर सकते हैं । एक लघुकृत इंयूनो प्रोटीन परिसरों के तेजी से अलगाव (लगभग 1 घंटे) के लिए न्यूनतम सेल मात्रा (करीब ४०,००० कोशिकाओं) से पूर्व में विकसित किया गया था पहले28। इस विधि अब सीधे cryoWriter के लघुकृत नमूना तैयारी चरण से जोड़ा जाएगा । अंतिम लक्ष्य के लिए एक एकीकृत microfluidic पाइपलाइन विकसित करने के लिए अल्ट्रा फास्ट प्रोटीन अलगाव और क्रायो-EM ग्रिड की तैयारी है कि सभी में दो घंटे से भी कम की आवश्यकता है । इसके अलावा, के रूप में 6 चित्रा, मिनट राशि और नमूना तैयारी और लगभग दोषरहित कंडीशनिंग और ग्रिड तैयारी प्रक्रिया के लिए आवश्यक सामग्री की मात्रा के द्वारा प्रदर्शन किया cryoWriter का उपयोग कर हासिल की, यह प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए संभव बनाने व्यक्तिगत कोशिकाओं के परिसरों । साथ में, लघुकृत इंयूनो-वर्षा विधि और cryoWriter एक नई प्रोटियोमिक् विधि की नींव रखना “एकल सेल दृश्य प्रोटियोमिक्” कहा जाता है, के रूप में हम हाल ही में गर्मी सदमे प्रयोगों24के लिए प्रदर्शन किया । डेटा विश्लेषण “दृश्य प्रोटियोमिक्” छवियों के विश्लेषण के लिए तैयार एल्गोरिदम वर्तमान में परीक्षण किया जा रहा है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक उनके समर्थन के लिए विश्वविद्यालय बेसल के Biozentrum की कार्यशाला का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, महत्वपूर्ण चर्चा के लिए एस. ए. म्यूलर और ध्यान से पांडुलिपि पढ़ने के लिए, ए Fecteau-EM, रिकार्डो Adaixo, फ्रैंक के साथ तकनीकी सहायता के लिए डेमियन झिल्ली प्रोटीन परीक्षण नमूनों के लिए लेहमेन (सभी सी से CINA, Biozentrum, बेसल विश्वविद्यालय) और ए. Engel, एमेरिटस विश्वविद्यालय बेसल अपने प्रेरणादायक बातचीत के लिए । परीक्षण के नमूनों को पी Ringler, एम.-ए द्वारा प्रदान किया गया था । माही, और Schwede (Biozentrum, बेसल विश्वविद्यालय), पी Leiman (संरचनात्मक जीव विज्ञान और जैव भौतिकी, EPFL की प्रयोगशाला) और आर Diaz-Avalos (ंयूयॉर्क संरचनात्मक जीवविज्ञान केंद्र, संयुक्त राज्य अमरीका) । इस परियोजना को स्विस Nanoscience इंस्टीट्यूट (SNI, प्रोजेक्ट P1401, ARGOVIA प्रोजेक्ट MiPIS) और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (SNF, प्रोजेक्ट 200021_162521) ने समर्थन दिया था ।
Liquid handling | |||
Microcapillary tip | New Objective | FS360-100-30-N-20 | SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20 |
FS360-150-30-N-20 | SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20 | ||
Conductive sleeve | New Objective | CONGAS-1 | Conductive Elastomer for HV contact, 12" long |
Fused silica tubing | BGB-Analytik | TSP-150375 | TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter |
PressFit Connector | BGB-Analytik | 2525LD | Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25 |
Syringe 10 µl | BGB-Analytik | HA-80001 | Hamilton 1701 LT – Luer Tip (needle not included) |
Syringe pump controller | Cetoni | A3921000093 | neMESYS controller |
Syringe pump dosing unit | Cetoni | A3921000095 | neMESYS dosing unit |
Temperature control | |||
Dew point sensor | Meltec | UFT75-AT | Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL |
Temperature sensor | Sensorshop24.ch | LS7-PT1000-1.0-3L | Surface mountable temperature sensor Pt1000 |
Peltier controller | Cooltronic | TC2812 | PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output |
Peltier element | Distrelec.ch | PE-127-14-15-S | 40×40 mm |
Water-cooling block | – | – | Water cooling block for 40×40 mm peltier element, copper base |
Water pump | Digitec.ch | 294877 | XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4 |
Water heat exchanger block | – | – | Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water |
Small water coolers | PCHC.ch | 223050 | Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs |
Small peltier elements | Distrelec.ch | PE-031-10-15-S | Laird 15×15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs |
Mechanics | |||
Linear stage z-axis | Dyneos AG | M-404.2PD | High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor |
Stage controller | Dyneos AG | C-863 | Mercury Servo Controller |
Microscope xy-axis stage | Prior Scientific | H117EIL5 | Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope |
Small permanent magnets | Supermagnete | S-05-08-N | Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10 |
Small electromagnet | Schramme | EG1025A02/110 | Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W |
Controller electromagnet | Conrad.ch | MST-1630.001 7 | Electromagnet control PCB board |
Solenoid hub | Distrelec.ch | HD8286-R-F-24V100% | Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W |
Mini tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0302-M5S-PS | Dumont Type 5 mini, super thin tips |
Various optomechanical parts | Thorlabs | – | – |
Various mechanical parts | Workshop Biozentrum, University Basel | – | Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files |
Optics | |||
Laser diode | Thorlabs | CPS780S | 780 nm laser diode module 2.5 mW |
Photo detector | Thorlabs | PDA100A-EC | Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2 |
EM grids | |||
DURASIN FILM TEM | emsdiasum.com | DTF-03523 | 30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5 |
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1 | Quantifoil Micro Tools GmbH | ||
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools GmbH | ||
Buffers / Neg. stain | |||
PBS | Sigma | D8537 SIGMA | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline |
NanoVan 2% | nanoprobes.com | Negative stain vanadium based | |
NanoW 2% | nanoprobes.com | Negative stain tungsten based | |
Software | |||
openBEB | The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable | ||
CryoWriter control software (openBEB plugin) | Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply. |