Summary
Här visar vi processen att skapa en cellulär elektrisk spänning reporter zebrafiskar linje för att visualisera embryonal utveckling, rörelse, och fisk tumör celler i vivo.
Abstract
Bioelectricity, endogena elektrisk signalering medieras av jonkanaler och pumpar ligger på cellmembranet, spelar viktiga roller i signalering processer av retbara neuronala och muskulös celler och många andra biologiska processer, såsom embryonala utvecklingsmässiga mallning. Dock finns det ett behov för i vivo elektrisk aktivitetsövervakning i ryggradsdjur embryogenes. Förskott av genetiskt kodade fluorescerande spänning indikatorer (GEVIs) har gjort det möjligt att tillhandahålla en lösning för denna utmaning. Här beskriver vi hur du skapar en transgena spänning indikator zebrafiskar använder den etablerade spänningsindikator, ASAP1 (Accelerated Sensor av handlingspänningar 1), som ett exempel. Tol2 kit och en allestädes närvarande zebrafiskar promotor, valdes ubi, i denna studie. Vi förklarar också processerna av Gateway platsspecifika kloning, Tol2 transposon-baserade zebrafiskar genmodifiering och avbildningsprocessen för tidigt skede fisk embryon och fisk tumörer med regelbundna epifluorescerande Mikroskop. Med denna fisk linje upptäckte vi att det finns cellulära elektrisk spänning förändringar under zebrafiskar embryogenes och fisk larval rörelse. Dessutom observerades det att tumören celler var allmänt polariserade i några zebrafiskar malign perifer nerv slida tumörer, jämfört de omgivande normala vävnaderna.
Introduction
Bioelectricity refererar till endogena elektrisk signalering medieras av jonkanaler och pumpar ligger på cellmembranet1. Joniska utbyte över den cellulära membranen, och de kopplade elektriska potentiella och nuvarande förändringarna, är väsentliga för signalering processer av retbara neuronala och muskulös celler. Bioelectricity och ion lutningar har dessutom en mängd andra viktiga biologiska funktioner inklusive energilagring, biosyntes och metaboliten transport. Bioelektriska signalering upptäcktes också som en regulator av embryonala mönster bildas, såsom kroppen yxor, cellcykeln och cell differentiering1. Det är således viktigt för att förstå många medfödda sjukdomar som följd av felaktig reglering av denna typ av signalering. Även om patch clamp har använts för att registrera enstaka celler, är det fortfarande långt ifrån idealisk för samtidig övervakning av flera celler under fosterutvecklingen i vivo. Dessutom är spänning känsliga små molekyler också inte idealisk för i vivo applikationer på grund av deras särdrag, känslighet och toxicitet.
Skapandet av en mängd genetiskt kodade fluorescerande spänning indikatorer (GEVIs) erbjuder en ny mekanism för att lösa detta problem, och möjliggör enkel applicering att studera embryonal utveckling, även om de ursprungligen var avsedda för övervakning av neurala celler2,3. En av de för närvarande tillgängliga GEVIs är accelererade Sensor av handlingspänningar 1 (ASAP1)4. Den består av en extracellulär loop av en spänningsavkännande domän spänning känsliga fosfatas och ett cirkulärt den omkastade grönt fluorescerande protein. Därför ASAP1 möjliggör visualisering av elektriska potentiella cellförändringar (polarisering: ljust grön; depolarisation: mörkgrön). ASAP1 har 2 ms on-och off kinetik och kan spåra subthreshold potentiella ändra4. Detta genetiska verktyg möjliggör således en ny nivå av effektivitet i realtidsövervakning av bioelektrisk i levande celler. Vidare förståelse av bioelectricity i embryonal utveckling och många sjukdomar, såsom cancer, roller kommer att kasta nytt ljus på de bakomliggande mekanismerna, som är avgörande för behandling och förebyggande.
Zebrafisk har visat en kraftfull djurmodell att studera utvecklingsbiologi och mänskliga sjukdomar inklusive cancer5,6. De delar 70% orthologous gener med människor, och de har liknande ryggradsdjur biologi7. Zebrafiskar ger relativt lättskött, en stor koppling storlek på ägg, fogligt genetik, lätt genmodifiering och transparent yttre embryonal utveckling, vilket gör dem ett överlägset system för in-vivo imaging5,6. Med stor strålningskälla mutant fisk redan finns och en fullt sekvenserat genomet ger zebrafiskar ett relativt obegränsat utbud av vetenskapliga upptäckter.
För att undersöka den i vivo realtid elektriska aktiviteten i cellerna, dra vi nytta av zebrafisk modellen systemet och ASAP1. I detta papper, vi beskriver hur att införliva den fluorescerande spänning biosensor ASAP1 i zebrafiskar genomet med Tol2 transposon genmodifiering, och visualisera cellulär elektriska aktivitet under fosterutvecklingen, fisk larval rörelse, och i levande tumör .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafiskar är inrymt i en AAALAC-godkända djuranläggningen, och alla experiment utfördes enligt de protokoll som godkänts av Purdue djur vård och användning kommittén (PACUC).
1. Tol2 Transposon Plasmid konstruktion förberedelse
Obs: Tol2, en transposon som upptäcktes i medaka fisk, har allmänt använts i zebrafiskar forskning gemenskapen8,9. Det har varit framgångsrikt antogs till Gateway platsspecifika rekombination-baserade kloning systemet och kallas de Tol2 kit10. Tol2 kit möjliggör ett mer praktiskt sätt att skapa anpassade uttryck konstruktioner, samtidigt ökar effektiviteten av genmodifiering. Således var det ett lätt beslut att dra nytta av detta system och skapa en allestädes närvarande ASAP1 uttryck zebrafiskar linje med en validerad ubiquitin arrangören för att köra ASAP111.
- Skapa en mellersta inträde ASAP1 konstruktion: pDONR221-ASAP1
- Förvärva den genetiskt kodade spänning sensor ASAP1 bygga, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (Plasmid #52519), från Addgene. För att förstärka regionen ASAP1 kodning, ställa in en PCR använder anpassade primers (attB1-ASAP1F och attB2-ASAP1R) flankerad med attB sekvenser i 5' slutet av primers (figur 1). Phusion DNA-polymeras valdes för sin höga effektivitet och PCR villkor var optimerad utifrån de tidigare publicerade protokoll12.
- Läsa in de 50 µL PCR-produkterna i en 1% TAE gel med en vanlig pipett med 200 µL tips och utför elektrofores på 160 V i en horisontell gel tank i ca 30 min.
- Kontrollera gelen under en UV-transilluminator (353 nm), punktskatter ut önskat band med en kniv/skalpell under en UV-transilluminator som tidigare publicerade13,14och sätta det DNA som innehålla gel provet i en ren 1,5 mL mikrocentrifug röret.
- Utföra gel rening för ASAP1 PCR-produkter. Återvinna DNA i exciderad gel med en kommersiell DNA gel rening kit efter tillverkarens anvisningar och eluera DNA in 20 µL av vatten. Ta 1 µL som ett prov, och mäta den DNA-koncentration med en spektrofotometer. Flöde programvara instruktionerna använda vatten som ett blankprov15.
- Ta 100 ng av renat PCR-produkten och blanda det med 150 ng av pDONR221 plasmid i TE 10 µL buffert (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0)16. Tillsätt 2 µL av BP Clonase II i reaktionen och inkubera reaktionen i rumstemperatur över natten.
- Den andra dagen, tillsätt 1 µL av proteinas K i reaktionen och inkubera reaktionen vid 37 ° C i 30 min.
- Utföra omvandlingen. Överföra reaktionen och blanda det med 50 µL av Top10 behöriga E. coli celler och inkubera cellerna på is i 30 min. Då överföring reaktionsröret till 42 ° C vattenbad för 1 min. omedelbart ta bort röret och inkubera på is i 2 min. Därefter satte röret i en 37 ° C shaker och inkubera det i 1 h.
- Ta tuben ut och plattan cellerna på kanamycin LB plåt. Nästa, inkubera plattan över natten (16-18 h) vid 37 ° C.
- Välj enstaka och väl separerade kolonier och Inokulera dem in 14 mL cell kultur rören med 3 mL LB medium. Kultur dem över natten vid 37 ° C i en shaker med en rotationshastighet på 250 rpm (rotation per minut).
- Utföra miniprep med en kommersiell miniprep kit efter dess instruktion manuell17.
- Sekvens 3-4 plasmider med Sanger kloner sekvensering att identifiera positiva pDONR221-ASAP1 med M13F och M13R sekvensering primers.
- Skapa den Tol2 konstruktionen för Mikroskop: pDestTol2 -ubi-ASAP1
- Välj sekvenseringen verifierade pDONR221-ASAP1 klon och mäta dess DNA-koncentration med en spektrofotometer efter instruktionen programvara med vatten som en tom styra15.
- Ta 100 µg av pDONR221-ASAP1 och blanda det med 100 µg av Tol2 kit 5-end plasmid (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg p3E-polyA (Tol2 kit #302) och 150 µg av pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Justera totala volymen till 8 µL använder TE buffert (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) i en 1,5 mL mikrocentrifug rör och blanda väl genom en 2-5 s kort virvel. Sedan Tillsätt 2 µL av LR Clonase II plus och inkubera reaktionen i rumstemperatur över natten.
- På den andra dagen, tillsätt 1 µL av proteinas K i reaktionen med 10 µL pipett och inkubera reaktionen vid 37 ° C i 30 min.
- Utföra omvandlingen och identifiera positiva kloner som beskrivs ovan (steg 1.1.7-11).
- Mäter DNA koncentrationen av sekvensering verifierade pDestTol2-ubi-ASAP1 klon (figur 1B) med en spektrofotometer15. Koncentrationen är oftast runt 200ng/µL.
2. Förbered Tol2 Transposase mRNA och injektionslösningen
- Strimma E. coli glycerol lager av pCS2FA-transposase plasmid (Tol2 kit #396) på en LB-tallrik (med 100 µg/mL ampicillin) med en steriliserad inympning loop. Inkubera plattan vid 37 ° C i en inkubator över natten. Nästa dag, plocka en enda koloni och Inokulera den i 3 mL LB (100 µg/mL ampicillin) med en steriliserad 10 µL pipettspetsen. Kultur det över natten vid 37 ° C i en shaker med en rotationshastighet på 250 rpm.
- Utföra miniprep på E. coli kulturen med en kommersiell miniprep kit efter dess bruksanvisning. Eluera plasmid DNA in 30-50 µL av TE buffert av 1 minuts Centrifugera vid 14.000 rpm och mäta dess DNA-koncentration med en spektrofotometer.
- Linjär 1-2 µg av plasmid med jag inte Amiiiiin och rena DNA med en DNA rengöringssats efter dess bruksanvisning efter jag inte matsmältningen. Eluera DNA in 5 µL av vatten genom centrifugering vid 14.000 rpm i 1 minut. Den förvänta koncentrationen är om 200-300 ng/µL.
- Utföra i vitro transkription med inte linearized jag pCS2FA-transposase som en DNA mall med en kommersiell SP6 transcription kit.
- När reaktionen är klar, rena Tol2 transposase mRNA använder en kommersiell RNA rengöring kit följa tillverkarens instruktioner. Slutligen eluera mRNA in 20 µL RNAase-gratis vatten och mäta den RNA-koncentrationen i en spektrofotometer. Den förvänta koncentrationen är om 1-3 µg / µL. prover kan lagras i-80 ° C frys om det behövs.
- Förbered den Mikroskop lösningen genom att blanda 20 ng/µL pDestTol2 -ubi-ASAP1 och Tol2 transposase mRNA (100 ng/µL) i en mikrocentrifug rör genom pipettering. Att förebygga nukleinsyra nedbrytning, orsakad av upprepad upptining och omfrysning, alikvotens 6 µL per rör och förvaras det i-80 ° C frys för framtida bruk.
3. Mikroskop
- Ställa in 4-6 avel tankar med minst 2 hanar och 2 honor på eftermiddagen innan injektion. Dessa fiskar måste inte matas på eftermiddagen. Detta steg kommer att minska mängden fiskavfall och spara tid att rensa dem ut nästa morgon, samtidigt som den hjälper att inducera en avel svar.
- Följande morgon, ta bort beredda injektionslösningen (pDestTol2 -ubi-ASAP1 konstruera och Tol2 mRNA) från-80 ° C frysen, och placera den på isen.
- Dra avdelare i fisk avel tankar och låta fisken att para. I allmänhet lägger fisk ägg inom 20-30 minuter efter att dra ut avdelare. Om inte, vänta 1-2 timmar längre. Vissa fiskar kan inte lägga ägg alls. I detta fall upprepa detta experiment för fisk embryosamlingsgruppen.
- Medan du väntar, kontrollera att det finns nålar beredd med spetsen bruten i vinkel skapar en avfasad kant med pincett, eller genom att bryta på en delikat uppgift torkare.
- Dra nålar från kapillär glas på en mikropipett avdragare med följande parametrar: Värm 545; Dra 60; hastighet 80; tid 250; Tryck 500. Bryta nålen med pincett under en dissektion omfattning (med ögat-bit linjal för diameter uppskattning) genom att hålla tången i en vinkel ca 45 °. Önskad nål diametrar kan vara variabel beroende på inställningarna för microinjector, men mindre diameter är att föredra för att minska embryo dödlighet.
- När fisken har lagt ägg, samla dem i en 10-cm diameter petriskål och föra dem till dissektion tillämpningsområdet. Ta bort alla onormala embryon och fisk avfall.
- Pipettera befruktade embryon till beredda 3% agaros injektion mögel. Ta bort överflödigt vatten för att hålla embryon på plats.
- När alla rader är fyllda med livskraftiga embryon, ordna dem så att de enstaka cellerna som alla står inför samma riktning mot nålen, som är ca 45° vinkel horisontellt. Detta kommer att göra injektionen mycket lättare senare.
- Med handskar, använda en 20 µL lastning Pipettera spets och ta bort 5 µL av den beredda bygga från röret på is.
- Sätt försiktigt spetsen i den baksida änden av det trasiga kapillärröret hela vägen till där det börjar tapper, att få reagenset så nära spetsen. Om det finns fortfarande luftbubblor, skaka nålen, se till att inte bryta spetsen.
- För in nålen rakt in i Mikroskop nålförare och dra åt tills nålen sitter på plats. Justera vinkeln till ca 45°.
- När nålen är beredd och ansluten, slå på mikroskopet och gas trycktanken. Kommersiella CO2 tankar är allmänt bra för detta ändamål. Injektionsvolymen justeras genom innehav och utmatning trycket: approximera 0.5 psi för innehav och 30 psi för utmatning. Var noga med att kontrollera att lösningen kommer ut när du trycker på pedalen.
- Med en objektmikrometern med en droppe av mineralolja, justera volymen och flödet av lösningen på ~ 150 µm i diameter (ca 2 nL). Säkerställa att mottrycket kommer att låta en liten mängd rinna ut nålen. Om det inte finns tillräckligt mottryck, orsaka kapillärkraften vätska att komma in nålen och förstöra mRNA.
- När nålen är kalibrerad, börja injicera konstruktionen i den enda cellen i befruktade embryon.
Anmärkning: Detta tar en stor mängd praxis, tålamod och finess, på grund av cellmembranet är svåra att genomborra. Det är viktigt att injicera lösningen i cellen, inte äggulan, för att generera transgena zebrafiskar. Detta skiljer sig från morpholino injektion. Det spelar ingen roll vilken sida nålen går cellen så länge konstruktionen går i cellen. Genmodifiering har en mycket låg grad av framgång om injiceras i äggulan istället för cellen. Singel-cellstadie injektion är också viktigt, eller somatiska chimera fisk kommer att skapas. Detta minskar risken för de transgenens gå in till könsceller. - Använda kanten av gel skåran för att ge ett underlag som håller embryot på plats och låter nålen till applicera tryck utan att flytta embryot. När spetsen på nålen är i en enda cell, trampa på pedalen för att släppa den önskade mängden lösning. Upprepa denna process för alla embryon.
- När klar, överför de injicerade embryona till en märkt maträtt genom att skölja dem ur agaros skåran med fisk systemet vatten och disponibel 3,4 mL överföring pipett. Lagra embryon i en 28,5 ° C inkubator att låta dem utveckla. Kontrollera tillbaka hela dagen att ta bort döda fiskar embryon och Byt vatten med 0,1% metylenblått i fiskevatten.
- Runt 6-8 timmar efter injektion, ta 10 individ injiceras fisk embryon och förbereda genomiskt DNA från dem med Hotshot metod18.
- Följande morgon, använda en dissektion Mikroskop med fluorescens ljuskälla för att sortera ut de embryon som visar god Jordbrukarsed i icke-äggula vävnader. Dessa fiskar embryon bör innehålla den injicerade konstruktion.
- Utföra Tol2 punktskatter analys för att kontrollera aktiviteten transposon som tidigare beskrivits19. Om exciderad Plasmiden kan upptäckas, hålla den injicerade fisk embryon och höja dem. Om ingen exciderad Plasmiden kan upptäckas, upprepa Tol2 mRNA syntes och Mikroskop processen fram till att uppnå de positiva resultaten av Tol2 punktskatter analysen.
4. upprätta transgena ASAP1 fisk, Tg (ubi: ASAP1)
- Höja den injicerade fisken (F0 generationen) till vuxenlivet som tidigare beskrivits i zebrafiskar bok20. Detta tar vanligtvis cirka 4 månader.
- Ta en enda vuxen F0 fisk och korsa den med ett enda motsatt kön vildtyp fisk. Samla in fisk embryon efter avel senare under dagen. Hålla de insamlade fisk embryona i 28.5 ° C inkubatorn i fisk vatten med 0,1% metylenblått.
- På tredje dagen, kontrollera fisk embryon under fluorescerande dissektion Mikroskop med GFP filter. Sortera ut grön fisk embryon, om det finns några, och höja dem till vuxen ålder som F1 generationen transgen fisk, Tg (ubi: ASAP1).
Obs: Mendelian baserat förväntas inte eftersom de flesta föräldrars F0 fiskar är könsceller genetiska chimärer. - Korsa enda F1 vuxen fisk med vildtyp fisk och samla fisk embryon. Sortera ut grön fisk embryon och höja dem till vuxenlivet som F2 generation fisk.
Obs: Green och icke-gröna fisk embryon bör vara nära 1:1 om det finns en enda transgenens. - Visa elektriska potentiella förändringar i tumören som malign perifer nerv slida tumörer (MPNST), korsa den F2 generationen Tg (ubi: ASAP1) fisk med rpl35hi258/wt fisk. Det är känt att synliga tumörer börjar hittas i 6-8 månader gammal vuxna21,22.
5. imaging
- Bild zebrafiskar embryon, ta flera F2 generationen grundare fisk och passera dem med vildtyp fisk enskilda parvis. Samla in fisk embryon i olika önskad utvecklingsstadier enligt den zebrafiskar som mellanstationer guide23.
- För de tidiga stadierna av fisk embryon, skala och ta bort chorions av de embryon som omsorgsfullt med ett par pincett under en dissektion scope i en 10-cm diameter petriskål med fisk systemet vatten.
- Överföra några fisk embryon till en Hull glasskiva med 3% metylcellulosa med 3,4 mL disponibla överföring pipett. Justera embryona till önskade positioner att visa aktiviteten för cellulära GFP som med hjälp av en nål under ett fluorescerande dissektion scope.
- För de rörliga stadierna av fisk embryon (äldre än 12 somite skede), använda 0,05% tricaine mesylate för att söva fisken embryon innan du överför dem till bilder. Kort, fisk embryon var dök upp i 0,05% tricaine mesylate i fiskevatten tills de slutat simning och förlust kroppens balans. Också, Lägg en droppe av 0,05% tricaine mesylate med metylcellulosa på bilden.
- För mindre än 12 somite skede fisk embryon, använda ett påljusfluorescens förening Mikroskop med en kompatibel kamera och programvara för bildhantering. För äldre än 12 somite skede fisk embryon, använda fluorescens dissektion Mikroskop.
- Till bild tumör cellspänning, först identifiera fisken med MPNST tumörer. Sedan, söva fisken med 0,05% tricaine mesylat. För hela berget imaging, Lägg fisken i en 10-cm diameter petriskål. Om du vill visa tumör cell elektriska aktivitet, kan fisk tumörer vara dissekerade ut efter hela mount imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en framgångsrik injektion, mer än 50% injiceras fisken embryon visas en viss grön fluorescens i somatiska celler, och de flesta av dem kommer att vara positivt med Tol2 transposon punktskatter assay (figur 2). Efter 2-4 generationer av korsa ut med vildtyp fisk (tills fluorescerande fisken når 50%, förväntad Mendelian förhållandet), användes den transgena fisken för imaging experimentet för att spåra cellmembranet potentialer under fosterutvecklingen. Först undersöktes membran potentiella förändringar i hela cellcykeln under zebrafiskar tidiga embryonala utvecklingsstadier. Det observerades att cellerna hyperpolarized innan klyvning fåra bildandet (figur 3A-3Coch kompletterande Video 1). Dessutom visade olika vävnader en mängd membran potentialer i 1-3 dagars gammal fisk embryon. (Figur 3D-3G). Exempelvis är de thoraxsegmenten och ryggsträng allmänt hyperpolarized, jämfört med de intilliggande vävnader/organ. När zebrafiskar embryon skulle kunna flytta, var vi också kunna upptäcka neuromuskulär elektrisk verksamhet (figur 4, kompletterande Video 2). Bioelectric egenskaper av cancerceller kunde ändras, vi drog fördel av detta ASAP1 reporter fisk och korsade det med en rpL35 gen mutant, som är utsatta för spontana malign perifer nerv slida tumörer21,24 ,25. Även om endast ett fåtal fisk tumörer undersöktes, på grund av långa potentiella tillväxtperioden för fisk tumör mutant, märktes det att det fanns spänning skillnader mellan tumörer och omgivande vävnader i levande tumör-bärande zebrafiskar (figur 5). Således visat dessa representativa resultat framgångsrika generering av en cellulär elektriska reporter fisk linje, och dess potential för att utvecklings- och cellulära biologi.
Figur 1: Illustration av Tol2 transposon-baserade plasmid byggandet.
(A) BP rekombination användes för ASAP1 sub kloning i pDONR221 mellersta posten vektorn. attB sekvenser har lagts till i 5-slutet av primers för ASAP1. (B) diagrammet för Tol2 transposon-baserade konstruera montering baserat på LR rekombination. Lila ovala formen visar Tol2 inverterad upprepas. De streckade visar linjerna homolog rekombination. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Typiska resultat av injicerade embryon av epifluorescence och Tol2-punktskatter assay.
(A) icke-positiva 1dpf fisk embryo. (B) injiceras framgångsrikt 1dpf fisk embryo. GFP ställen är påtaglig i stammen. (C) icke-positiva 2dpf fisk embryo. (D) injiceras framgångsrikt 2dpf fisk embryo. GFP ställen är påtaglig i stammen. (E) ett representativt resultat av Tol2 punktskatter assay. Lane 1-7 PCR var amplifierats från 7 slumpmässigt utvald fisk embryon 8 timmar efter injektion. Den sista är en negativ kontroll (NC) utan någon genomiskt DNA. Skalstapeln = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dynamisk spännings förändringar under zebrafiskar embryots utveckling.
(A-C) Differentiell cellulära spänningen polaritet under Mitos i fisk embryon. (A) 2-cellstadie zebrafiskar embryo. (B) 4-cellstadie embryo. (C) 8-cellstadie embryo. De röda pilen huvuden visar positionerna för de klyvning fåror i panelerna (A-C). Förändringarna märks också i motsvarande filmen (kompletterande Video 1). Regionen runt den klyvning fåran är mer polariserat jämfört med resten av cellen. (D-G) Dynamiska elektrisk spänning förändringar i tidiga stadier av zebrafisk embryon. (D) 12-somite scenen. (E) 22-somite scenen. (F) 48 timmar efter befruktning. (G) 72 timmar efter befruktning. e, ögat; ht, hjärta; NT, ryggsträng; op, optic vesikler; ov, öron vesikler; pf, bröstmuskeln fin; så, somite; yk, äggula. Skalstapeln = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Elektrisk spänning förändringar av fisk kroppen under fisk embryo rörelse.
2 - dag-gammal fisk embryon Visa den neuro-muskulära elektriska aktiviteter under rörelse. (A) - (F) sekventiella avbildning av samma fisk embryot. Färgändringar densitet är motsvarar den elektrisk signalering transduktion. Intervalltiden mellan två på varandra följande bilder är ca 12,4 millisekunder. De röda pilarna visar positioner att spänning förändrats under perioden imaging. Förändringarna märks också i motsvarande filmen (kompletterande Video 2). Alla paneler är i samma skala. Skalstapeln = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Tumörceller tenderar att vara mer polariserad.
En 10 - månader gammal fisk (rpL35hi258/wt; TG (ubi: ASAP1) utvecklat en malign perifer nerv slida tumör i buken. (A) & (C) Bright fältet bild. (B) & (D) bild med GFP kanal. (A) & (B) intakt fisk. (C) & (D) buken tumör var dissekerade ut. Tumörceller är mer polariserad (ljusare grön) jämfört med omgivande vävnader (Mörkgrön). Pilen huvuden Visa tumörer. Alla paneler är i samma skala. Skalstapeln = 25 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande Video 1 . Epifluorescerande avbildning av elektrisk signalering under klyvning stadier i Tg (ubi: ASAP1) fisk embryo. Denna film spelades in från beskåda av djur pole. ASAP1 fluorescensen är associerad med bildandet av cell klyvning fåran, en tillfällig struktur under celldelningen. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Video 2 . Epifluorescerande avbildning av elektrisk signalering under 2 - dag-gammal Tg (ubi: ASAP1) fiska embryo rörelse. Flytten spelades från den laterala vy 2 - dag-gammal fisk embryot efter anesthetization. The ASAP1 fluorescens förändringar märks i neuromuskulära vävnad under rörliga processen. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om mobilnät och vävnaden nivå elektriska verksamhet under embryonal utveckling och mänsklig sjukdom upptäcktes för länge sedan, fortfarande i vivo dynamiska elektriska förändringarna och deras biologiska roller till stor del okända. En av de stora utmaningarna är att visualisera och kvantifiera de elektriska förändringarna. Patch clamp teknik är en break-through för att spåra enskilda celler, men dess tillämpning på ryggradsdjur embryon är begränsad eftersom de består av många celler. De nuvarande kemiska spänning färgämnena är inte heller idealisk på grund av sin känslighet, särdrag och toxicitet. De senaste tidens ansträngningarna på uppfinningen av GEVIs ger oss en ny sökväg för att visualisera cellulära elektriska aktiviteter i vivo och i realtid. Här visade vi processen att skapa en zebrafiskar elektriska reporter linje, Tg (ubi:ASAP1).
Använda denna reporter fisk linje, visar vi cellulära elektriska aktiviteter som kan övervakas i zebrafiskar embryon. Elektrisk spänning förändringen är starkt relaterad till cellcykeln under tidig embryonal utveckling. Vi har observerat att hyperpolarisering händer före bildandet av klyvning fåra/celldelning (figur 3). Detta är i motsats till den nuvarande kunskapen att depolarisation sker innan celldelningen26. Således mer detaljer av cellmembranet spänningen ändras under cellcykeln av andra djurs och människors celler, och om detta är relaterat till vävnad sammanhang kräver ytterligare studier. Relaterade studier pågår för närvarande i vårt laboratorium. Dessutom har vi kontrollerat att ASAP1 är kunna spåra fysiologiska spänningsändringar i neurala-muskulära systemet (figur 4), där förändring är relativt snabb jämfört med ändringarna under cell cykler.
Det visades också att denna reporter också kan användas för att visualisera zebrafiskar tumörer (figur 5). Det var intressant att hitta tumören celler var generellt mer polariserat jämfört med omgivande normala vävnader. Men om detta är ett allmänt fenomen för alla maligna vävnader kräver ytterligare utredning, på grund av begränsningen av tumörprover och fisk tumörtyper i denna studie. Framtida undersökningar på cellmembranet polarisering och spänning kvantifiering på andra typer av tumörer och mänskliga cancerceller kommer vara informativ för att bättre förstå dess roller under tumourigenesis.
I detta protokoll valde vi en allestädes närvarande arrangören att köra ASAP1 uttryck att spåra alla celler i fisk embryon. Vävnad eller organ specifika initiativtagare kan vara ett annat alternativ om bara en viss cell/vävnad typ är att föredra. ASAP1 spänning sensorn är en relativt väl karakteriserade biosensor, och den består av en spänning känsliga domän av sjöpung spänningskänsliga fosfatas (S3-S4 loop) och en cirkulär permutation av god Jordbrukarsed (standard är låg fluorescens). Det rapporterades att uttryckas på utanför cellulära membranet i mänskliga neuron celler och mus hjärnan skivor4,27,28. Ljusstyrkan på sensorn bestäms dominant konfirmerande positionerna för S3-S4 öglan och god Jordbrukarsed. Snabba grön fluorescens förändringen var osannolikt orsakas av proteinkoncentration, på grund av hastigheten ljusstyrka ändringar och proteinsyntes. Transgenens, ASAP1, kan dock ha ändrat uttryck i tumörceller, pågrund av genomisk instabilitet. Förutom ASAP1, kan andra GEVIs, såsom archaerhodopsin-baserade spänning indikatorer (QuasAr1 och QuasAr2), också vara ett bra komplement alternativ, eftersom de använder en helt annan mekanism och de också har en hög känslighet och hastighet 29. Dessutom är deras utsläpp i intervallet röd färg. Detta gör dem särskilt avgiftsfritt till den gröna ASAP1, om det finns redan ett annat fluorescerande protein i samma cell. Till exempel kan ASAP1 och QuasAr kombineras med Fucci zebrafiskar30 för att studera förhållandet mellan cellcykeln och elektriska potentiella förändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Det forskningsarbete som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences av det nationella Institutes of Health under Award nummer R35GM124913, Purdue University PI4D incitamentsprogram och PVM inre konkurrenskraftiga Grundläggande forskning medel Program. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis finansiering agenterna officiella åsikter. Vi tackar Koichi Kawakami för den Tol2 konstruktionen, Michael Lin för den ASAP1 konstruktionen, och Leonard Zon för ubi arrangören konstruera genom Addgene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
