Summary
Hier zeigen wir den Prozess der Erstellung einer zellulären elektrische Spannung Reporter Zebrafisch Linie um embryonale Entwicklung, Bewegung, zu visualisieren und Fisch Tumorzellen in Vivo.
Abstract
Bioelektrizität, endogene elektrische Signalisierung von Ionenkanälen vermittelt und Pumpen befindet sich auf der Zellmembran, spielt eine wichtige Rolle bei der Signalisierung Prozesse des erregbare muskulären und neuronalen Zellen und viele andere biologische Prozesse, wie z. B. embryonale Developmental Musterung. Allerdings gibt es eine Notwendigkeit für die in Vivo Überwachung elektrische Aktivität in vertebrate Embryogenese. Die Fortschritte der genetisch codierten fluoreszierende Spannung Indikatoren (GEVIs) machten es möglich, eine Lösung für diese Herausforderung zu bieten. Wir beschreiben hier, wie erstelle ich eine transgene Spannung Indikator Zebrafisch mit den etablierten Spannungsanzeige ASAP1 (beschleunigte Sensor von Aktionspotentialen 1), als Beispiel. Das Tol2-Kit und einem allgegenwärtigen Zebrafisch-Promotor, Ubi, wurden in dieser Studie ausgewählt. Wir erklären auch die Prozesse der Gateway ortsspezifische Klonen, Tol2 Transposon-basierte Zebrafisch Transgenese und den imaging-Prozess für Frühphasen-Fisch Embryonen und Fisch Tumoren mit regelmäßigen Epifluorescent Mikroskope. Mit diesem Fisch-Linie, fanden wir, dass während der Embryogenese Zebrafisch und Fische Larven Bewegung gibt es zelluläre elektrische Spannungsänderungen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass in ein paar Zebrafisch malignen peripheren Nerven Scheide Tumoren, Tumor, die Zellen in der Regel polarisiert waren im Vergleich zu das umliegende normale Gewebe.
Introduction
Bioelektrizität bezieht sich auf endogene elektrische Signalisierung durch Ionenkanäle und Pumpen befindet sich auf der Zellmembran1vermittelt. Ionischen Austausch über die Zellmembran und die gekoppelten elektrischen potenziellen und aktuellen Änderungen sind unerlässlich für die Signalisierung Prozesse des erregbare muskulären und neuronalen Zellen. Bioelektrizität und Ion Steigungen haben darüber hinaus eine Vielzahl von anderen wichtigen biologischen Funktionen wie Energiespeicher, Biosynthese und Metabolit Transport. Bioelektrische Signale wurde auch als Regulator des embryonalen Musterbildung wie körperachsen, Zellzyklus und Zelle Differenzierung1entdeckt. Daher ist es wichtig für das Verständnis der vielen menschlichen Erbkrankheiten, die sich aus der MIS Verordnung dieser Art der Signalisierung. Obwohl Patch-Clamp ist weit verbreitet für die Aufnahme einzelner Zellen, ist es immer noch bei weitem nicht Ideal für die gleichzeitige Überwachung mehrerer Zellen während der Embryonalentwicklung in Vivo. Darüber hinaus sind sensible kleine Moleküle Spannung auch nicht ideal für in-Vivo Anwendungen aufgrund ihrer Besonderheiten, Empfindlichkeiten und Toxizitäten.
Die Schaffung einer Vielzahl von genetisch codiert fluoreszierende Spannung Indikatoren (GEVIs) bietet einen neuen Mechanismus, um dieses Problem zu umgehen, und ermöglicht die einfache Anwendung, Embryonalentwicklung, zu studieren, obwohl sie ursprünglich, für die Überwachung der neuronalen bestimmt waren 2,3Zellen. Eines der derzeit verfügbaren GEVIs ist die beschleunigte Sensor Aktionspotentiale 1 (ASAP1)4. Es besteht aus einer extrazellulären Schleife einer Spannung-sensing Domäne Spannung empfindlich Phosphatase und ein Zirkular permutierte grün fluoreszierendes Protein. Daher erlaubt ASAP1 Visualisierung der elektrische mögliche Zellveränderungen (Polarisation: hellgrün; Depolarisation: dunkelgrün). ASAP1 hat 2 ms ein- und Kinetik und Eingangssignale mögliche Änderung4verfolgen können. So ermöglicht dieses genetische Tool für ein neues Maß an Effizienz in bioelektrische Echtzeitüberwachung in lebenden Zellen. Weitere Verständnis der Rollen der Bioelektrizität in der embryonalen Entwicklung und vielen menschlichen Krankheiten wie Krebs, wird werfen ein neues Licht auf die zugrunde liegenden Mechanismen, die für Behandlung und Prävention von entscheidender Bedeutung ist.
Zebrafisch nachweislich eine leistungsstarke Tiermodell, Entwicklungsbiologie und menschliche Krankheiten einschließlich Krebs5,6zu studieren. Sie 70 % ortholog Gene mit Menschen teilen, und sie haben ähnliche vertebrate Biologie7. Zebrafisch bieten relativ pflegeleicht, eine große Kupplung Größe von Eiern, gefügig Genetik, leicht Transgenese und transparente externe embryonale Entwicklung, wodurch sie ein überlegenes System für in-Vivo imaging5,6. Eine bedeutende Quelle von mutant Fisch Linien bereits vorhanden und ein vollständig sequenzierte Genom wird Zebrafisch relativ unbegrenzt vielfältige wissenschaftliche Entdeckungen bieten.
Um die in Vivo in Echtzeit elektrische Aktivität von Zellen zu untersuchen, nutzen wir die Zebrafisch Modellsystem und ASAP1. In diesem Papier wir beschreiben, wie das Zebrafish Genom Tol2 Transposon Transgenese mit fluoreszierenden Spannung Biosensor ASAP1 einzubauen, und elektrische Zellaktivität zu visualisieren, während der Embryonalentwicklung, Fische Larven Bewegung, und im live tumor .
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Protocol
Der Zebrabärbling in eine AAALAC genehmigt Tierstation untergebracht sind, und alle Versuche erfolgten nach den Protokollen von Purdue Animal Care und Nutzung Committee (PACUC) genehmigt.
1. Tol2 Transposon Plasmid Konstrukt Vorbereitung
Hinweis: Tol2, ein Transposon, das Medaka Fisch entdeckt wurde hat in der Zebrafisch Forschung Gemeinschaft8,9verbreitet wurde. Es wurde erfolgreich an das Gateway ortsspezifische Rekombination basierende Klonen System angenommen und als Tol2 Kit10bekannt. Das Tol2-Kit ermöglicht eine sehr komfortable Möglichkeit individuelle Ausdruck Konstrukte, während auch die Effizienz der Transgenese zu schaffen. So war es eine leichte Entscheidung, nutzen die Vorteile dieses Systems, und eine allgegenwärtige ASAP1 Ausdruck Zebrafisch Linie mit einem validierten Ubiquitin Promotor ASAP111fahren.
- Erstellen einer mittleren Eintrag ASAP1 Konstrukt: pDONR221-ASAP1
- Das genetisch codierte Spannung Sensor ASAP1 Konstrukt, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (Plasmid #52519), von Addgene zu erwerben. Um die ASAP1 kodierenden Region zu verstärken, richten Sie eine PCR unter Verwendung der benutzerdefinierten Zündkapseln (attB1-ASAP1F und attB2-ASAP1R) flankiert mit AttB Sequenzen am 5'-Ende der Primer (Abbildung 1). Phusion-DNA-Polymerase wählte für seine hohe Effizienz und PCR-Zustände wurden basierend auf den zuvor veröffentlichten Protokoll12optimiert.
- Laden Sie die 50 µL-PCR-Produkte in eine 1 % TAE gel mit einer regelmäßigen Pipette mit 200 µL Spitzen und führen Sie Elektrophorese bei 160 V in einem horizontalen Gel Tank für ca. 30 min.
- Überprüfen Sie das Gel unter einem UV-Transilluminator (353 nm), Verbrauchsteuern, das gewünschte Band mit einem Messer/Skalpell unter einem UV-Transilluminator als bisher erschienen13,14, und setzen die DNA mit Gel-Probe in eine saubere 1,5 mL Microcentrifuge Rohr.
- Durchführen Sie Gel-Reinigung für die ASAP1 PCR-Produkte. Erholen Sie die DNA in den ausgeschnittenen Gel mit einem kommerziellen DNA-Gel Reinigung Kit nach Anweisungen des Herstellers zu, und eluieren Sie die DNA in 20 µL Wasser. 1 µL als Beispiel zu nehmen, und die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer messen. Fließen Sie die Anweisungen der Software, die mit Wasser als ein leeres Steuerelement15.
- Nehmen Sie 100 ng des PCR-Produktes gereinigt und mischen Sie es mit 150 ng pDONR221 Plasmid in 10 µL TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. Fügen Sie 2 µL BP Clonase II in die Reaktion und inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht.
- Am zweiten Tag fügen Sie 1 µL Proteinase K in die Reaktion und inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 30 min.
- Führen Sie die Transformation. Übertragen Sie die Reaktion und mischen Sie es mit 50 µL der Top10 kompetente E. Coli Zellen und inkubieren Sie die Zellen für 30 min auf Eis. Dann Transfer das Reaktionsgefäß in ein Wasserbad 42 ° C für 1 min. sofort entfernen Sie den Schlauch und inkubieren Sie für 2 min auf Eis. Als nächstes legen Sie den Schlauch in einen Shaker 37 ° C und 1 h inkubieren.
- Das Rohr herausnehmen und die Zellen auf eine Kanamycin LB-Platte-Platte. Als nächstes inkubieren Sie die Platte über Nacht (16-18 h) bei 37 ° c
- Wählen Sie einzelne und gut getrennte Kolonien und in 14 mL Zelle Kultur Röhren mit 3 mL LB-Medium zu impfen. Kultur sie über Nacht bei 37 ° C in einem Shaker mit einer Drehzahl von 250 u/min (Umdrehung pro Minute).
- Führen Sie Miniprep mit einem kommerziellen Miniprep Kit nach seiner Anweisung manuelle17.
- Sequenz 3-4-Plasmide mit Sanger-Sequenzierung positiven pDONR221-ASAP1 identifizieren Klone mit M13F und M13R-Sequenzierung-Primern.
- Erstellen der Tol2 Konstrukt für die Mikroinjektion: pDestTol2 -Ubi-ASAP1
- Wählen Sie die Sequenzierung pDONR221 ASAP1 Klon und Maßnahme überprüft seine DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer folgenden der Software Anweisung mit Wasser, wie eine leere Steuern15.
- Nehmen Sie 100 µg pDONR221-ASAP1 und mischen Sie es mit 100 µg Tol2 Kit 5-End Plasmids (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg p3E-PolyA (Tol2 Kit #302) und 150 µg des pDestTol2pA2 (Tol2 Kit #394). Insgesamt Lautstärke zu 8 µL TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) in einer 1,5 mL Microcentrifuge Rohr und mischen Sie gut durch einen 2-5 s kurze Wirbel. Dann fügen Sie 2 µL des LR Clonase II plus und inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht.
- Am zweiten Tag 1 µL Proteinase K in die Reaktion mit einer 10 µL Pipette einfügen und die Reaktion bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
- Führen Sie Transformation und identifizieren Sie positive Klone zu, wie oben (Schritte 1.1.7-11) beschrieben.
- Maßnahme die DNA-Konzentration der Sequenzierung überprüft pDestTol2 Ubi ASAP1 Klon (Abbildung 1 b) mit einem Spektrophotometer15. In der Regel ist die Konzentration um 200ng/µL.
2. bereiten Sie Tol2 Transposase mRNA und Injektionslösung
- Streak E. Coli Glycerin Bestand an pCS2FA-Transposase Plasmid (Tol2 Kit #396) auf eine LB-Platte (mit 100 µg/mL Ampicillin) mit einer sterilisierten Impfschlinge. Über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einem Inkubator. Am nächsten Tag, wählen Sie eine einzelne Kolonie und impfen Sie es in 3 mL LB (100 µg/mL Ampicillin) mit einer sterilisierten 10 µL PIPETTENSPITZE zu. Kultur es über Nacht bei 37 ° C in einem Shaker mit einer Drehzahl von 250 u/min.
- Führen Sie Miniprep auf die E. Coli -Kultur mit einem kommerziellen Miniprep Kit die Beachtung der Bedienungsanleitung. Eluieren Sie Plasmid-DNA in 30-50 µL TE-Puffer von 1 Minute Zentrifuge bei 14.000 u/min und Messen Sie seine DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
- Linearisieren 1-2 µg Plasmids mit nicht ich Endonuklease und Reinigen der DNA mit einer Reinigungs-Kit nicht ich die Bedienungsanleitung nach DNA Verdauung. Eluieren Sie die DNA in 5 µL Wasser durch Zentrifugieren bei 14.000 u/min für 1 Minute. Die erwartete Konzentration beträgt über 200-300 ng/µL.
- Führen Sie in Vitro Transkription mit nicht linearisiert ich pCS2FA-Transposase als DNA-Vorlage mit einem kommerziellen SP6 Transcription Kit.
- Wenn die Reaktion beendet ist, reinigen Sie Tol2 Transposase mRNA mit Hilfe einer Gebäudereinigung RNA kit nach den Anweisungen des Herstellers. Zu guter Letzt eluieren Sie mRNA in 20 µL RNAase-freies Wasser und Messen Sie die RNA-Konzentration in einem Spektralphotometer. Die erwartete Konzentration geht es um 1-3 µg / µL. Proben können in einem-80 ° C Gefrierschrank gelagert werden, wenn nötig.
- Bereiten Sie die Mikroinjektion Lösung durch Mischen von 20 ng/µL pDestTol2 -Ubi-ASAP1 und Tol2 Transposase mRNA (100 ng/µL) in einem Microcentrifuge Schlauch durch pipettieren. Zur Verhinderung von Nukleinsäure-Beeinträchtigung durch wiederholtes Auftauen und Auftauens, aliquoten 6 µL pro Röhre und in einem-80 ° C Gefrierschrank für eine spätere Verwendung zu speichern.
3. die Mikroinjektion
- Richten Sie 4-6 Zucht Becken mit mindestens 2 Rüden und 2 Hündinnen am Nachmittag vor der Injektion. Diese Fische müssen nicht am Nachmittag gefüttert werden. Dieser Schritt wird reduzieren die Menge der Fischabfälle und sparen Sie Zeit, um sie am nächsten Morgen, während gleichzeitig eine Zucht Reaktion veranlassen zu reinigen.
- Am nächsten Morgen, entfernen Sie die vorbereiteten Injektionslösung (pDestTol2 -Ubi-ASAP1 Konstrukt und Tol2 mRNA) aus der Tiefkühltruhe-80 ° C und auf Eis legen.
- Ziehen Sie den Teiler in der Fischzucht Panzer und lassen Sie den Fisch zu Paaren. Im Allgemeinen legen Fische Eiern innerhalb von 20-30 Minuten nach dem Herausziehen des Teilers. Wenn nicht, warten Sie 1-2 Stunden länger. Einige Fische können überhaupt keine Eiablage. In diesem Fall wiederholen Sie dieses Experiment für Embryo Fischsammlung.
- Während der Wartezeit stellen Sie sicher, dass Nadeln mit der Spitze in einem Winkel eine abgeschrägte Kante zu schaffen, mit der Pinzette oder durch brechen auf eine heikle Aufgabe Scheibenwischer gebrochen vorbereitet.
- Ziehen Sie Nadeln aus Kapillaren Glas auf einer Mikropipette Abzieher mit den folgenden Parametern: Erhitzen 545; 60 zu ziehen; Geschwindigkeit 80; Zeit 250; Druck 500. Die Nadel mit der Pinzette unter einer Dissektion Umfang (mit Okular Lineal für Durchmesser Schätzung) zu brechen, hält die Zange in einem Winkel von ca. 45 °. Gewünschte Nadel Durchmesser können variabel je nach den Microinjector-Einstellungen sein, aber kleinere Durchmesser wird bevorzugt für die Verringerung des Embryos Sterblichkeit.
- Sobald der Fisch Eiablage haben, sammeln sie in einem Durchmesser von 10 cm Petrischale und bringen sie auf den Bereich der Dissektion. Entfernen Sie alle abnorme Embryonen und Fischen Sie Abfall zu.
- Pipettieren Schimmel die befruchteten Embryonen in die vorbereitete 3 % Agarose-Injektion. Entfernen Sie überschüssiges Wasser um die Embryonen im Ort zu halten.
- Sobald alle Zeilen mit Embryonen gefüllt sind, ordnen Sie sie so, dass die einzelnen Zellen, die alle die gleiche Richtung der Nadel Gesicht die etwa einen Winkel von 45° horizontal. Dies wird Injektion später viel leichter machen.
- Mit Handschuhen, verwenden Sie eine 20 µL laden pipettieren kippen und 5 µL des vorbereiteten Konstrukts aus der Tube auf dem Eis zu entfernen.
- Legen Sie die Spitze in das hintere Ende des gebrochenen kapillarröhrchens bis hin zu, Tapper beginnt, das Reagenz möglichst nahe an die Spitze zu erhalten. Wenn es noch Luftblasen immer, schütteln Sie die Nadel, und achten Sie auf die Spitze nicht zu brechen.
- Stechen Sie die Nadel direkt in die Mikroinjektion Nadelhalter und ziehen Sie sorgfältig an, bis die Nadel an seinem Platz bleibt. Stellen Sie den Winkel auf ca. 45°.
- Sobald die Nadel vorbereitet und angeschlossen ist, schalten Sie das Mikroskop und Gas-Druck-Tank. Kommerzielle CO2 Tanks sind im Allgemeinen gut für diesen Zweck. Die Einspritzmenge wird durch die Holding und Auswurf Druck eingestellt: ca. 0,5 Psi gewartet und 30 Psi für Auswurf. Achten Sie darauf, zu prüfen, ob die Lösung kommt heraus, wenn das Pedal zu drücken.
- Passen Sie mithilfe einer Bühne Mikrometer mit einem Tropfen Mineralöl, das Volumen und die Lösung für ~ 150 µm im Durchmesser (ca. 2 nL). Stellen Sie sicher, dass der Gegendruck wird eine kleine Menge der Nadel heraus Tropfen lassen. Wenn nicht genug Gegendruck vorhanden ist, bewirkt Kapillarwirkung Flüssigkeit, geben die Nadel und die mRNA zerstören.
- Sobald die Nadel kalibriert wird, beginnen Sie Injektion das Konstrukt in die einzelne Zelle der befruchteten Embryonen.
Hinweis: Dies dauert viel Übung, Geduld und Finesse durch die Zellmembran, die schwer zu durchdringen. Es ist wichtig, die Lösung in der Zelle, nicht das Eigelb zur Erzeugung transgener Zebrafisch zu injizieren. Dies unterscheidet sich von Morpholino-Injektion. Es spielt keine Rolle, welche Seite die Nadel betritt die Zelle so lange, wie das Konstrukt in der Zelle geht. Die Transgenese haben eine sehr niedrige Rate des Erfolges, wenn das Eigelb statt der Zelle injiziert. Einzel-Zell-Stadium Injektion ist auch wichtig, oder somatischen Chimäre Fisch erstellt werden. Dies verringert die Chance des Transgens werde in den Keimzellen. - Benutzen Sie den Rand der Gel-Kerbe, einen Rückhalt bieten, der hält den Embryo vorhanden und ermöglicht die Nadel, Druck auszuüben, ohne sich zu bewegen den Embryo. Sobald die Spitze der Nadel in die einzelne Zelle ist, drücken Sie das Pedal, um die gewünschte Menge an Lösung zu veröffentlichen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle der Embryonen.
- Wenn abgeschlossen, übertragen Sie die injizierten Embryonen in eine beschriftete Schale durch Spülen sie aus Agarose Kerbe mit System Fischwasser und ein Einweg-3,4 mL transferpipette. Speichern Sie die Embryonen in einem 28,5 ° C Inkubator zu entwickeln lassen. Überprüfen Sie zurück im Laufe des Tages entfernen Tote Fischembryonen und ersetzen Sie Wasser mit 0,1 % Methylenblau in Fischwasser zu.
- Ca. 6-8 Stunden nach der Injektion nehmen 10 einzelnen injiziert Embryonen zu Fischen und bereiten genomischen DNA daraus mit Hilfe der Hotshot Methode18.
- Verwenden Sie am nächsten Morgen Dissektion Mikroskop mit einer Fluoreszenz-Lichtquelle um zu sortieren, die Embryonen mit GFP in den Geweben nicht Eigelb. Diese Fischembryonen sollte das eingespritzte Konstrukt enthalten.
- Führen Sie Tol2 Verbrauchsteuern Assay Transposon-Aktivität wie bisher19beschrieben überprüfen. Wenn ausgeschnittenen Plasmid erkannt werden kann, halten die injizierten Embryonen zu Fischen und heben Sie sie. Wenn keine ausgeschnittenen Plasmid erkannt werden kann, wiederholen Sie den Tol2 mRNA-Synthese und Mikroinjektion bis die positiven Resultate des Tol2 Verbrauchsteuern Assays.
4. Stellen Sie transgene ASAP1 Fisch, Tg (Ubi: ASAP1)
- Heben Sie die injizierten Fische (F-0 -Generation) bis zum Erwachsenenalter, bereits in der Zebrafisch-Buch-20beschrieben. Dies dauert in der Regel ca. 4 Monate.
- Nehmen Sie eine einzelne Erwachsene F0 Fisch und überqueren sie mit einem einzigen gegenüber Geschlecht Wildtyp Fisch. Sammle Fischembryonen nach Zucht im Laufe des Tages. Halten Sie die gesammelten Fischembryonen im 28,5 ° C Inkubator in Fisch mit 0,1 % Methylenblau Wasser.
- Am dritten Tag überprüfen Sie Fischembryonen unter einem Mikroskop fluoreszierende Dissektion mit einem GLP-Filter. Grüne Fischembryonen zu klären, wenn es welche gibt, und heben Sie sie bis zum Erwachsenenalter als F1 Generation transgene Fische, Tg (Ubi: ASAP1).
Hinweis: Mendelian Verhältnis wird nicht erwartet, da die meisten der elterlichen F0 Fische Keimbahn genetischer Chimären sind. - Überqueren Sie einzelne F1 geschlechtsreifer Fische mit Wildtyp-Fisch und sammle Fischembryonen. Sortieren Sie grüne Fischembryonen und heben Sie sie zum Erwachsensein als F2 Generation Fisch.
Hinweis: Grün und nicht-grüne Fischembryonen sollte in der Nähe von 1:1, wenn gibt es einen einzigen Transgen. - Um elektrische mögliche Veränderungen im Tumor wie malignen peripheren Nerven Scheide Tumoren (MPNST) anzuzeigen, überqueren Sie die F-2 -Generation Tg (Ubi: ASAP1) Fisch mit rpl35hi258/wt Fisch. Es ist bekannt, dass die sichtbare Tumoren beginnen in 6-8 Monate alte Erwachsene21,22zu finden.
(5) Bildgebung
- Bild von Zebrafisch-Embryonen, nehmen mehrere F2 Generation Gründer Fisch und mit Wildtyp-Fisch in einzelnen Paaren zu überqueren. Sammle Fischembryonen in unterschiedlichen gewünschte Entwicklungsstadien nach dem Zebrafisch Inszenierung Reiseführer23.
- Für die frühen Stadien von Fischembryonen schälen und Chorions der Embryonen mit einer Zange vorsichtig eine Dissektion Rahmen in einem Durchmesser von 10 cm Petrischale mit Fischwasser System zu entfernen.
- Ein paar Fischembryonen in eine konkave Glas-Folie mit 3 % Methylcellulose mit einer Pipette 3,4 mL Einweg-Transfer zu übertragen. Passen Sie die Embryonen an die gewünschten Positionen, die Zellaktivität der GFP mit einer Nadel unter einem fluoreszierenden Dissektion Bereich anzuzeigen.
- Verwenden Sie für den beweglichen Phasen Fischembryonen (älter als 12 Somiten Bühne) 0,05 % Tricaine Mesylate, um den Fischembryonen zu betäuben, bevor Sie sie auf Folien übertragen. Kurz, waren Fischembryonen in 0,05 % Tricaine Mesylate in Fischwasser entstanden, bis sie schwimmen und Verlust Körperbalance gestoppt. Auch, Tropfen Sie einen 0,05 % Tricaine-Mesylat mit der Methylcellulose auf der Folie.
- Verwenden Sie für weniger als 12 Somiten Bühne Fischembryonen ein Epi-Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit einem kompatiblen Kamera und Software für die Bildgebung. Verwenden Sie für älter als 12 Somiten Bühne Fischembryonen ein Fluoreszenzmikroskop Dissektion.
- Zu Bild Tumor Zellspannung, zuerst die Fische mit MPNST Tumoren zu identifizieren. Dann den Fisch mit 0,05 % Tricaine Mesylate zu betäuben. Für ganze Mount legen Bildgebung, Sie den Fisch in einem Durchmesser von 10 cm Petrischale. Um den Tumor Zelle elektrische Aktivität anzuzeigen, können Fische Tumoren, nach dem ganzen Berg Imaging seziert.
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Representative Results
In einer erfolgreichen Injektion, mehr als 50 % injiziert Fischembryonen zeigt ein gewisses Maß an grünen Fluoreszenz in den somatischen Zellen, und die meisten von ihnen werden positiv von Tol2 Transposon Verbrauchsteuern Assay (Abbildung 2). Nach 2-4 Generationen von Out-Kreuz mit Wildtyp-Fisch (bis der fluoreszierenden Fisch 50 %, die erwarteten Mendelian Verhältnis erreichen), wurden die transgene Fische für das imaging Experiment zur Zellmembran Potentiale während der embryonalen Entwicklung zu verfolgen. Zunächst wurden Membran mögliche Veränderungen in der gesamten Zellzyklus während der frühen embryonalen Entwicklungsstadien Zebrafisch untersucht. Es wurde beobachtet, dass die Zellen vor der Spaltung Furche Bildung (Abbildung 3A-3Cund ergänzende Video 1) hyperpolarisierten. Darüber hinaus zeigten verschiedene Gewebe eine Vielzahl von Membran-Potenziale in 1-3 Tage alten Fischembryonen. (Abbildung 3D-3G). Beispielsweise sind die Somiten und Chorda im allgemeinen hyperpolarisierten im Vergleich zu den angrenzenden Gewebe/Organe. Sobald die Zebrafish Embryos bewegen konnten, konnten wir auch die neuromuskulären elektrische Aktivitäten (Abbildung 4, ergänzende Video 2) zu erkennen. Bioelektrische Eigenschaften von Krebszellen verändert werden könnte, wir nutzten dieses ASAP1 Reporter Fisch sowie mit einer rpL35 gen Mutante, die anfällig für spontane malignen peripheren Nerven Scheide Tumoren21,24 ist gekreuzt ,25. Obwohl nur wenige Fische Tumoren, aufgrund der längst möglichen Wachstumsphase für die Fisch-Tumor-Mutante untersucht wurden war es fällt auf, dass es Spannungsdifferenzen zwischen Tumoren und das umliegende Gewebe in live Tumor-tragenden Zebrafisch (Abbildung 5 gab). So demonstriert diese repräsentative Ergebnisse die erfolgreiche Generierung einer zellulären elektrischer Reporter Fisch Linie und seine mögliche Anwendung auf Entwicklungs- und Zellbiologie.
Abbildung 1: Darstellung der Tol2 Transposon-basierte Plasmid Konstruktion.
(A) BP Rekombination diente ASAP1 vor-Klonen in den pDONR221 mittleren Eintrag Vektor. AttB Sequenzen wurden 5-Ende der Primer für ASAP1 hinzugefügt. (B) Diagramm für Tol2 Transposon-basierte konstruieren Montage basierend auf LR Rekombination. Lila ovaler Form zeigt, dass Tol2 inverted wiederholt. Die gestrichelten Linien zeigen die homologe Rekombination. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Typische Ergebnisse von injizierten Embryonen durch Epifluoreszenz und Tol2-Verbrauchsteuern-Assay.
(A) kraftschlüssige 1dpf Fisch-Embryo. (B) erfolgreich injiziert 1dpf Fisch-Embryo. GFP-Spots sind offensichtlich in den Kofferraum. (C) kraftschlüssige 2dpf Fisch-Embryo. (D) erfolgreich injiziert 2dpf Fisch-Embryo. GFP-Spots sind offensichtlich in den Kofferraum. (E) ein repräsentatives Ergebnis Tol2 Verbrauchsteuern Assay. Lane 1-7 PCR wurden verstärkt von 7 nach dem Zufallsprinzip ausgewählte Fischembryonen 8 Stunden nach der Injektion. Der letzte ist eine Negativkontrolle (NC) ohne irgendwelche genomischer DNA. Maßstabsleiste = 250 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Dynamische Spannungsänderungen während der Entwicklung des Zebrafish Embryos.
(A-C) Differenzielle zellulären Spannung Polarität während der Mitose in den Fischembryonen. (A) 2-Zellstadium Zebrafish Embryos. (B) 4-Zell-Stadium Embryos. (C) 8-Zell-Stadium Embryos. Der rote Pfeil Köpfe zeigen die Positionen der Spaltung Furchen in die Seitenteile (A-C). Die Änderungen sind in den entsprechenden Film (ergänzende Video 1). Die Region um die Spaltung Furche ist mehr polarisiert gegenüber den Rest der Zelle. (D-G) Dynamische elektrische Spannungsänderungen in den verschiedenen frühen Stadien von Zebrafisch-Embryonen. (D) 12-Somiten Bühne. (E) 22-Somiten Bühne. (F) 48 Stunden post Düngung. (G) 72 Stunden post Düngung. e, Auge; ht, Herz; NT, Chorda; Op, Optik Vesikel; Ov, Ohrenoperationen Vesikel; Pf, Brustflosse; also, Somiten; Yk, Eigelb. Maßstabsleiste = 250 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Elektrische Spannung Veränderungen des Körpers während der Fisch Embryo Bewegung Fisch.
2 - Tage alten Fisch Embryonen zeigen die Neuro-muskuläre elektrische Aktivitäten während der Bewegung. (A) - (F) sequentielle Bildgebung von den gleichen Fisch-Embryo. Dichte Farbänderungen sind elektrische Signal Transduction entsprechend. Das Intervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Bildern beträgt ca. 12,4 Millisekunden. Die roten Pfeile zeigen die Positionen, dass Spannung in der bildgebenden Zeit geändert. Die Änderungen sind in den entsprechenden Film (ergänzende Video 2). Alle Panels sind in der gleichen Größenordnung. Maßstabsleiste = 250 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Tumorzellen neigen dazu, mehr polarisiert werden.
Einen 10 Monate alten Fisch (rpL35hi258/wt; TG (Ubi: ASAP1) entwickelt einen malignen peripheren Nerv Hülle Tumor im Unterleib. (A) & (C) Bright Feldbild. (B) und (D) Bild mit GFP-Kanal. (A) und (B) intakt Fisch. (C) & (D) Bauch Tumor wurde sie seziert. Tumorzellen sind mehr polarisiert (helleres grün) im Vergleich zum umgebenden Gewebe (dunkelgrün). Pfeilspitzen zeigen die Tumoren. Alle Panels sind in der gleichen Größenordnung. Maßstabsleiste = 25 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Zusätzliche Video 1 . Epifluorescent Darstellung der elektrischen Signalisierung während Spaltung Phasen Tg (Ubi: ASAP1) Fisch-Embryo. Dieser Film aus der Sicht des Tieres Pole aufgezeichnet wurde. Die ASAP1 Fluoreszenz ist verbunden mit der Gründung der Zelle Spaltung Furche, eine temporäre Struktur während der Zellteilung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Zusätzliche Video 2 . Epifluorescent Darstellung der elektrischen Signalisierung während 2 - Tage alten Tg (Ubi: ASAP1) Fischen Embryo Bewegung. Der Umzug wurde von der Seitenansicht des 2 - Tage alten Fisch Embryos nach Anesthetization aufgenommen. The ASAP1 Fluoreszenz Änderungen sind offensichtlich in neuromuskulären Gewebe während der bewegten Prozess. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Obwohl die Mobilfunk- und Gewebe elektrische Aktivitäten während der embryonalen Entwicklung und Krankheit beim Menschen vor langer Zeit entdeckt wurden, bleiben die in Vivo dynamische elektrische Veränderungen und deren biologische Rollen noch weitgehend unbekannt. Eine der großen Herausforderungen ist zu visualisieren und zu quantifizieren, die elektrischen Veränderungen. Patch-Clamp-Technologie ist ein Durchbruch für die Verfolgung von Einzelzellen, aber seine Anwendung auf vertebrate Embryonen ist begrenzt, da sie aus vielen Zellen zusammengesetzt sind. Die aktuelle chemische Spannung Farbstoffe eignen sich auch nicht durch ihre Befindlichkeiten, Besonderheiten und Toxizitäten. Die jüngsten Bemühungen auf die Erfindung des GEVIs geben Sie uns einen neuen Weg um elektrische ZELLAKTIVITÄTEN in Vivo zu visualisieren und in Echtzeit. Hier zeigten wir den Prozess der Schaffung einer Zebrafisch elektrischer Reporter Reihe, Tg (Ubi:ASAP1).
Anhand dieser Reporter Fisch Linie zeigen wir in den Zebrafish Embryos elektrische ZELLAKTIVITÄTEN, die überwacht werden können. Die elektrische Spannungsänderung bezieht sich sehr auf den Zellzyklus während der frühen Embryonalentwicklung. Wir haben festgestellt, dass diese Hyperpolarisation passiert, vor der Gründung der Spaltung Furche/Zellteilung (Abbildung 3). Dies steht im Gegensatz zu den aktuellen Erkenntnissen dieser Depolarisation geschieht vor der Zellteilung26. So, mehr Details der Zellmembran Spannung ändert sich während des Zellzyklus von anderen tierischen und menschlichen Zellen, und ob dies mit Gewebe Kontext zusammenhängt erfordern weitere Studien. Studien werden derzeit in unserem Labor. Darüber hinaus haben wir überprüft, dass ASAP1 in der Lage ist, physiologische Spannungsänderungen der neural-Muskulatur (Abbildung 4), verfolgen die Veränderung in dem relativ schnell im Vergleich zu den Änderungen in Zelle Zyklen ist.
Es wurde auch gezeigt, dass dieser Reporter auch verwendet werden kann, um Zebrafisch Tumoren (Abbildung 5) zu visualisieren. Es war interessant zu erfahren, Tumor, die Zellen in der Regel mehr polarisiert waren im Vergleich zu den umliegenden normalen Gewebe. Aber ob dies ein allgemeines Phänomen für alle malignen Gewebe ist bedarf weiterer Untersuchungen, aufgrund der Einschränkung der tumorproben und Fisch Tumorarten in dieser Studie. Zukünftige Untersuchungen zur Zellmembran Polarisation und Spannung Quantifizierung auf andere Arten von Tumoren und menschlichen Krebszellen werden informativ für ein besseres Verständnis ihrer Rolle während der Tumorgenese.
In diesem Protokoll wählten wir allgegenwärtige Förderer ASAP1 Ausdruck für alle Zellen in Fischembryonen verfolgen zu fahren. Gewebe oder Organ spezifische Promotoren könnte eine weitere Option, wenn nur eine bestimmte Art von Zellen/Gewebe bevorzugt wird. Die ASAP1 Spannungssensor ist ein relativ gut charakterisierten Biosensor, und es besteht aus einer Spannung empfindlich Domäne der seescheide Spannung-empfindlichen Phosphatase (S3-S4-Schleife) und eine kreisförmige Permutation der GLP (Standardeinstellung ist niedrig Fluoreszenz). Es wurde berichtet, auf der äußeren Zellmembran in menschlichen Neuron Zellen und Maus Gehirn Scheiben4,27,28ausgedrückt werden. Die Helligkeit des Sensors wird dominant durch Konformationsänderungen Positionen der S3-S4-Schleife und GFP bestimmt. Die schnelle grün fluoreszieren Änderung war unwahrscheinlich Proteinkonzentration, aufgrund der Geschwindigkeit der Helligkeitsänderungen und Protein-Synthese zurückzuführen. Jedoch kann das Transgen, ASAP1, Expression in Tumorzellen, aufgrund der Beschaffenheit des genomische Instabilität verändert haben. Neben ASAP1 möglicherweise andere GEVIs, z. B. Archaerhodopsin-basierte Spannung Indikatoren (QuasAr1 und QuasAr2), auch eine gute ergänzende Option, da sie einen völlig anderen Mechanismus verwenden und sie haben eine hohe Empfindlichkeit und Geschwindigkeit 29. Darüber hinaus ist ihre Emissionen in den roten Farbbereich. Dies macht sie besonders kostenlose für die grünen ASAP1 existiert bereits ein weiteres fluoreszierendes Protein in derselben Zelle. Beispielsweise können ASAP1 und QuasAr mit Fucci Zebrafisch30 für die Untersuchung der Beziehung zwischen Zellzyklus und elektrische mögliche Veränderungen kombiniert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Forschungsarbeit, die in dieser Publikation berichtet wurde durch das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health Award Anzahl R35GM124913, Purdue University PI4D Incentive-Programm und PVM internen Wettbewerb unterstützt. Grundlagenforschung-Fonds-Programm. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der finanziellen Mittel. Wir danken für das Konstrukt Tol2, Michael Lin für das Konstrukt ASAP1 Koichi Kawakami und Leonard Zon für die Ubi -Promoter zu konstruieren, durch Addgene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
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