Summary
在这里, 我们展示了创建一个细胞电压报告斑马鱼线的过程, 以可视化胚胎发育, 运动和鱼类肿瘤细胞在体内。
Abstract
生物电, 由离子通道和细胞膜上的泵介导的内源电信号, 在兴奋性神经细胞和肌肉细胞的信号过程和其他许多生物学过程中起着重要作用, 如胚胎发展模式。但是, 在脊椎动物胚胎发生中需要进行体内电活动监测。基因编码的荧光电压指示器 (GEVIs) 的发展, 使我们有可能为这一挑战提供解决方案。在这里, 我们描述如何创建一个转基因的电压指示器斑马鱼使用已建立的电压指示器, ASAP1 (动作电位加速传感器 1), 作为一个例子。本研究选择了 Tol2 套件和无处不在的斑马鱼启动子ubi 。我们还解释了网关站点特定克隆的过程, Tol2 座子斑马鱼转基因, 以及早期的鱼类胚胎和鱼类肿瘤的成像过程, 使用常规 epifluorescent 显微镜。利用这条鱼线, 我们发现在斑马鱼胚胎发生和鱼类幼虫运动过程中存在着细胞电压的变化。此外, 据观察, 在一些斑马鱼恶性周围神经鞘肿瘤, 肿瘤细胞一般极化相比, 周围正常组织。
Introduction
生物电是指由离子通道和位于细胞膜1上的泵所介导的内源电子信号。细胞膜上的离子交换, 以及耦合电位和电流的变化, 对于兴奋性神经细胞和肌肉细胞的信号过程是必不可少的。此外, 生物电和离子梯度也有多种其他重要的生物学功能, 包括能量储存, 生物合成和代谢物运输。生物电信号也被发现作为胚胎模式形成的调节器, 如体轴, 细胞周期和细胞分化的1。因此, 这是至关重要的了解许多人类先天性疾病的结果, 这类信号的错误监管。虽然膜片钳已被广泛用于记录单个细胞, 但它仍然远未理想的同时监测在胚胎发育过程中的多个细胞在体内。此外, 由于其特异性、敏感性和毒性, 电压敏感小分子对于体内应用也不理想。
创建各种基因编码的荧光电压指示器 (GEVIs) 提供了一个新的机制来克服这一问题, 并允许易于应用研究胚胎发育, 即使他们最初是为了监测神经单元格2,3。当前可用的 GEVIs 之一是动作电位 1 (ASAP1)4的加速传感器。它由电压敏感磷酸酶的电压传感域和循环排列绿色荧光蛋白组成。因此, ASAP1 允许可视化的细胞电位变化 (极化: 明亮的绿色; 退极化: 深绿色)。ASAP1 有2毫秒的动力学, 可以跟踪阈的潜在变化4。因此, 这一遗传工具允许在实时生物监测活细胞的新水平的有效性。进一步了解生物电在胚胎发育和许多人类疾病 (如癌症) 中的作用, 将为疾病治疗和预防的关键机制提供新的基础。
斑马鱼已被证明是一个强大的动物模型, 研究发育生物学和人类疾病, 包括癌症5,6。他们分享70% 同源基因与人, 并且他们有相似的脊椎动物生物7。斑马鱼提供相对容易的护理, 大的离合器大小的鸡蛋, 易于处理的遗传学, 容易转基因, 和透明的外部胚胎发育, 这使他们成为一个优越的系统在体内成像5,6。随着大量的突变鱼线来源已经存在和一个完全有序的基因组, 斑马鱼将提供一个相对无限的科学发现范围。
为了研究细胞的体内实时电活动, 我们利用斑马鱼模型系统和 ASAP1。本文介绍了如何利用 Tol2 座子转基因将荧光电压生物传感器 ASAP1 到斑马鱼基因组中, 并在胚胎发育、鱼类幼虫运动和活肿瘤中可视化细胞电活动.
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Protocol
斑马鱼被安置在一个 AAALAC 批准的动物设施中, 所有的实验都是根据普渡动物保育和使用委员会 (PACUC) 批准的协议进行的。
1. Tol2 座子质粒结构制备
注: Tol2 是在鳉鱼中发现的座子, 广泛应用于斑马鱼研究社区8,9。它已成功地应用于网关站点特定的基于重组的克隆系统, 并被称为 Tol2 套件10。Tol2 套件允许创建自定义表达式构造的更方便的方法, 同时也提高了转基因的效率。因此, 这是一个简单的决定, 利用这个系统, 并创建一个无处不在的 ASAP1 表达斑马鱼线使用经过验证的泛素启动器来驱动 ASAP111。
- 创建中间条目 ASAP1 构造: pDONR221-ASAP1
- 获得基因编码的电压传感器 ASAP1 构造, pcDNA3.1/普洛-ASAP1 (Plasmid#52519), 从 Addgene。要放大 ASAP1 编码区域, 请使用自定义的引物 (attB1-ASAP1F 和 attB2-ASAP1R) 在底漆的 5 ' 末端 (图 1) 两侧 attB 序列建立 PCR。Phusion DNA 聚合酶的高效性, PCR 条件根据先前发布的协议12进行了优化。
- 将50µL PCR 产品装入1% 泰式凝胶中, 使用有200µL 提示的常规吸管, 并在水平凝胶罐中160伏进行电泳, 约30分钟。
- 检查在 uv transilluminator (353 nm) 下的凝胶, 用刀片/手术刀在 uv transilluminator 下使用刮刀/刀, 如先前发布的13,14, 并将含有凝胶样品的 DNA 放入干净的1.5 毫升离心管。
- 对 ASAP1 PCR 产品进行凝胶纯化。使用商业 DNA 凝胶纯化试剂盒, 在制造商的指导下, 恢复分离凝胶中的 dna, 并将 dna 洗脱到20µL 水中。以1µL 为样本, 用分光光度计测量 DNA 浓度。使用水作为空白控件15流软件指令。
- 取100的纯化 PCR 产物, 并将其与 150 pDONR221 质粒在10µL 的 TE 缓冲器 (10 毫米三, 1 毫米 EDTA pH 8.0)16混合。添加2µL 的 BP Clonase II 反应, 并在室温下孵化反应在夜间。
- 第二天, 将蛋白酶 K 的1µL 加入反应中, 并在37摄氏度上孵化出30分钟的反应。
- 执行转换。转移反应, 并与50µL Top10 能力的大肠杆菌细胞混合, 并在冰上孵化细胞30分钟。然后, 将反应管转移到42°c 水浴中1分钟, 立即取出管并在冰上孵化2分钟。接下来, 把管子放入一个37摄氏度的振动筛中, 孵化1小时。
- 取出管子, 将细胞板到卡那霉素 LB 板上。接下来, 在37摄氏度的一夜之间孵化出盘子 (16-18 小时)。
- 选择单一和分离良好的殖民地, 并接种到14毫升细胞培养管与3毫升的 LB 培养基。文化他们隔夜在37°c 在一个振动筛以自转速度 250 rpm (自转每分钟)。
- 在其指令手册17之后, 使用商业 miniprep 工具包执行 miniprep。
- 序列3-4 质粒与 pDONR221-ASAP1 测序, 以识别阳性克隆使用 M13F 和 M13R 序引物。
- 创建用于显微注射的 Tol2 构造: pDestTol2-ubi-ASAP1
- 选择已验证 pDONR221-ASAP1 克隆的测序, 并使用水作为空白控件15的软件指令后, 用分光光度计测量其 DNA 浓度。
- 采取100µg 的 pDONR221-ASAP1 和混合它与100µg Tol2 套件5端质粒 (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), µg p3E-polyA (Tol2 套件 #302) 和150µg pDestTol2pA2 (Tol2 套件 #394)。使用 TE 缓冲器 (10 毫米三, 1 毫米 EDTA, pH 8.0) 在1.5 毫升离心管中调整总容积到8µL, 并由 2-5 s 短涡混合。然后, 添加2µL 的 LR Clonase II 加, 并孵化在室温下的反应过夜。
- 第二天, 用10µL 吸管将蛋白酶 K 的1µL 加入反应中, 并在37摄氏度上孵化出30分钟的反应。
- 执行转换并标识正克隆, 如上文所述 (步骤 1.1. 7-11)。
- 使用分光光度计15测量测序验证的 pDestTol2-ubi-ASAP1 克隆 (图 1B) 的 DNA 浓度。通常集中是大约 200 ng 或µL。
2. 制备 Tol2 Transposase mRNA 和注射液
- 将大肠杆菌甘油 pCS2FA-transposase 质粒 (Tol2 试剂盒 #396) 的股票用灭菌的接种循环放到 LB 板上 (用100µg/毫升氨苄西林)。一夜之间孵化37摄氏度的盘子。第二天, 选择一个单一的殖民地, 并接种它成3毫升磅 (100 µg/毫升氨苄西林) 使用消毒10µL 吸管提示。文化它隔夜在37°c 在一个振动筛以 250 rpm 的自转速度。
- 在大肠杆菌区域性上使用商业 miniprep 工具包在其指导手册之后执行 miniprep。用1分钟离心机在 1.4万 rpm 洗脱质粒 dna 30-50 µL, 用分光光度计测定其 dna 浓度。
- 进行线性化1-2 µg 质粒与不我限制性和纯化 dna 与 dna 清洁套件后, 它的指导手册后, 我不消化。洗脱将 DNA 转化为5µL 水, 离心1.4万转1分钟。预期浓度约为200-300 µL。
- 执行体外转录没有我线性化 pCS2FA-transposase 作为 DNA 模板使用商业 SP6 转录试剂盒。
- 一旦反应完成, 纯化 Tol2 transposase mRNA 使用商业 RNA 清洁套件后, 制造商的指示。最后, 将洗脱 mRNA 转化为20µL RNAase 水, 并测定分光光度计中的 RNA 浓度。预期浓度约为1-3 µg/µL. 如果需要, 样品可以储存在-80 摄氏度的冰箱里。
- 用 Tol2 在 transposase 管中混合20µL pDestTol2-ubi-ASAP1 和µL 离心 mRNA (100 ng/吹打), 制备微注射溶液。为了防止重复解冻和冷冻引起的核酸降解, 整除6µL 每管, 并将其存储在-80 °c 冷藏库中供将来使用。
3. 显微注射
- 在注射前的下午, 设置4-6 个繁殖槽, 至少有2名男性和2名女性。这些鱼不能在下午喂饱。这一步骤将减少鱼的数量和节省时间, 以清洁他们第二天早上, 同时也有助于诱导育种的反应。
- 第二天早上, 从-80 °c 冰箱中取出准备好的注射液 (pDestTol2ubi-ASAP1 构造和 Tol2 mRNA), 并将其放在冰上。
- 拉在鱼饲养池的分隔, 让鱼交配。一般来说, 鱼在拉出分隔线后20-30 分钟内产卵。如果没有, 再等1-2 小时。有些鱼可能根本不下蛋。在这种情况下, 重复这个实验的鱼胚收集。
- 在等待, 确保有针准备与尖端打破了一个角度创建一个斜面边缘与镊子, 或打破一个微妙的任务雨刷。
- 使用以下参数在微拉拔上从毛细管玻璃上拔出针头: 热 545;拉 60;速度 80;时间 250;压力500。用镊子在解剖范围 (用眼睛片断标尺为直径估计) 打破针在一个角度近似45°。根据 microinjector 的设置, 所需的针径可以是可变的, 但更小的直径是降低胚胎死亡率的首选。
- 一旦鱼产卵, 收集他们在一个10厘米直径培养皿, 并把他们带到解剖范围。清除所有异常的胚胎和鱼废料。
- 将受精的胚胎吸管成3% 琼脂糖注射模。去除多余的水分, 以帮助保持胚胎的到位。
- 一旦所有的行都充满了可行的胚胎, 安排它们, 使单个细胞都朝同一个方向向针, 这是关于45°角度水平。这将使注入更容易后。
- 戴上手套时, 用20µL 装吸管尖, 从冰管上取出5µL。
- 小心地将尖端插入到断毛管的后端, 直到它开始圆锥, 以使试剂接近尖端。如果还有气泡, 摇动针头, 确保不折断笔尖。
- 将针头直接插入微注射针夹中, 仔细拧紧, 直到针固定到位。将角度调整为关于45°。
- 一旦针准备好并附上, 打开显微镜和气体压力罐。商业 CO2坦克通常是好的为此目的。注射容积由保持和弹射压力调整: 大约 0.5 psi 为持有和 30 psi 为弹射。请务必检查解决方案时, 按下踏板。
- 使用一滴矿物油的舞台千分尺, 调整溶液的体积和流量, 以150µm 直径 (约 2 nL)。确保背部压力会让少量滴出针。如果没有足够的背部压力, 毛细管作用将导致液体进入针头和破坏 mRNA。
- 一旦针被校准, 开始注射的结构进入受精胚胎的单细胞。
注意: 这需要大量的练习, 耐心和技巧, 因为细胞膜很难刺穿。重要的是, 把溶液注入细胞, 而不是蛋黄, 以生成转基因斑马鱼。这与吗啉代注射液不同。只要结构进入细胞, 针进入细胞的哪一侧就无关紧要了。如果注入蛋黄而不是细胞, 转基因的成功率会很低。单细胞阶段注射也很重要, 或体细胞嵌合体鱼将被创造。这将减少转基因进入生殖细胞的几率。 - 使用凝胶缺口的边缘提供一个支持, 保持胚胎到位, 并允许针施加压力, 而不移动胚胎。一旦针的尖端是在单一的细胞, 按下踏板释放所需的解决方案量。对所有的胚胎重复这个过程。
- 完成后, 将注入的胚胎通过用鱼系统水和一次性的3.4 毫升转移吸管从琼脂糖槽中冲洗出来, 将注射的胚转移到标记皿中。将胚胎储存在28.5 摄氏度的孵化器中, 让它们发育。在一天内检查清除死鱼胚胎, 并在鱼水中用0.1% 亚甲基蓝代替水。
- 注射后大约6-8 小时, 取10个单独注射的鱼胚, 并使用最厉害的方法18制备基因组 DNA。
- 第二天早上, 用一个荧光光源解剖显微镜来整理在非蛋黄组织中显示 GFP 的胚胎。这些鱼类胚胎应包含注入结构。
- 执行 Tol2 检验以检查座子活动, 如前所述19。如果能检测到切除的质粒, 则保留注入的鱼类胚胎并将其饲养。如果不能检测到切除的质粒, 重复 Tol2 mRNA 的合成和显微注射过程, 直到达到 Tol2 的阳性结果。
4. 建立转基因 ASAP1 鱼, Tg (ubi: ASAP1)
- 将注入的鱼 (F0代) 提高到成年, 如斑马鱼书20中所述。这通常需要4月左右。
- 采取一个单一的成人 F0鱼和交叉它与单一的性别 wildtype 鱼。在后天繁殖后收集鱼类胚胎。将收集到的鱼类胚胎保存在28.5 摄氏度的鱼水孵化箱中, 0.1% 亚甲基蓝。
- 第三天, 用 GFP 过滤器检查荧光解剖显微镜下的鱼胚。分类出绿色鱼类胚胎, 如果有的话, 并提高他们成年为 F1代转基因鱼, Tg (ubi: ASAP1)。
注: 由于大多数父母 F0鱼都是胚芽线遗传合体, 因此不需要孟德尔比。 - 交叉单 F1成年鱼与 wildtype 鱼和收集鱼类胚胎。将绿色鱼类的胚胎分类, 并将它们提高到成年时为 F2代鱼。
注: 如果有单一的转基因, 绿色和非绿色鱼类胚胎应接近1:1。 - 要查看肿瘤像恶性周围神经鞘瘤 (MPNST) 的电位变化, 交叉 F2代 Tg (ubi: ASAP1) 鱼与rpl35hi258/wt 鱼。众所周知, 可见肿瘤开始在6-8 月大的成人21,22中找到。
5. 成像
- 为了图像斑马鱼胚胎, 采取多 F2世代创建者鱼并且横渡他们与 wildtype 鱼在各自的对。根据斑马鱼的分期指南23, 在不同的理想发育阶段收集鱼类胚胎。
- 在鱼胚的早期阶段, 在10厘米直径的培养皿中, 用鱼系统水, 在解剖范围内仔细地剥除胚胎的 chorions。
- 用3.4 毫升一次性转移吸管将一些鱼类胚胎转移到凹玻璃滑块上, 使用3% 纤维素。将胚胎调整到所需位置, 使用荧光解剖范围下的针来查看蜂窝 GFP 活动。
- 对于鱼类胚胎的移动阶段 (较早于 12 somite 阶段), 使用 0.05% tricaine 甲磺酸麻醉鱼胚, 然后将其转移到滑梯上。简单地, 鱼胚在鱼水中被发现成 0.05% tricaine 甲磺酸, 直到它们停止游泳和失去身体平衡。此外, 添加一滴 0.05% tricaine 甲磺酸与纤维素在幻灯片上。
- 对于不到 12 somite 阶段的鱼类胚胎, 使用一种免疫荧光复合显微镜与兼容的相机和软件进行成像。对于12岁以上的 somite 阶段鱼类胚胎, 使用荧光解剖显微镜。
- 为了图像肿瘤细胞的电压, 首先发现鱼与 MPNST 肿瘤。然后, 麻醉鱼与 0.05% tricaine 甲磺酸。对于整个安装成像, 把鱼变成一个10厘米直径培养皿。为了查看肿瘤细胞的电活动, 在全装成像后可能会解剖出鱼肿瘤。
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Representative Results
在一个成功的注射, 超过50% 注入鱼类胚胎将显示一定程度的绿色荧光在体细胞, 其中大部分将是积极的 Tol2 座子的消费检测 (图 2)。经过2-4 代与 wildtype 鱼的杂交 (直到荧光鱼达到 50%, 预期的孟德尔比), 转基因鱼被用于成像实验, 以跟踪细胞膜电位在胚胎发育过程中。首先, 在斑马鱼早期胚胎发育阶段, 在整个细胞周期内检查膜电位的变化。据观察, 细胞超极化搏在沟沟形成之前(图 3A-3C和辅助视频 1)。另外, 不同组织在1-3 天的老鱼胚中表现出多种膜电位。(图 3D-3G)。例如, 胚胎背部和脊索通常超极化搏, 与相邻的组织/器官相比。一旦斑马鱼胚胎能够移动, 我们也能够检测神经肌肉电活动 (图 4,辅助视频 2)。由于癌细胞的生物属性可以改变, 我们利用了这 ASAP1 的报告鱼, 并越过它与一个rpL35基因突变体, 这是容易自发恶性周围神经鞘肿瘤21,24 ,25。虽然仅有少数鱼肿瘤被检查, 由于鱼肿瘤突变体的长的潜在的成长期, 它是明显的有电压区别在肿瘤和周围的组织之间在活肿瘤携带的斑马鱼 (图 5)。因此, 这些代表的结果显示了成功的生成细胞电子报告鱼线, 及其在发展和细胞生物学的潜在应用。
图 1: Tol2 座子质粒结构的图示。
(A) BP 重组用于 ASAP1 子克隆 pDONR221 中间输入向量。attB 序列添加到5端的引物为 ASAP1。基于 LR 重组的 Tol2 座子构造装配的(B)图。紫色椭圆形的形状显示 Tol2 倒置重复。虚线表示同源重组。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 荧光和 Tol2-excise 法注射胚胎的典型结果。
(A)非正1dpf 鱼胚。(B)成功注入1dpf 鱼胚。GFP 斑点在树干是明显的。(C)非阳性2dpf 鱼胚。(D)成功注入2dpf 鱼胚。GFP 斑点在树干是明显的。(E) Tol2 消费分析的一个典型结果。1-7 条 PCR 在注射后8小时内从7随机选择的鱼胚中扩增。最后一个是没有任何基因组 DNA 的负控制 (NC)。刻度条 = 250 微米。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 斑马鱼胚胎发育过程中的动态电压变化。
(-c)鱼类胚胎有丝分裂过程中的细胞电压极性差异。(A) 2-细胞阶段斑马鱼胚胎。(B) 4 细胞阶段胚胎。(C) 8-细胞阶段胚胎。红色箭头指示在面板中的解沟沟位置 (A-C)。在相应的影片 (辅助视频 1) 中, 这些更改也很明显。与细胞的其余部分相比, 沟沟周围的区域更极化。(D-G)斑马鱼胚胎不同早期阶段的动态电压变化。(D) 12-somite 阶段。(E) 22-somite 阶段。(F)施肥后48小时。(G)施肥后72小时。e, 眼睛;ht, 心脏;nt, 脊索;op, 视神经囊;耳, 囊泡; pf, 胸鳍;因此, somite;yk, 蛋黄。刻度条 = 250 微米。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 鱼体在鱼类胚胎运动期间的电电压变化。
2天的老鱼胚胎在运动过程中显示神经肌肉的电活动。(A)-(F)同一鱼胚的序列成像。颜色密度变化对应于电信号传导。两个连续图像之间的间隔时间约为12.4 毫秒。红色箭头指示在成像期间电压发生变化的位置。在相应的影片 (辅助视频 2) 中, 这些更改也很明显。所有的面板都在相同的规模。刻度条 = 250 微米。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 肿瘤细胞趋于极化。
10月的老鱼(rpL35hi258/wt;Tg (ubi: ASAP1) 在腹部形成了恶性周围神经鞘瘤。(A) & (C)明亮的字段图像。使用 GFP 通道的(B) & (D)图像。(A) & (B)完好的鱼。(C) & (D)腹部肿瘤被解剖。与周围组织 (深绿色) 相比, 肿瘤细胞更极化 (明亮的绿色)。箭头显示肿瘤。所有的面板都在相同的规模。刻度条 = 25 毫米.请单击此处查看此图的较大版本.
辅助视频 1.Epifluorescent 在 Tg (ubi: ASAP1) 鱼胚的劈裂阶段的电信号成像。这部电影是从动物杆的角度记录下来的。ASAP1 荧光与细胞裂解沟形成有关, 是细胞分裂过程中的一种临时结构。请单击此处下载此文件.
辅助视频 2.Epifluorescent 2 天老 Tg (ubi: ASAP1) 鱼类胚胎运动的电信号成像。这一举动是从2天的老鱼胚麻醉后的横向视图记录的。在运动过程中, 神经肌肉组织中的 ASAP1 荧光改变是明显的。请单击此处下载此文件.
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Discussion
虽然早在胚胎发育和人类疾病中发现了细胞和组织水平的电活动, 但体内动态电变化及其生物学作用仍然很大程度上是未知的。其中一个主要的挑战是可视化和量化的电气变化。膜片钳技术是跟踪单细胞的一种突破, 但是它在脊椎动物胚胎中的应用是有限的, 因为它们是由许多细胞组成的。由于敏感度、特异度和毒性, 目前的化学电压染料也不理想。最近在 GEVIs 发明方面的努力为我们提供了一个新的途径, 可以将细胞电活动在体内和实时地可视化。在这里, 我们展示了创建斑马鱼电子记者线的过程, Tg (ubi:ASAP1)。
利用这条鱼线, 我们展示了可以在斑马鱼胚胎中监测的细胞电活动。在早期胚胎发育过程中, 电压变化与细胞周期呈高度相关。我们观察到, 极化发生在分裂沟/细胞分裂的形成之前 (图 3)。这与当前的知识相反, 在细胞分裂26之前, 极化现象会发生。因此, 更多细节的细胞膜电压变化期间, 其他动物和人类细胞周期, 这是否与组织上下文有关, 需要进一步研究。目前, 我们的实验室正在进行相关研究。此外, 我们已经证实, ASAP1 能够跟踪神经肌肉系统 (图 4) 中的生理电压变化, 在这种情况下, 与细胞周期中的变化相比, 改变相对较快。
这也表明, 该记者也可以用来可视化斑马鱼肿瘤 (图 5)。这是有趣的发现肿瘤细胞一般更极化相比, 周围的正常组织。然而, 这是一个普遍现象的所有恶性组织需要进一步的调查, 由于肿瘤样本和鱼类肿瘤类型的限制, 本研究。未来的研究对细胞膜极化和电压量化的其他类型的肿瘤和人类癌细胞将是信息, 以更好地了解其在肿瘤发生过程中的作用。
在本协议中, 我们选择了一个无处不在的启动子驱动 ASAP1 表达跟踪所有细胞的鱼类胚胎。组织或器官特定的促进者可能是另一种选择, 如果只有特定的细胞/组织类型是首选。ASAP1 电压传感器是一种比较好的特征生物传感器, 它由海喷电压敏感磷酸酶 (S3-S4 环) 的电压敏感域和 GFP (默认为低荧光) 的圆形置换组成。据报道, 在人类神经元细胞和小鼠脑切片的外部细胞膜上表达了4,27,28。传感器的亮度由 S3-S4 环和 GFP 的构象位置决定。由于亮度变化的速度和蛋白质的合成, 快速的绿色荧光变化不太可能由蛋白质浓度引起。然而, 由于基因组不稳定的性质, 转基因 ASAP1 可能改变了肿瘤细胞的表达。除了 ASAP1 之外, 其他 GEVIs (如基于 archaerhodopsin 的电压指示器 (QuasAr1 和 QuasAr2) 也可能是一个很好的互补选项, 因为它们使用的是完全不同的机制, 而且它们也具有高灵敏度和速度29。另外, 他们的发射是在红色颜色范围。这使他们特别免费的绿色 ASAP1, 如果已经有另一个荧光灯蛋白在同一细胞。例如, ASAP1 和类星体可以与 Fucci 斑马鱼30结合, 研究细胞周期与电位变化之间的关系。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本出版物所报道的研究工作得到国家卫生研究院全国普通医学研究所的支持, R35GM124913、普渡大学 PI4D 奖励计划和 PVM 内部竞争基础研究基金项目。内容完全是作者的责任, 不一定代表供资代理人的官方意见。我们感谢高一川上刚为 Tol2 构造, 林为 ASAP1 构造, 和伦纳德 Zon为ubi 启动子构造通过 Addgene。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
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