Summary
Aqui, mostramos o processo de criação de uma linha de zebrafish do repórter de tensão elétrica celular para visualizar o desenvolvimento embrionário, movimento, e células de tumor de peixe em vivo.
Abstract
Bioeletricidade, sinalização eléctrica endógeno mediada por canais iônicos e bombas localizadas na membrana celular, desempenha papéis importantes na sinalização de processos das células neuronais e musculares excitáveis e muitos outros processos biológicos, tais como embrionárias padronização do desenvolvimento. No entanto, há uma necessidade na vivo monitoramento da atividade elétrica em vertebrados embriogênese. Os avanços dos indicadores de voltagem fluorescente geneticamente codificado (GEVIs) tornaram possível fornecer uma solução para este desafio. Aqui, descrevemos como criar um indicador de tensão transgénicos zebrafish usando o indicador de tensão estabelecida, ASAP1 (acelerado Sensor de potenciais de ação 1), por exemplo. O kit de Tol2 e um promotor de zebrafish onipresente, ubi, foram escolhidos neste estudo. Nós também explicar os processos de clonagem de site-specific Gateway Tol2 baseados em transposon zebrafish transgênese e o processo de imagem para tumores de embriões e peixes peixes fase inicial usando regular epifluorescente microscópios. Usando esta linha de peixe, achamos que há mudanças de tensão elétrica celular durante a embriogênese de zebrafish e movimento de larvas de peixes. Além disso, observou-se que em alguns zebrafish tumores de bainha de nervo periférico maligno, o tumor de células foram geralmente polarizadas em comparação com os tecidos normais circundantes.
Introduction
Bioeletricidade refere-se a sinalização eléctrica endógeno mediada por canais iônicos e bombas localizadas na membrana celular1. Intercâmbio iônico através da membrana celular e as acoplado mudanças atuais e potenciais elétricas, é essencial para a sinalização de processos das células neuronais e musculares excitáveis. Além disso, bioeletricidade e gradientes de íons têm uma variedade de outras funções biológicas importantes, incluindo o armazenamento de energia, biossíntese e transporte do metabólito. Sinalização bioelétrica também foi descoberto como um regulador de formação embrionária padrão, tais como machados do corpo, o ciclo celular e de diferenciação celular1. Assim, é fundamental para a compreensão de muitas doenças congênitas humanas que resultam do Regulamento mis deste tipo de sinalização. Embora a braçadeira do remendo tem sido amplamente utilizada para gravação de células únicas, é ainda longe do ideal para o monitoramento simultâneo de várias células durante o desenvolvimento embrionário em vivo. Além disso, pequenas moléculas sensíveis de tensão também não são ideais para aplicações em vivo devido às suas especificidades, sensibilidades e toxicidades.
A criação de uma variedade de geneticamente codificado fluorescente tensão indicadores (GEVIs) oferece um novo mecanismo para superar este problema e permite a fácil aplicação estudar o desenvolvimento embrionário, mesmo que eles foram originalmente destinados para monitoramento neural células de2,3. Dentre os GEVIs atualmente disponíveis é o acelerado Sensor de potenciais de ação 1 (ASAP1)4. É composto por um loop extracelular de um domínio sensor de tensão de tensão sensível fosfatase e uma circular permutada proteína verde fluorescente. Portanto, ASAP1 permite a visualização de alterações de potenciais elétricas celulares (polarização: verde brilhante; despolarização: verde-escuro). ASAP1 tem 2 ms sobre-e-off cinética e pode seguir abaixo do limite potencial mudança4. Assim, esta ferramenta genética permite um novo nível de eficácia no monitoramento em tempo real bioelétrica em células vivas. Mais compreensão dos papéis de bioeletricidade no desenvolvimento embrionário e muitas doenças humanas, tais como câncer, derramará nova luz sobre os mecanismos subjacentes, que é fundamental para a prevenção e tratamento da doença.
Zebrafish provaram um poderoso modelo animal para estudar a biologia do desenvolvimento e doenças humanas, incluindo o câncer5,6. Eles compartilham genes ortólogos de 70% com os humanos, e eles têm biologia vertebrada semelhante7. Zebrafish fornecer cuidados relativamente fácil, um tamanho de embreagem grande de ovos, genética tractable, transgênese fácil e desenvolvimento embrionário externo transparente, que faz com que um sistema superior na vivo de imagem5,6. Com uma grande fonte de linhas de peixes mutantes já presentes e um genoma completamente sequenciado, zebrafish fornecerá uma variedade relativamente ilimitada de descoberta científica.
Para investigar na vivo em tempo real atividade elétrica das células, aproveitamos o sistema modelo de zebrafish e ASAP1. Neste artigo, descrevemos como incorporar o biosensor fluorescente tensão ASAP1 no genoma da zebrafish usando Tol2 transposon transgênese e visualizar a atividade elétrica celular durante o desenvolvimento embrionário, movimento larvas de peixe e no tumor ao vivo .
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Protocol
O zebrafish estão alojados em instalações animais AAALAC-aprovado, e todos os experimentos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo cuidado do Animal de Purdue e Comissão de utilização (PACUC).
1. Tol2 Transposon plasmídeo construção preparação
Nota: Tol2, um transposon que foi descoberto no peixe medaka, tem sido amplamente utilizado na Comunidade de investigação o zebrafish8,9. Foi com sucesso adoptado para o Gateway site-specific recombinação sistema baseado em clonagem e conhecido como o Tol2 do kit10. O kit Tol2 permite uma maneira mais conveniente de criar construções personalizadas de expressão, enquanto também aumenta a eficiência da transgênese. Assim, foi uma decisão fácil para tirar vantagem deste sistema e criar uma linha onipresente de zebrafish expressão ASAP1 usando um promotor validado ubiquitin para conduzir ASAP111.
- Criando uma construção de entrada meio ASAP1: pDONR221-ASAP1
- Adquira a construção de sensor ASAP1 tensão geneticamente codificado, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmídeo #52519), de Addgene. Para amplificar a região codificante ASAP1, configure uma PCR utilizando primers personalizados (attB1-ASAP1F e attB2-ASAP1R) ladeados com sequências attB na extremidade 5' dos primers (Figura 1). Phusion DNA polimerase foi escolhido por sua alta eficiência, e condições PCR foram otimizadas com base no protocolo previamente publicado12.
- Carregar os produtos PCR 50 µ l em um 1% TAE gel usando uma pipeta regular com dicas de 200 µ l e executar eletroforese em 160 V em um tanque de gel de horizontal por cerca de 30 min.
- Verifique o gel sob um transiluminador UV (353 nm), excisar a banda desejada usando um lâmina/bisturi sob um transiluminador UV como anteriormente publicado13,14e coloque a amostra do DNA contendo gel em microcentrifuga limpa 1,5 mL tubo.
- Execute o gel de purificação para os produtos de PCR ASAP1. Recuperar o DNA no gel extirpado usando um kit comercial de purificação gel ADN seguindo as instruções do fabricante e eluir o DNA em 20 µ l de água. Tomar 1 µ l de como uma amostra e medir a concentração de DNA utilizando um espectrofotômetro. Fluxo as instruções de software utilizando a água como um controle em branco15.
- Pegue 100 ng de purificado o produto do PCR e misturá-lo com 150 ng do plasmídeo pDONR221 em 10 µ l de TE buffer (10 mM Tris, pH de 1 mM EDTA 8.0)16. Adicionar 2 µ l de BP Clonase II para a reação e incubar a reação à temperatura ambiente durante a noite.
- No segundo dia, adicionar 1 µ l de proteinase K para a reação e incubar a reação a 37 ° C por 30 min.
- Execute a transformação. A reação de transferência e misturá-lo com 50 µ l de Top10 competentes de Escherichia coli células e incubar as células no gelo por 30 min. Em seguida, transferência imediatamente, o tubo de reação em um banho de água de 42 ° C por 1 min. Retire o tubo e incubar no gelo por 2 min. Em seguida, colocar o tubo em um shaker de 37 ° C e incube por 1h.
- Retire o tubo e as células em um prato de canamicina LB da placa. Em seguida, incubar a placa durante a noite (16-18 h) a 37 ° C.
- Escolha única e bem separadas colônias e inoculá-los em tubos de cultura de células de 14 mL com 3 mL de meio LB. Cultura-los durante a noite a 37 ° C em uma coqueteleira com uma velocidade de rotação de 250 rpm (rotação por minuto).
- Execute miniprep usando um kit miniprep comercial seguindo seu manual de instrução17.
- Sequência 3-4 plasmídeos com Sanger sequenciamento identificar positivo pDONR221-ASAP1 clones usando M13F e M13R iniciadores de sequenciamento.
- Criando a construção Tol2 para microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1
- Escolha que o sequenciamento e verificados pela medida pDONR221-ASAP1 clone sua concentração de DNA usando uma sequência de espectrofotômetro a instruções de software utilizando a água como um espaço em branco controlar15.
- Pegue 100 µ g de pDONR221-ASAP1 e misture com 100 µ g de plasmídeo de 5-final do Tol2 kit (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µ g de p3E-polyA (kit de Tol2 #302) e 150 µ g de pDestTol2pA2 (kit de Tol2 #394). Ajustar o volume total de 8 µ l usando TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) numa microcentrifuga 1,5 mL do tubo e misture bem por um vórtice de breve s 2-5. Em seguida, adicionar 2 µ l de LR Clonase II plus e incubar a reação à temperatura ambiente durante a noite.
- No segundo dia, adicionar 1 µ l de proteinase K para a reação usando uma pipeta de 10 µ l e incubar a reação a 37 ° C por 30 min.
- Realizar a transformação e identificar clones positivos, como descrito acima (passos 1.1.7-11).
- Medida a concentração de DNA de sequenciamento verificado clone pDestTol2-ubi-ASAP1 (figura 1B) usando um espectrofotômetro15. Normalmente, a concentração é em torno de 200ng / µ l.
2. prepare Tol2 Transposase mRNA e injeção de solução
- Raia Escherichia coli glicerol estoque de pCS2FA-transposase plasmídeo (kit de Tol2 #396) em uma placa LB (com 100 ampicilina µ g/mL) com uma ansa de inoculação esterilizado. Incube a placa a 37 ° C numa incubadora durante a noite. No dia seguinte, escolher uma única colônia e inoculá-lo em 3 mL de LB (Ampicilina 100 µ g/mL) com uma ponta de pipeta de 10 µ l esterilizado. Cultura-lo durante a noite a 37 ° C em uma coqueteleira com uma velocidade de rotação de 250 rpm.
- Execute miniprep na cultura de Escherichia coli usando um kit miniprep comercial seguindo seu manual de instruções. Eluir Plasmídeo em 30-50 µ l de tampão TE por 1 minuto centrifugação a 14.000 rpm e medir sua concentração de DNA com um espectrofotômetro.
- Linearizar 1-2 µ g do plasmídeo com eu não endonuclease e purificar o DNA com um DNA kit eu não seguindo o seu manual de instruções de limpeza digestão. Eluir o DNA em 5 µ l de água por centrifugação a 14.000 rpm por 1 minuto. A concentração esperada é de 200-300 ng / µ l.
- Executar em vitro transcrição com não eu linearizada transposase-pCS2FA como um modelo de DNA usando um kit de transcrição comercial SP6.
- Quando a reação estiver terminada, purifica Tol2 transposase mRNA usando um RNA de limpeza comercial kit seguindo as instruções do fabricante. Finalmente, eluir mRNA na água de RNAase livre 20 µ l e medir a concentração de RNA em um espectrofotômetro. A concentração esperada é sobre 1-3 µ g / µ l. as amostras podem ser armazenadas em um freezer-80 ° C, se necessário.
- Preparar a solução de microinjeção misturando 20 ng / µ l pDestTol2 -ubi-ASAP1 e Tol2 transposase mRNA (100 ng / µ l) em um tubo de microcentrifugadora por pipetagem. Para prevenir a degradação do ácido nucleico causada por repetidos descongelar e recongelar, alíquota 6 µ l pelo tubo e armazená-lo em um freezer-80 ° C para uso futuro.
3. microinjection
- Conjunto 4-6 tanques de criação pelo menos 2 machos e 2 fêmeas a tarde antes da injeção. Estes peixes não devem ser alimentados à tarde. Esta etapa irá reduzir a quantidade de resíduos de peixe e economizar tempo para limpá-los na manhã seguinte, enquanto também ajuda a induzir uma resposta de reprodução.
- Na manhã seguinte, retire a solução preparada de injeção (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construção e Tol2 mRNA) do congelador a-80 ° C e coloque-o no gelo.
- Puxe os divisores nas tanques de piscicultura e permitir que os peixes acasalar. Em geral, peixes depositam ovos dentro de 20-30 minutos depois de puxar para fora o divisor. Se não, espere 1-2 horas a mais. Alguns peixes não podem colocar ovos em tudo. Neste caso, repita este experimento para colheita de embriões de peixe.
- Enquanto espera, certifique-se que existem agulhas preparadas com a ponta quebrada em um ângulo, criando uma borda chanfrada com fórceps, ou quebrando em um limpador de tarefa delicada.
- Puxe as agulhas de vidro capilar um puxador de micropipeta usando os seguintes parâmetros: aqueça 545; Puxe a 60; velocidade 80; tempo 250; pressão de 500. Quebre a agulha com pinça debaixo de um escopo de dissecação (com a parte do olho régua para estimativa de diâmetro), mantendo-se a pinça a um ângulo de aproximadamente 45 °. Diâmetros de agulha desejada podem ser variável dependendo das configurações de microinjector, mas menor diâmetro é preferível para diminuir a mortalidade do embrião.
- Uma vez que os peixes têm ovos, recolhê-los em um diâmetro de 10 cm de Petri e trazê-los para o escopo de dissecação. Remover todos os embriões anormais e resíduos de peixe.
- Pipetar os embriões fertilizados para a injeção de agarose preparado a 3% do molde. Remova o excesso de água para ajudar a manter os embriões no lugar.
- Uma vez que todas as linhas estão cheios de embriões viáveis, organizá-los para que as células únicas todas enfrentam o mesmo sentido em direção a agulha, que é aproximadamente um ângulo de 45° na horizontal. Isto facilitará injeção muito mais tarde.
- Usando luvas, usar uma pipeta de carregamento de 20 µ l ponta e retire o tubo no gelo 5 µ l de construção de preparado.
- Introduza cuidadosamente a ponta na extremidade traseira do tubo capilar quebrado até onde começa a seringueiro, para obter o reagente mais perto da ponta. Se ainda existem bolhas de ar, agite a seringa, certificando-se de não quebrar a ponta.
- Introduza a agulha direto para o suporte da agulha de microinjeção e aperte cuidadosamente até que a agulha permanece no lugar. Ajuste o ângulo de aproximadamente 45°.
- Uma vez que a agulha é preparada e ligada, ligue o microscópio e gás tanque de pressão. Comercial CO2 tanques são geralmente bons para essa finalidade. O volume de injeção é ajustado pela pressão de exploração e ejeção: aproximado de 0,5 psi para exploração e 30 psi para ejeção. Certifique-se de verificar que a solução vem quando pressionando o pedal.
- Usando um micrômetro de palco com uma gota de óleo mineral, ajustar o volume e o fluxo da solução a ~ 150 µm de diâmetro (cerca de 2 nL). Certifique-se de que a pressão de retorno vai deixar uma pequena quantidade a escorrer para fora da agulha. Se não houver pressão suficiente, ação capilar causará líquido inserir a agulha e destruir o mRNA.
- Uma vez que a agulha é calibrada, começam a injetar a construção para a única célula dos embriões fertilizados.
Nota: Isto leva a uma grande quantidade de prática, paciência e sutileza, devido à membrana celular, sendo difícil de furar. É importante injectar a solução dentro da célula, não a gema, para a geração de zebrafish transgênico. Isso é diferente de Morpholinos injeção. Não importa de que lado a agulha entra na célula, enquanto a construção vai na célula. A transgênese terá uma taxa muito baixa de sucesso se injetado a gema ao invés da célula. Injeção de célula única fase também é importante, ou peixe Quimera somática será criado. Isso reduzirá a possibilidade do transgene entrando para as células germinativas. - Use a borda do gel de entalhe para fornecer um revestimento protetor que mantém o embrião no lugar e permite que a agulha aplicar pressão sem mover o embrião. Uma vez que a ponta da agulha na única célula, pressione o pedal para liberar a quantidade desejada de solução. Repita este processo para todos os embriões.
- Quando concluído, transferi os embriões injetados num prato rotulado enxaguando-os fora do entalhe de agarose com sistema de água de peixes e uma pipeta de transferência descartável 3,4 mL. Armazene os embriões em uma incubadora de 28,5 ° C para deixá-los a desenvolver. Verifique volta ao longo do dia removendo embriões de peixe morto e substitua a água com azul de metileno 0,1% em água de peixe.
- Cerca de 6-8 horas após a injeção, tome 10 indivíduo injetado embriões de peixe e preparar o DNA genômico de-los usando o método de Hotshot18.
- Na manhã seguinte, use um microscópio de dissecação com uma fonte de luz de fluorescência para classificar para fora os embriões mostrando GFP nos tecidos não-gema. Estes embriões de peixe devem conter a construção injetada.
- Realize o ensaio de impostos especiais de consumo Tol2 para verificar a atividade do transposon conforme descrito anteriormente,19. Se o plasmídeo excisado pode ser detectado, manter o injetado embriões de peixe e criá-los. Se nenhum plasmídeo excisado pode ser detectado, repita o processo de síntese e microinjeção de mRNA Tol2 até alcançar os resultados positivos do ensaio de impostos especiais de consumo do Tol2.
4. a criação de peixes transgênicos ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)
- Levante o peixe injetado (geração de0 F) até a idade adulta, conforme descrito anteriormente no zebrafish livro20. Isto geralmente leva cerca de 4 meses.
- Tirar um único adulto F0 peixe e cruzá-lo com um único oposto sexo sua peixe. Colete embriões de peixes após a criação no final do dia. Manter os embriões de peixes coletados na incubadora de 28,5 ° C em peixes de água com azul de metileno 0,1%.
- No terceiro dia, verifique os embriões de peixes debaixo de um microscópio fluorescente dissecação com um filtro GFP. Resolver os embriões de peixe verde, se houver algum e criá-los até a idade adulta como F1 geração transgénica peixe, Tg (ubi: ASAP1).
Nota: Proporção mendeliana não é esperada uma vez que a maioria dos peixes0 F parentais é quimeras genética germinal. - Cruze o único F1 peixes adultos com peixes de sua e coletar embriões de peixes. Resolver os embriões de peixe verde e criá-los para a vida adulta como F2 geração de peixe.
Nota: Verde e embriões de peixe não-verde devem ser próximo de 1:1 se há um único transgene. - Para exibir as alterações de potenciais elétricas no tumor como tumores de bainha de nervo periférico maligno (MPNST), atravessar a geração de2 F Tg (ubi: ASAP1) peixe com peixe rpl35hi258/wt . Sabe-se que tumores visíveis começam a ser encontrados em 6-8 meses de idade adultos21,22.
5. imaging
- Que imagem zebrafish embriões tomar múltiplos fundador de geração F2 peixes e cruzá-los com sua peixe pares individuais. Colete embriões de peixe em diferentes estádios de desenvolvimento desejados, de acordo com o zebrafish encenando guia23.
- Para os estágios iniciais dos embriões de peixes, descascar e retirar chorions dos embriões com cuidado, usando um par de pinças em um escopo de dissecação de um diâmetro de 10 cm Petri com sistema de água de peixes.
- Transferi alguns embriões de peixe numa lâmina de vidro concaved com metilcelulose de 3%, utilizando uma pipeta de transferência descartável de 3,4 mL. Ajuste os embriões para as posições desejadas para visualizar a atividade celular de GFP usando uma agulha por baixo de um escopo de dissecação fluorescente.
- Para as fases móveis de embriões de peixes (mais de 12 palco somite), use o mesilato de metanosulfonato de 0,05% para anestesiar os embriões de peixe antes de transferi-los para slides. Brevemente, embriões de peixes foram surgiu em 0.05% tricaina mesilato em água de peixe até que eles pararam de natação e equilíbrio do corpo de perda. Além disso, adicione uma gota de mesilato de tricaina 0,05% com a metilcelulose no slide.
- Para menos de 12 embriões de peixe de estágio somite, use um microscópio composto de epi-fluorescência com uma câmera compatível e software para a imagem latente. Por mais de 12 embriões de peixe somite estágio, use um microscópio de fluorescência dissecação.
- Tensão de célula de tumor de imagem, primeiro, identificar os peixes com tumores MPNST. Em seguida, anestesia o peixe com mesilato de metanosulfonato de 0,05%. Para toda montagem imagem, coloque o peixe em um prato de Petri de 10-cm de diâmetro. Para visualizar a atividade elétrica de células de tumor, tumores de peixe podem ser dissecados para fora após toda montagem imagem.
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Representative Results
Em uma injeção bem sucedida, mais do que embriões de peixe 50% injetado irão exibir algum grau de fluorescência verde nas células somáticas, e a maioria deles será positiva por meio de ensaio Tol2 transposon impostos especiais de consumo (Figura 2). Após 2-4 gerações de para fora-Cruz com sua peixes (até que o peixe fluorescente chegar a 50%, a proporção mendeliana esperada), os peixes transgênicos foram utilizados para o experimento de imagem para controlar potenciais de membrana celular durante o desenvolvimento embrionário. Primeiro, as alterações de potencial de membrana foram examinadas ao longo do ciclo celular durante zebrafish estágios iniciais do desenvolvimento embrionário. Observou-se que as células hyperpolarized antes da formação do sulco de clivagem (Figura 3A-3Ce complementar vídeo 1). Além disso, diferentes tecidos mostraram uma variedade de potenciais de membrana no dia 1-3 embriões de peixe velho. (Figura 3D-3G). Por exemplo, o somitas e notocorda são geralmente hyperpolarized, em comparação com os tecidos/órgãos adjacentes. Uma vez que os embriões de zebrafish foram capazes de mover-se,... também fomos capazes de detectar as atividades elétricas neuromusculares (Figura 4, complementar vídeo 2). Como propriedades bioelétricas de células de câncer poderiam ser alteradas, nós aproveitou este repórter ASAP1 de peixe e ele cruzou com um mutante de gene rpL35 , que é propenso a espontânea de nervo periférico maligno bainha tumores21,24 ,25. Embora apenas alguns tumores de peixes foram examinados, devido ao período de crescimento há muito potencial para o mutante de tumor de peixe, foi perceptível que existiam diferenças de tensão entre tumores e tecidos circunvizinhos no zebrafish ao vivo de tumor-rolamento (Figura 5). Assim, estes resultados representativos demonstraram a geração bem sucedida de uma linha de peixes repórter elétrico celular e sua aplicação potencial para biologia celular e do desenvolvimento.
Figura 1: Ilustração da construção baseada em transposon plasmídeo Tol2.
(A) recombinação BP foi usada para ASAP1 sub clonagem em vetor de entrada meio a pDONR221. attB sequências foram adicionadas para o 5-fim dos primers para ASAP1. (B) diagrama para Tol2 baseados em transposon construir montagem baseada na recombinação de LR. Forma oval roxa mostra Tol2 invertido repete. As linhas tracejadas indicam recombination homologous. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados típicos dos embriões injetados por epifluorescência e ensaio Tol2-impostos especiais de consumo.
Embrião de peixe 1dpf Non-positivo (A) . (B) injetado com sucesso embriões de peixe 1dpf. Manchas GFP são evidentes no porta-malas. Embrião de peixe 2dpf Non-positivo (C) . (D) injetado com sucesso embriões de peixe 2dpf. Manchas GFP são evidentes no porta-malas. (E) um resultado representativo do Tol2 ensaio de impostos especiais de consumo. Pista 1-7 PCR foram ampliados de 7 aleatoriamente selecionado embriões de peixe 8 horas depois da injecção. O último é um controle negativo (NC), sem qualquer DNA genômico. Barra de escala = 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Tensão dinâmica muda durante o desenvolvimento do embrião do zebrafish.
(A-C) Polaridade da tensão diferencial de celular durante a mitose em embriões de peixe. (A) embrião de zebrafish fase 2-célula. (B) embrião de estágio de 4 células. Embrião de 8 células estágio (C) . As cabeças de seta vermelha indicam as posições dos sulcos a clivagem nos painéis (A-C). As mudanças também são evidentes no filme correspondente (complementar vídeo 1). A região em torno da constrição é mais polarizada comparado com o resto da célula. (D-G) Alterações de dinâmica de tensão elétrica em diferentes estágios iniciais dos embriões de peixe-zebra. Estágio de 12-somite (D) . Estágio de 22-somite (E) . (F) 48 horas pós fertilização. (G) 72 horas pós fertilização. e, olhos; ht, coração; NT, notocorda; op, vesícula óptica; ov, vesícula ótica; pf, barbatana peitoral; então, somite; yk, gema. Barra de escala = 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Alterações de tensão elétrica do corpo durante o movimento de embrião de peixe peixe.
2 - dia velho peixe embriões mostrar o neuro-muscular elétrico atividades durante o movimento. (A) - (F) imagem sequencial do embrião mesmo peixe. Alterações de densidade de cor correspondentes para a transdução de sinalização elétrica. O intervalo de tempo entre duas imagens consecutivas é aproximadamente 12,4 milissegundos. As setas vermelhas indicam as posições que tensão alterado durante o período de imagem. As mudanças também são evidentes no filme correspondente (complementar vídeo 2). Todos os painéis estão na mesma escala. Barra de escala = 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Células tumorais tendem a ser mais polarizada.
Um peixe de 10 meses de idade (rpL35hi258/wt; TG (ubi: ASAP1) desenvolveu um tumor de bainha de nervo periférico maligna no abdômen. (A) & Bright (C) imagem de campo. (B) e (D) imagem com canal de GFP. (A) e (B) peixe intacta. (C) & abdômen (D) tumor foi dissecada para fora. Células tumorais são mais polarizada (mais brilhante verde) comparado ao redor de tecidos (verde escuro). Cabeças de seta mostram os tumores. Todos os painéis estão na mesma escala. Barra de escala = 25 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo complementar 1 . Imagem de epifluorescente de sinalização eléctrica durante estágios de clivagem em Tg (ubi: ASAP1) embrião de peixe. Este filme foi gravado do vista do polo animal. A fluorescência de ASAP1 está associada com a formação de um sulco de clivagem de célula, uma estrutura temporária durante a divisão celular. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo complementar 2 . Epifluorescente imagem de sinalização eléctrica durante 2 - velho dia Tg (ubi: ASAP1) movimento de embrião de peixe. O movimento foi gravado do vista lateral do embrião peixe 2 - velho dia após anesthetization. O ASAP1 alterações de fluorescência são evidentes no tecido neuromuscular durante o processo de mudança. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Embora as atividades elétricas nível celular e tecidos durante o desenvolvimento embrionário e doença humana foram descobertas há muito tempo atrás, na vivo elétrica mudanças dinâmicas e seus papéis biológicos ainda permanecem em grande parte desconhecidos. Um dos maiores desafios é Visualizar e quantificar as alterações elétricas. Tecnologia de braçadeira do remendo é um quebra-through para acompanhamento de células únicas, mas sua aplicação aos embriões vertebrados é limitada, porque eles são compostos de muitas células. As tinturas químicas tensão atual também não são ideais devido a suas sensibilidades, especificidades e toxicidades. Os recentes esforços na invenção de GEVIs fornecem-em um novo caminho para visualizar atividades elétrica celular na vivo e em tempo real. Aqui, nós mostramos o processo de criação de uma linha de eléctrico repórter zebrafish, Tg (ubi:ASAP1).
Usando esta linha de peixe de repórter, mostramos celulares atividades elétricas que podem ser monitoradas em embriões de peixe-zebra. A mudança de tensão elétrica está altamente relacionada com o ciclo celular durante o desenvolvimento embrionário precoce. Temos observado que hiperpolarização acontece antes da formação da divisão de celular/sulco de clivagem (Figura 3). Isto está em contraste com o conhecimento atual a despolarização acontece antes da divisão celular26. Assim, mais detalhes de voltagem da membrana da célula muda durante o ciclo celular de outras células de animais e humanos e se isto está relacionado com o contexto de tecido, requerem mais estudos. Estudos relacionados estão em andamento no nosso laboratório. Além disso, podemos ter verificado que ASAP1 é capaz de controlar alterações de tensão fisiológica do sistema neural-muscular (Figura 4), em que a alteração é relativamente rápida em comparação com as mudanças nos ciclos de célula.
Também foi demonstrado que este repórter também pode ser usado para visualizar tumores zebrafish (Figura 5). Foi interessante descobrir o tumor células geralmente eram mais polarizadas em comparação com os tecidos normais circundantes. No entanto, se se trata de um fenômeno geral para todos os tecidos malignos requer mais investigação, devido à limitação de amostras do tumor e tipos de tumor de peixes neste estudo. Futuras investigações sobre quantificação de polarização e a tensão de membrana celular em outros tipos de tumores e células cancerosas humanas será informativas para melhor compreensão de suas funções durante a tumorigênese.
Neste protocolo, optamos por um promotor onipresente para dirigir a expressão ASAP1 para controlar todas as células em embriões de peixe. Promotores de determinado tecido ou órgão podem ser outra opção se houver apenas um determinado tipo de célula/tecido preferido. O sensor de tensão ASAP1 é um biossensor relativamente bem caracterizado, e é composto por um domínio sensível tensão de Ascídia fosfatase de tensão-sensível (loop de S3-S4) e uma permutação circular de GFP (o padrão é baixa fluorescência). Foi relatado para ser expressas na membrana celular externa em células neurônio humano e rato cérebro fatias4,,27,28. O brilho do sensor é predominantemente determinado pelas posições conformacionais do loop de S3-S4 e GFP. A mudança rápida de fluorescência verde era improvável causada pela concentração de proteína, devido à velocidade das mudanças de brilho e síntese de proteínas. No entanto, o transgene, ASAP1, pode ter alterado a expressão em células tumorais, devido à natureza da instabilidade genômica. Além de ASAP1, outros GEVIs, tais como indicadores de tensão baseado em archaerhodopsin (QuasAr1 e QuasAr2), também podem ser uma boa opção complementar, desde que eles usam um mecanismo completamente diferente, e eles também têm uma alta sensibilidade e velocidade de 29. Além disso, sua emissão é na faixa de cor vermelha. Isso os torna particularmente cortesia para o ASAP1 verde, se já houver outra proteína fluorescente na mesma cela. Por exemplo, ASAP1 e QuasAr podem ser combinado com Fucci zebrafish30 para estudar a relação entre o ciclo celular e as alterações de potenciais elétricas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O trabalho de pesquisa reportado nesta publicação foi apoiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob o prêmio número R35GM124913, programa de incentivo de PI4D Universidade de Purdue e PVM interno competitivo Programa de fundos de pesquisa básica. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial dos agentes de financiamento. Agradecemos a construção Tol2, Michael Lin para a construção de ASAP1, Koichi Kawakami e Leonard Zon para a promotora ubi construir através de Addgene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA |
ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector MM3301R | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
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