Summary
ويرد وصف بروتوكول مفصلة للقيام معايرة أليسا. وعلاوة على ذلك، يرد خوارزمية جديدة لتقييم معايرة اليساس والحصول على ثابت تفكك ملزمة ليجند القابلة للذوبان لمستقبل المعطل تداولها لوحة ميكروتيتير.
Abstract
ثابت تفكك يصف التفاعل بين الشريكين في التوازن الملزم، وهو مقياس لما تقارب. أنها معلمة حاسمة لمقارنة يغاندس مختلفة، مثلاً، ومثبطات تنافسية، isoforms البروتين وطفرات، لقوتها الملزمة لشريك ملزم. ثوابت تفكك تتحدد بالتآمر تركيزات منضم مقابل يجند مجاناً منحنيات ملزمة. وفي المقابل، منحنيات المعايرة، التي يتم رسم إشارة بأن يتناسب مع تركيز يجند منضم ضد التركيز الكلي ليجند المضافة، أسهل بكثير لتسجيل. ويمكن الكشف عن الإشارة سبيكتروسكوبيكالي والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA). ويتمثل ذلك في وضع بروتوكول لمعايرة أليسا أن التدابير ربط رهودوسيتين المستمدة من السم الثعبان إلى المجال الهدف المعطل تداولها من إنتغرين α2β1. الساس معايرة تنوعاً والمستخدمة على نطاق واسع. يمكن استخدام أي زوج من البروتينات المتفاعلة مستقبلات المعطل تداولها ويجند القابلة للذوبان، شريطة أن كلا البروتينات محض، ومعروفة تركيزات. حتى الآن كانت الصعوبة تحديد ثابت تفكك من منحنى معايرة. في هذه الدراسة، هو إدخال دالة رياضية الكامنة وراء منحنيات المعايرة. دون أي تقدير العائد تشبع رسومية عرضه للخطأ، تسمح هذه الخوارزمية معالجة البيانات الخام (كثافة إشارة بتركيزات مختلفة من يجند المضافة) مباشرة بواسطة التقييم الرياضية عن طريق الانحدار غير الخطي. وهكذا، يمكن تسجيلها في نفس الوقت عدة معايرة المنحنيات وتتحول إلى مجموعة من المعالم المميزة، بينها ثابت التفكك وتركيز مستقبلات ملزم-نشطة، وأنها يمكن تقييمها إحصائيا. عندما يتم دمجها مع هذه الخوارزمية، معايرة الساس كسب ميزة مباشرة عرض ثابت التفكك. ولذلك، يمكن استخدام أكثر كفاءة في المستقبل.
Introduction
ثابت تفكك ك معلمة رئيسية لوصف التقارب من مستقبل (R) لأن يجند (L). استناداً إلى قانون العمل الجماعي، تم تعريفه ك للتوازن، الذي ينأى RL معقدة يجند مستقبلات مستقبلات R ويجند l:
معادلة 1
مع الأرقام القياسية و التي تشير إلى الدولة الحرة/غير منضم من مستقبلات ويجند. تركيز المجمع مستقبلات-يجند RL، مطابق لتركيز مستقبلات زمنياً يجند لب. كما التركيز الكلي لمستقبلات آرتي هو مجموع مستقبلات الحرة Rو ويجند زمنياً مستقبلات صب = لب، كما يمكن كتابة ثابت التفكك ك:
المعادلة 2
لذلك، تحقق التشبع Y، تعرف بأنها الجزء من يجند منضم لب فيما يتعلق بالتركيز الكلي لمستقبلات آرتي،
المعادلة 3
يعتمد على تركيز يجند مجاناً لو:
المعادلة 4
يصف هذه العلاقة الزائدي المنحنى ملزمة تفاعل مستقبلات-يجند وعلى الأرض يظهر تركيز يجند منضم لب كدالة لتركيز يجند مجاناً لو. من منحنى ملزمة، يمكن اشتقاق ثابت تفكك ك كتركيز يجند مجاناً في الغلة تشبع النصف الأعلى. وعلاوة على ذلك، تم إنشاء خوارزميات مختلفة لينيريزي منحنيات الملزمة، مثل المؤامرة المزدوجة التبادلية كلوتز1،2، أو التحولات وفقا سكاتشارد أو ترفيهي [هنس] (استعرضها بيسوانجير3). ومع ذلك، كافة الخوارزميات يعانون من مشكلة أن الحد الأقصى لقيمة المحصول التشبع، الذي اقترب من شكل مقارب بتركيزات عالية من يجند مجاناً في منحنى ملزمة، يجب أن يكون المقدر في تقييم ما قبل رسومية وبالتالي عرضه للخطأ.
وبالإضافة إلى ذلك، تحديد منحنى ملزم يتطلب التحديد الكمي ليجند حرة وغير المنضمة أثناء التوازن الملزم. وتحقيقا لهذه الغاية، قد يجند مجاناً فصلها من يجند مستقبلات زمنياً وكمياً. ولذلك، يلزم أن يجند ومستقبلات تختلف في خصائصها، مثل يجند غير البروتين بدلاً مستقبلات بروتين. إذا كان كلا الشريكين ملزم البروتينات، أنها يجب أن تكون مميزة في أحجامها، والرسوم، أو ميزات أخرى الجزيئية. ومع ذلك، التحديد الكمي لتركيزات يجند في النهج الملزمة الصغيرة مهمة صعبة. العلامات المشعة ليجند غالباً ما كانت اللازمة للكشف عن تركيز منخفض من يجند المنضم، خاصة إذا كانت كميات كبيرة من مستقبلات لم تكن متاحة أو بتكلفة معقولة. وعلاوة على ذلك، قد ننأى يجند مستقبلات زمنياً أثناء وبعد عزلة بشكل لا يستهان به. ومن ثم، أساليب معقدة، مثل التوازن هلام الترشيح4والتفريد الشعرية5نبض proteolysis6، مطالبون بالتحديد الكمي ليجند مستقبلات زمنياً وفصله من يجند مجاناً.
وعلى النقيض من هذه فحوصات ملزمة، لا تتطلب تجارب المعايرة فصل كمية من يجند حرة وغير المنضمة. وتحقيقا لهذه الغاية، مستقبل بتركيز ثابت هو معاير بتركيزات مختلفة من يجند المضافة. يجند منضم بالربط إلى المستقبلات، خاصية الفيزيائية التي يميزها من يجند حرة وقابلة للقياس من خلال، مثلاً، وقياس الضوء، فلوروميتري، أو الكشف عن الأجسام المضادة. وهكذا، إشارة S، والذي يتناسب مع التشبع تسفر عن ص وعليه أيضا إلى تركيز مستقبلات زمنياً يجند (لب)، يتم الكشف عن كدالة للتركيز الكلي ليجند المضافة (Lt). كل المعلمات وإشارة S والتركيز الكلي ليجند وأضاف كمياً بطريقة مباشرة وأسهل من تركيزات يجند حرة وغير المنضمة. وبخاصة، الكشف عن يجند مستقبلات زمنياً بمقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) يسمح بالحد حجم العينة إلى أدناه 100 ميليلتر وكذلك قياسات موازية لعدة يجند تركيزات في لوحات متعددة جيدا ميكروتيتير. في معايرة أليسا، مستقبل جسديا تمتز إلى لوحة ميكروتيتير في تركيز نفسه ومعاير مع يجند القابلة للذوبان. هي معطلة المستقبلات على سطح البلاستيك أساسا من الامتزاز مسعور. سطح تركيز مستقبلات المعطل تداولها يرتبط مع تركيز طلاء المستقبلات في علاقة غير خطية، يحتمل وفقا Langmuir´s امتزاز الايسوثرم7. بالإضافة إلى العدد الكلي للجزيئات الممتزة مستقبلات، حالة النشاط معلمة هامة أخرى لفحوصات المعايرة. فقط المعطل تداولها المستقبلات التي احتفظت بنشاط ملزم يجند وهي ذات الصلة للمقايسة المعايرة وتسهم في نهاية المطاف إلى التركيز الكلي ل مستقبلات نشاط البحث والتطويرt لفحص المعايرة، التي لا يمكن تحديدها مباشرة.
المواقع التي لا تغطيها مستقبلات المعطل تداولها على سطح البلاستيك، هم عرضه الجسميات البروتينات الأخرى، مثل يجند. الامتزاز المادية ليجند على مثل هذه المواقع سطح البلاستيك من شأنه أن يؤدي في إشارة مماثلة كما يجند مستقبلات زمنياً، ولكن بطريقة غير محددة. لتقليل هذه الإشارة غير محدد، مواقع سطح البلاستيك من ألواح ميكروتيتير التي قد لا تم المغلفة مع البروتين ولكن سيتم حظر مع ألبومين المصل البقري (BSA). ومع ذلك، لبعض فحوصات المعايرة مستقبلات-يجند، يمكن ملاحظة الإشارات الخلفية غير محدد. آنذاك، وغيرهم من أعوان حظر، يوصي توين 20، مثل حلاً الجيلاتين 0.2% أو 0.04 في المائة.
بعد ملزم المستقبلات، تتم إزالة يجند مجاناً بخطوتين الغسيل. يبقى يجند منضم مع المستقبلات، وهي معطلة على سطح البلاستيك من البئر microtiter، وعززت بشكل اختياري قبل التثبيت الكيميائي. للاحقة التساهمية الصليب-الربط بين يجند منضم ومستقبلات المعطل تداولها مع glutaraldehyde، يتم استبدال المادة العازلة تريس حبيس، دون أي تغيير في ربط يجند. تعطيل حبيس، على النقيض من تريس، لا جلوتارالديهيدي. الصليب-الربط التساهمي مع glutaraldehyde إصلاحات يجند منضم مع مستقبلات لها ويمنع الانفصال من خلال الخطوات اللاحقة الغسيل والحضانة. وهكذا، تفاعل مستقبلات-يجند مجمد كيميائيا وأوامر منحنى معايرة التي لا تتأثر بالخطوات اللاحقة للغسيل والحضانة. ومع ذلك، قد كيميائيا تعديل التثبيت glutaraldehyde يجند ومستقبلات بطريقة أن تفاعلها هو تخفيض أو إلغاء. وعلاوة على ذلك، قد تتغير تعديل [ابيتوبس] داخل يجند تقارب ملزم من جسم كشف، خاصة إذا كان يتم استخدام جسم [مونوكلونل] للتحديد الكمي ليجند منضم. ورغم أن أيا من هذه الآثار الضارة للتثبيت جلوتارالديهيدي يحدث في هذه المعايرة أليسا، يجب اختبار حساسية الاختبار نحو glutaraldehyde لكل تفاعل مستقبلات-يجند قبل تجربة المعايرة. بعد التثبيت، يتم إزالة glutaraldehyde الزائدة في ثلاث خطوات الغسيل مع المخزن المؤقت الذي يحتوي على تريس. تريس يحللها ألدهيد المجموعات المتبقية، التي قد نونسبيسيفيكالي تتفاعل مع كشف الأجسام المضادة في الخطوة اللاحقة.
هو كمياً مقدار يجند منضم مع الأضداد المرتبطة بالانزيم، التي تعطي إشارة أليسا مضوائيه س. هذا هو رسم مقابل تركيز ل يجند مجموعt إضافة لكل بئر. على الرغم من حيازتها أسهل، منحنى المعايرة ليست وظيفة القطعي خلافا للمنحنى ملزمة. وعلاوة على ذلك، فقد غير الواضح كيفية حساب ثابت تفكك ك من منحنى معايرة. على الرغم من أن الخوارزميات منحنيات المعايرة المكتسبة سبيكتروسكوبيكالي لينيريزي أفيد بشكل مستقل ستوكل8 و Heyn وويشيت9، أنها قصرت بسبب عدم اليقين على تقدير إشارة الحد الأقصى قيمة النهج العائد التشبع بتركيزات عالية من يجند المضافة.
هنا، موصوفة معايرة أليسا وخوارزميه انحدار غير خطي لاشتقاق ثابت تفكك ك تفاعلاً يجند مستقبلات من منحنى معايرة. ويتمثل هذا البروتوكول للتفاعل بين الكولاجين-ملزمة بالمجال من α2β1 إنتغرين مع مثبط ثعبان المستمدة من السم. إينتيجرينس هي جزيئات التصاق الخلية، التوسط المرسى للخلايا في المصفوفة خارج الخلية المحيطة أو10،الغشاء الكامنة وراء11. وعلاوة على ذلك، إينتيجرينس ينقل إشارات هامة بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية عن طريق تعيين إشارات جزيئات إضافية وتشكيل خلية جديدة العضيات، أدهيسوميس، عند الخلية-مصفوفة التفاعل12،13، 14-الكولاجين، يجند إنتغرين α2β1، هو البروتين الأكثر وفرة في جسم الإنسان وهو عنصر حاسم سقالات النسيج الضام15. التفاعل بين إنتغرين α2β1 والكولاجين هو توسط أ-المجال فرعية α2 إنتغرين. ويتضمن α2A إنتغرين-المجال الأيونات الموجبة ديفالينت، وهي مطلوبة من أجل ربط الكولاجين واستقرار هيكلها. يمكن بسهولة أنتجت ريكومبينانتلي في نظام تعبير بكتيرية البرية من نوع النموذج فضلا عن طفرات في المجال α2A، مثل تلك التي تم الاستعاضة عن بقايا يتعرض سطح Y216 جليكاين، ومعزولة عن طريق بهم اليغو-صاحب-العلامات مع نينتا عمود سوبيرفلوو مع الغسيل الكلوي لاحقة ضد تريس مخزنة المالحة (TBS؛ 50 مم تريس/HCl، درجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم) 2 مم مجكل2تحتوي على16. تم تحديد تركيزات بهم مع مقايسة حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) واختبارها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة التقليدية بهم بورتيس وملطخة بأخذ الرائعة R250 الأزرق.
التفاعل بين إنتغرين α2β1 والكولاجين محظور بواسطة ربط عنصر ثعبان السم، رهودوسيتين، من16،الممهد حفرة الأفعى (رهودوستوما كالوسيلاسما)17. يستخدم يجند القابلة لذوبان في هذه المعايرة أليسا، رهودوسيتين تمت تنقيته من النفط الخام السم كما هو موضح سابقا16. يذوب في المحلول الملحي مخزنة حبيس (ميزانيات؛ 10 ملم حبيس/هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم) ويتم تخزينها مجمدة عند-20 درجة مئوية. تركيزه كان يحددها اتفاق التعاون الأساسي وثبتت النقاء من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. كخصم، رهودوسيتين ليس فقط كتل الكولاجين ملزم إنتغرين A α2β1 المجال، ولكن أيضا استقرار المطابقة غير نشط من إنتغرين مما يحول دون أي إشارة من الكولاجين في الخلايا أو الصفائح الدموية18. أنها من الأهمية الطبية تحديد ثابت تفكك من رهودوسيتين مع هدفها مستقبلات وهكذا كشف عن الآلية الجزيئية والأدوية المحتملة مثلاً، كعامل أنتيثرومبوتيك. تحقيقا لهذه الغاية، معايرة أليسا توصف بما في ذلك في تقييمه، وهو ينطبق على ما يقرب من أي تفاعل مستقبلات-يجند مع stoichiometry تفاعل 1:1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الأسهم الحلول
- لتحضير 100 مل 10 x TBS درجة الحموضة 7.4 حل، حل ز 6.06 من تريس وز 8.77 من كلوريد الصوديوم في 90 مل مياه. وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 بحل HCl 37% وملء الحجم إلى 100 مل مع المياه. وتصفية الحل.
- لتحضير 100 مل 1 م حبيس/هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.4 الحل، حل ز 23.83 من حبيس في 90 مل مياه. وضبط ال pH إلى 7.4 مع 1.5 M هيدروكسيد الصوديوم وتعبئة الحجم إلى 100 مل بالمياه. وتصفية الحل.
- لتحضير 100 مل محلول كلوريد الصوديوم 5 م، حل ز 29.2 من كلوريد الصوديوم في 90 مل مياه. ملء الحجم إلى 100 مل مع المياه وتصفية الحل.
- لتحضير 100 مل من م 1 MgCl2 الحل، حل ز 20.33 مجكل2 · 6 ح2س في 90 مل مياه. ملء الحجم إلى 100 مل مع المياه وتصفية الحل.
- إعداد 5% الحرارة إبطال جيش صرب البوسنة في المياه، تزن 2.5 g لجيش صرب البوسنة (جزء الخامس، درجة الحموضة 7.0) في أنبوب 50 مل وحله في 45 مل مياه. ملء حل 50 مل مع المياه، والحرارة الحل في حمام مائي في 68 درجة مئوية 45 دقيقة بارد عليه في حمام الثلج وتخزينه في-20 درجة مئوية.
- إعداد المحلول glutaraldehyde 25%.
تنبيه: جلوتارالديهيدي هو ضار إذا ابتلع، والسمية بالاستنشاق، وتسبب الحروق. ارتداء الملابس الواقية، القفازات، وحماية العين/الوجه. - رفع antiserum الأرنب كما هو موضح سابقا19. عيار antiserum مصممة وفقا للبروتوكولات القياسية20.
- إعداد الأرانب المضادة الغلوبولين المناعي-الأجسام المضادة من الماعز مترافق مع الفوسفاتيز القلوية.
- لتحضير 100 مل من محلول جليكاين 0.1 م، حل ز 0.75 من جليكاين في 90 مل مياه. ضبط درجة الحموضة إلى 10.4 بمحلول هيدروكسيد الصوديوم 1.5 متر وملء الحجم إلى 100 مل مع المياه وتصفية الحل.
- لتحضير 100 مل من 0.5 متر الزنك (الثاني)-خلات الحل، حل 10.98 ز من الزنك (الثاني)-خلات · 2 ح2س في 90 مل مياه. ملء الحجم إلى 100 مل مع المياه وتصفية الحل.
- لتحضير 100 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم 1.5 متر، حل ز 6.0 من هيدروكسيد الصوديوم في 90 مل مياه. ملء الحجم إلى 100 مل مع المياه وتصفية الحل.
2-تجهيز المخازن المؤقتة وتعمل الحلول
- تمييع مل 5 من 10 x TBS الهيدروجيني 7.4، مع 45 مل منزوع الماء وإضافة 100 ميليلتر من حل الأسهم2 مجكل م 1. يبقيه في درجة حرارة الغرفة. TBS، الأس الهيدروجيني 7.4، 2 مم مجكل2 الحل للتثبيت المستقبلات والغسيل لوحة ميكروتيتير.
- تمييع 10 مل من 5% من الحرارة إبطال جيش صرب البوسنة في المياه و 5 مل من x TBS 10، الرقم الهيدروجيني 7.4 مع المياه إلى 50 مل. إضافة 100 ميليلتر مجكل م 12 حل الأسهم ومزيج الحل جيد. يبقيه على الجليد وتخزينها لتجارب أخرى في-20 درجة مئوية. ملاحظة أن 2.5 مل من 1% جيش صرب البوسنة في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2 مطلوبة لكل منحنى المعايرة.
- تمييع 2.5 مل 1 م هيبيس/هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.4 و 1.5 مل م 5 محلول كلوريد الصوديوم إلى 50 مل مع المياه، إضافة 100 ميليلتر م 1 MgCl2 الحل، ومزيج حلاً شاملا لإعداد 50 مل ميزانيات، درجة الحموضة 7.4: 50 مم هيبيس/هيدروكسيد الصوديوم ، 150 مم كلوريد الصوديوم.
- إضافة 5 ميليلتر مجكل م 12 حل الأسهم و 2 ميليلتر 0.5 M الزنك (الثاني)-خلات حل الأسهم إلى 5 مل م 0.1 جليكاين الحل، الأس الهيدروجيني 10.4 إعداد المخزن المؤقت الفوسفاتيز القلوي (AP) (0.1 M جليكاين الحل، الأس الهيدروجيني 10.4، 1 مم مجكل2، 0.2 مم Zn(II)-acetate).
3-تجميد المستقبلات (إنتغرين α2A-المجال) للوحة ميكروتيتير
- تمييع الحل الأسهم إنتغرين α2A-الملك في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2 لتركيز نهائي من 5 ميكروغرام/مل.
ملاحظة: حجم الحل الطلاء هو 650 ميليلتر لمنحنى معايرة واحدة تضم كذلك 12-صف من لوحة ميكروتيتير منطقة نصف. - ملء البئر كل صف على لوحة ميكروتيتير منطقة نصف مع 50 ميليلتر/بئر 5 ميكروغرام/مل طلاء الحل إنتغرين α2A-المجال (البرية من نوع أو متحولة). أداء كل صف المعايرة على الأقل في التكرارات (في هذا المثال كتوائم؛ انظر تخطيط لوحة ميكروتيتير في الشكل 1).
- ختم اللوحة مع إحباط أو إغلاقه بغطاء. اترك اللوحة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
4-غسل "الآبار المغلفة" من "لوحة مرتين" مع TBS، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2
- لإزالة مستقبلات القابلة للذوبان جيدا مع 50 ميليلتر من TBS، درجة الحموضة 7.4، 2 مم على الجزيئات التي لا معطلة على سطح البلاستيك من الامتزاز المادية وإزالة الحل الطلاء وملء كل مجكل2.
- إزالة الحل الغسيل. ضمان أن لا تصبح الآبار الجافة. ولذلك، لا اضغط لوحة ميكروتيتير على قطعة من قماش أنسجة لإزالة بقايا السائل. استخدام ماصة متعددة الخطوات أو ماصة متعدد القنوات لملء الآبار بسرعة.
- كرر هذه الخطوة الغسيل مرة واحدة.
5-منع مواقع الربط غير محدد
- إضافة 50 ميليلتر من حل جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2 لكل بئر.
- ختم الآبار بإحباط أو إغلاق مع غطاء.
- احتضان الآبار من أجل ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: أي من الخطوات الاحتضان هذا البروتوكول يمكن إجراء على منصة هزاز أو تهتز. ومع ذلك، هذا غير مطلوب، ولا يغير من نتائج التجربة.
6-إعداد صف تمييع المسلسل ليجند، رهودوسيتين
- يختلف تركيز ابدأ رهودوسيتين وعامل إضعاف إضعاف المسلسل، للحصول على مجموعة مناسبة من تركيزات يجند وتسجيل منحنى معايرة كامل مع إشارة الحد الأدنى والحد الأقصى. في هذه التجربة، توظف بتركيز ابدأ من 243 شمال البحر الأبيض المتوسط رهودوسيتين وعامل تخفيف من 2.3. تمييع الحل رهودوسيتين الأسهم إلى أعلى تركيز يجند صف تمييع المسلسل. لكل منحنى المعايرة مع عامل تخفيف من 2.3، إعداد ميليلتر 115 من 243 الحل رهودوسيتين شمال البحر الأبيض المتوسط (أي، 15,2 ميكروغرام/مل) في 1% جيش صرب البوسنة/تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2 في أنبوب اختبار #1.
- ملء ميليلتر 65 1% حل جيش صرب البوسنة في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2 في أنابيب الاختبار 10، المسمى #2 عن طريق #11.
- نقل 50 ميليلتر لتمييع رهودوسيتين من أنبوب اختبار #1 إلى أنبوب اختبار #2، مزيج من كلا الحلول (الحجم الإجمالي: 115 ميليلتر؛ وعامل التخفيف: 1:2. 3) تريتوريشن، ومن ثم نقل 50 ميليلتر من هذا الخليط في أنبوب اختبار #3، و ما إلى ذلك
- يستمر هذا التخفيف التسلسلي حتى أنبوب اختبار #11.
ملاحظة: وحدات التخزين في خطوات 6.1-6.4 تكفي لمنحنى معايرة واحدة. اضرب عدد replicates وحدات التخزين هذه. وفي هذه الحالة، تنفيذ ثمانية منحنيات المعايرة (توائم شكلين α2A-المجال) وإعداد وحدات التخزين التالية: 920 ميليلتر من محلول رهودوسيتين عند أعلى تركيز في أنبوب اختبار #1؛ 520 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2 لملء في كل من أنابيب الاختبار #2 إلى #11؛ و 400 ميليلتر من حجم نقل من أنبوب واحد للمرحلة التالية.
7-ملزم يجند (رهودوسيتين) بتركيزات مختلفة للمعطل تداولها مستقبلات (إنتغرين α2A-المجال)
- إزالة الحل حظر من آبار ميكروتيتير لوحة بخط فراغ.
- فور إضافة 50 ميليلتر من الحل رهودوسيتين في 1% جيش صرب البوسنة/تبس، درجة الحموضة 7.4/مجكل2 الحل من أنبوب اختبار #1 في آبار عمود 1، الحل لأنبوب اختبار #2 إلى آبار عمود 2،إلخ إضافة 50 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4 ، 2 مم مجكل2 (المخزن المؤقت لمنع وتخفيف) كعنصر تحكم خالية من يجند للآبار للعمود 12 (انظر تخطيط لوحة ميكروتيتير، الشكل 1).
- ختم الآبار بإحباط أو إغلاق مع غطاء.
- احتضان الآبار من أجل 1.5 ح في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-22 درجة مئوية).
8-غسل "الآبار من لوحة مرتين" مع ميزانيات، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2
- لإزالة الجزيئات يجند غير منضم، إزالة الحل الملزم وملء كل جيدا مع 50 ميليلتر من ميزانيات، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2. ثم، قم بإزالة الحل أغسل.
- العناية بأن الآبار لا تصبح جافة. ولذلك، لا اضغط لوحة ميكروتيتير على قطعة من قماش أنسجة لإزالة بقايا السائل. استخدام ماصة متعددة الخطوات أو ماصة متعدد القنوات لملء الآبار بسرعة.
- كرر هذه الخطوة الغسيل مرة واحدة.
9-إصلاح يجند مستقبلات زمنياً مع 2.5 ٪ Glutaraldehyde في ميزانيات، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2
- تعد حلاً 2.5 ٪ glutaraldehyde طازجة بخلط 1 جزء من الحل glutaraldehyde 25% و 9 أجزاء من ميزانيات، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2.
- ملء كل من لوحة ميكروتيتير جيدا مع 50 ميليلتر من الحل glutaraldehyde 2.5% في ميزانيات، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2. احتضان لوحة ميكروتيتير لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
10-غسل "آبار" لوحة ثلاث مرات مع 50 ميليلتر/بئر تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2
- لإزالة وإلغاء تنشيط glutaraldehyde الزائد، إزالة تثبيت الحل وملء كل جيدا مع 50 ميليلتر من TBS، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2. قم بإزالة الحل الغسيل.
ملاحظة: من أجل حل التثبيت التي تحتوي على جلوتارالديهيدي من لوحة ميكروتيتير في طبق وتجاهل حل التثبيت بعد ذلك تم إلغاء تنشيطه بزيادة متساوية في حجم تبس، درجة الحموضة 7.4. - العناية بأن الآبار لا تصبح جافة. ولذلك، لا اضغط لوحة ميكروتيتير على قطعة من قماش أنسجة لإزالة بقايا السائل. استخدام ماصة متعددة الخطوات أو ماصة متعدد القنوات لملء الآبار بسرعة.
- كرر هذه الخطوة الغسيل مرتين.
11-التحديد الكمي ليجند مستقبلات زمنياً من أليسا
- إضافة 50 ميليلتر/بئر الحل جسم الأولية في جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2. هو الحل الأساسي جسم antiserum أرنب المثارة ضد رهودوسيتين19، وتضعف 1:2,000 في جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2.
- احتضان لوحة ل 75-90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغسل جميع الآبار لصفيحة ثلاث مرات مع 50 ميليلتر/بئر تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2. غير مطلوب من القماش خلال ثلاث خطوات الغسيل، والتنصت على لوحة ميكروتيتير على أنسجة.
- إضافة 50 ميليلتر/بئر الحل جسم الثانوية في جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2. وتحقيقا لهذه الغاية، يضعف الجسم المضاد الثانوي، أرنب استهداف الغلوبولين المناعي الماعز الأجسام المضادة مترافق مع الفوسفاتيز القلوية، إلى 1:2,000 في جيش صرب البوسنة 1% في تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2. احتضان لوحة ل 75-90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تعد وكالة اسوشييتد برس في الكشف عن الحل بتذويب 5 ملغ قرص يحتوي على 4-نيتروفينيل فوسفات ثنائي الصوديوم الملح سداسي هيدرات (الركيزة الفوسفاتيز) في 5 مل من المخزن المؤقت AP (0.1 M جليكاين الحل، الأس الهيدروجيني 10.4، يحتوي على 1 MgCl2 و 0.2 مم Zn(II)-acetate).
- تغسل جميع الآبار من لوحة ثلاث مرات مع 50 ميليلتر/بئر تبس، درجة الحموضة 7.4، 2 مم مجكل2، مباشرة قبل تنفيذ الخطوة التالية. انقر على لوحة ميكروتيتير على قطعة من قماش أنسجة بعد آخر خطوة الغسيل لإزالة جميع آثار السائل.
- إضافة 50 ميليلتر/بئر الحل الكشف عن وكالة اسوشييتد برس إلى آبار لوحة ميكروتيتير. إضافة وكالة اسوشييتد برس في الكشف عن الحل فورا لجميع الآبار بدء عملية التحويل الانزيمية في نفس الوقت قدر الإمكان. ولذلك، استخدام ماصة متعدد القنوات.
- احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة حتى الحل في الآبار مع أعلى تركيز يجند بدوره الصفراء.
ملاحظة: قد تختلف فترة حضانة المرض بين 5 دقائق وح 1 اعتماداً على كثافة إشارة. - إيقاف تحويل الركازة الفوسفاتيز بإضافة 50 ميليلتر/جيدا من حل هيدروكسيد الصوديوم 1.5 متر. ترك مكانة لوحة لعدة دقائق لضمان خالية من الانتصارات خلط كل الحلول. تبرر فترة الحضانة نفسها في جميع الآبار، استخدام ماصة متعدد القنوات وإضافة 1.5 M هيدروكسيد الصوديوم بنفس الترتيب إضافة إلى الآبار للركيزة في الكشف عن وكالة اسوشييتد برس في خطوة 11.8.
- قياس الكثافة البصرية (OD) في 405 نانومتر لكل بئر بقارئ أليسا.
12-تقييم الإشارات المعايرة
- قم بفتح جدول البيانات الخام، وقيم405nm OD، مع Excel. كما يتم قراءة هذه القيم إشارة من منحنيات المعايرة في الصفوف، تبديل القيم إلى العمود والتسمية مع التركيزات ليجند المضافة في عمود آخر.
- قم بفتح المنشور جرافباد 5 (الإصدار 5.0). افتح ملف مشروع جديد في القائمة الرئيسية. اختر تنسيق س وص تحت البيانات الجديدة والرسم البياني. اختر الخيار Enter ونقطة واحدة لكل قيمة الأرض على المحور الصادي.
- نسخ العمودين، تركيز ليجند المضافة وإشارة الملف القيم (OD405nm ) من excel ولصقها في ورقة البيانات من "منظور جرافباد" ك X و Y قيم، على التوالي.
- فتح البرنامج الفرعي تحليل جرافباد المنشور 5 واختر الخيار الانحدار غير الخطية تحت س ص-التحليل. اختر معادلة المعرفة من قبل المستخدم واضغط على زر جديد لإنشاء معادلة جديدة.
- اكتب المعادلة منحنى المعايرة في الشكل: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X))/(2*R) سمين + + ب * س إلى الورقة قالب افتتح حديثا، مع Y يجري قيمة إشارة ق، س يجري تركيز يجند المضافة ل ، R يجري التركيز المعطل تداولها مستقبلات، ك أن ثابت تفكك، ويجري الخلفية ب المنحدر. تعريف القيود المناسبة، مثل ك > 0 و R > 0.
ملاحظة: هذه المعادلة هي المعادلة نفسها من المعادلة 9 بشكل مختلف. - تحليل القيم الموجودة في ورقة البيانات باختيار المعادلة المعرفة من قبل المستخدم الذي تم إنشاؤه حديثا. افتح الجدول مع القيم المحسوبة تقريب (K, RtSكحد أقصى، Sدقيقةوب) التي تظهر أسفل المقطع النتيجة على الجانب الأيسر من شاشة البرنامج.
ملاحظة: البرنامج يحدد معالم 5 باحتواء تكرارية من الانحدار غير الخطي فقط إذا كان منحنى المعايرة يتكون من نقاط البيانات على الأقل 5. - تقييم معلمات ك وارتي, Sكحد أقصى، Sدقيقة، وب لكل مجموعة من منحنيات المعايرة إحصائيا، وربط المعلمات بميزة معينة من المجموعة (يجند تحور أو تعديلها كيميائيا أو مستقبلات).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد أليسا قد وضعت، اللون الأصفر من الركازة المحولة الفوسفاتيز القلوية، الفقرة--نيتروفينولاتي، ويشير إلى أن إنقاص مقدار يجند رهودوسيتين منضم مع تناقص تركيزات رهودوسيتين المضافة من الأعمدة 1 إلى 11 (الشكل 1). وتظهر الآبار عديم اللون في آبار رهودوسيتين خالية في عمود 12 إشارة خلفية منخفضة.
مضوائيه الكمي في 405 نانومتر توفر البيانات التي يمكن تغذية مباشرة إلى برنامج تحليل، و باستخدام الانحدار غير الخطي و المعادلة 9، يقترب من البيانات الخام لكل صف المعايرة ويحسب إشارة S (أي ما يعادل OD 405nm) كدالة للتركيز الكلي لإضافة رهودوسيتين يجند Lt (الشكل 2). أربعة منحنيات المعايرة لكل نموذج مستقبلات (البرية من نوع ومتحولة) يتم استنساخه بدرجة عالية وتقريبا سوبيربوسي بعضها البعض. وعلى النقيض من هذا التباين داخل المجموعة منخفضة، هاتين المجموعتين من منحنيات المعايرة هي يفصل بوضوح عن بعضها البعض. تركيزات أعلى من يجند رهودوسيتين مطلوبة للربط إلى مجال α2A متحولة للحصول على إشارات قيم مماثلة لتلك التي في البرية من نوع النموذج. يوضح هذا التحول الصحيح من منحنيات المعايرة أن يجند المسخ لها صلة مخفضة ليجند. وهكذا، أن الطفرة التي أدخلت في مجال α2A يضعف ملزمة رهودوسيتين لأنها جزء من موقع المجال إنتغرين18ملزمة رهودوسيتين.
يمكن وصف منحنى المعايرة بمعلمات الخاصية 5: ثابت (ط) الانفصال ك، (ثانيا) تركيز المعطل تداولها، إشارات مستقبلات النشيطة بيولوجيا آرتي، (ثالثا) الحد الأقصى والحد الأدنى (الرابع) (Sكحد أقصى و Sدقيقة)، فضلا عن (الخامس ) منحدر الإشارات الخلفية باء من بين هذه المعايير، ثابت تفكك ك الأساسية والأكثر إلحاحا لتفسير منحنيات المعايرة البيولوجية. كل منحنى المعايرة يوفر قيمة واحدة ك. وهكذا، يمكن إحصائيا مقارنة منحنيات المعايرة واحد وأيضا مجمعة مع بعضها البعض. ويرد مثل هذا تحليل الإحصائي لأربعة منحنيات المعايرة في البرية من النوع ومجال α2A تحور في الشكل 3. ثابت النسب لربط رهودوسيتين إلى البرية من نوع α2A-المجال هو 5.80 ± 0.15 شمال البحر الأبيض المتوسط، في حين رهودوسيتين بربط مستقبلات تحور مع تقارب أدنى بكثير من شمال البحر الأبيض المتوسط ± 0.18 9.68 (ف < 0.0001).
وهكذا، يسمح المعايرة أليسا جنبا إلى جنب مع هذا التقييم الرياضية إجراء تقييم سريع وسليم إحصائيا ليجند ملزمة لمستقبل ومشتقاته تحور أو معدلة كيميائيا. ولذلك، معايرة أليسا وتقييم الخوارزمية أدوات قيمة لتحليل العلاقات بنية الدالة.
رقم 1: تخطيط الممثل من لوحة ميكروتيتير لمعايرة إليزا. يوفر كل صف البيانات لمنحنى معايرة واحدة. لمقارنة هذه الملزمة ليجند رهودوسيتين (اتفاقية روتردام)، هي معطلة البرية من نوع (الصفوف أ-د) أو شكل المسخ (صفوف ه-ح) α2A-المجال في الآبار من أربعة صفوف كل (تصميم كوادروبليت). الخط الأفقي دوت يفصل بين هاتين المجموعتين من منحنيات المعايرة. يقلل تركيز يجند رهودوسيتين من العمود 1 إلى 11، بينما الآبار العمود 12، المشار إليه على الجانب الأيمن من الخط العمودي دوت، لا تحتوي على أي رهودوسيتين وتمثل خلفية عنصر التحكم. يتم عرض اللوحة بعد يجند المنضم هو كمياً بإليزا التي يتم تحويل الركازة الفوسفاتيز القلوية إلى الأصفر الفقرة--نيتروفينولاتي. وترد البيانات من واحدة من أصل ثلاث تجارب متكررة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: منحنيات المعايرة الممثل. البيانات الخام للمعايرة معطلة البرية من نوع وأشكال المسخ إنتغرين α2A-المجال مع رهودوسيتين كما يجند القابلة للذوبان (رموز)، فضلا عن منحنيات المعايرة التقريبي (خطوط) ترد في مؤامرة شبه لوغاريتمي. يتم إظهار البيانات الخام لقرارات كوادروبليت (دوائر، مثلثات صعودا وهبوطاً، والمربعات لكل من أربعة صفوف معايرة) المعطل تداولها البرية من نوع (الرموز مفتوحة) والمتحولة (رموز شغلها) α2A-مستقبلات. تظهر منحنيات المعايرة المحسوب كخطوط (متقطع الصلبة، قصيرة، منقط، سلسلة منقط) البرية من نوع (خطوط سوداء) وشكل المسخ (الخطوط الرمادية) المستقبلات. سوبيربوسي أربعة منحنيات المعايرة داخل كل من هاتين المجموعتين (نوع البرية ومستقبلات متحولة)، بينما تختلف منحنيات المعايرة وضوح بين المجموعتين. يتم إزاحة منحنيات المعايرة مجال α2A متحولة إلى أعلى تركيزات رهودوسيتين مشيراً إلى أن رهودوسيتين بربط مع تقارب أدنى إلى مستقبلات تحور. وترد البيانات من واحدة من أصل ثلاث تجارب متكررة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مقارنة إحصائية للانفصال من ثوابت K المستمدة من منحنيات المعايرة.
ثوابت ديسوسييشنز منحنيات المعايرة ثمانية من الشكل 2 المرسومة ومجمعة على شكل المجال α2A البرية من نوع والمسخ. القيم الفردية ومجموعة الوسائل والانحرافات المعيارية المبين بالنقاط والخطوط السوداء المتقطعة، وأشرطة الخطأ الرمادية، على التوالي. يعني الفرق الصغيرة داخل كل مجموعة، وفرق واضح بين المجموعة إظهار فرقا كبيرا (ف < 0.0001) في التقارب من يجند لنوع البرية ومستقبلات المسخ. Student´s ثنائي الطرف تي-تم استخدام اختبار للمقارنة. وترد البيانات من واحدة من أصل ثلاث تجارب متكررة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أليسا المعايرة نظام اختبار متعددة لتحديد الانفصال من تفاعل مستقبلات-يجند. المعايرة تلتف أليسا ضرورة لفصل يغاندس الحرة وهي مقيدة فعلياً وتحليل تركزاتها كمياً، أكثر بكثير من الدراسات والمنشورات استخدمت معايرة الساس بدلاً من تسجيل منحنيات ملزمة . وعلاوة على ذلك، معايرة اليساس سهلة لأداء وتتطلب كميات منخفضة إلى حد معقول من مستقبلات ويجند. للحصول على تحليل دقيق لثوابت التفكك، يجب استخدام التحضيرات نقية من مستقبلات ويجند. تلويث البروتينات داخل إعداد مستقبلات تتنافس مع مستقبلات لمواقع الامتزاز على سطح البلاستيك من لوحة ميكروتيتير. كما أنها لا تربط يجند ولكن تخفيض عدد مستقبلات ملزم يجند، تقليل شوائب الحل مستقبلات إشارات المعايرة أليسا. إذا كان لا يمكن تحسينها نقاء إعداد مستقبلات أي علاوة على ذلك، جسم مضاد ضد مستقبلات يمكن أن تكون معطلة للوحة ميكروتيتير، وبعد تجميد الآبار، وسوف التقاط المستقبلات من إعداد التي تحتوي على شوائب. ومع ذلك، يجب الحرص حيث أن جسم الالتقاط لا يعوق كشف يجند منضم مع الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي بسبب تداخلات الأنواع من الأجسام المضادة، أو أن ذلك يعوق ملزم يجند.
للحصول على مجموعة شاملة من البيانات، هو تقدير لإجراء المعايرة أليسا بطريقة متبادلة، الذي هو استخدام يجند القابلة للذوبان من تجربة واحدة المستقبلات في تجربة أخرى بشل من لوحة ميكروتيتير وتيتراتي مع مستقبلات السابقة التي سيتم تطبيقها كشريك يجند القابلة للذوبان. وعادة ما يعمل هذا جيدا ما لم يحللها تجميد النشاط ملزمة لأحد الشركاء، أو ما لم تكن أدوات، مثل الأجسام المضادة للكشف عن شريك معاير، غير موجود، أو من الصعب الحصول على. في نظام ملزم المجال رهودوسيتين-α2A، هذا وعملت جيدا بعد الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (GST)-كانت تنصهر moiety إلى α2A-المجال لتسهيل الكشف عنها مع الأجسام المضادة GST16.
ميزة أخرى للمعايرة أليسا هو إلا أن التركيز ليجند المضافة (Lt) ولكن لا يجند حرة وغير المنضمة (لو ولب، على التوالي)، يحتاج إلى أن يكون معروفا. ولذلك، ينبغي أن يكون إعداد يجند نظيفة قدر الإمكان. إذا كان هذا من المستحيل أو تحدد عمليا إلا بقدر محدود، المعايرة أليسا يمكن لا يزال استخدامها، بعد أن كانت نسبة المولى ليجند داخل الإعداد بشكل مستقل، مثلاً، من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أو إيمونوبلوتينج أو ساندويتش أليسا.
قد تحدث مشكلات مع المعايرة أليسا إذا تقارب بين مستقبلات ويجند منخفض جداً أو إذا كان التثبيت glutaraldehyde يلغي التفاعل ملزمة. في هذه الحالة الأخيرة، يلزم بروتوكول المعايرة أليسا خالية من التثبيت إنشاء. عمليا، ثوابت تفكك يمكن فقط اكتشاف إذا كان الشركاء ملزمة في التفاعل مع تقارب مرتفعة بشكل معقول، وفي النطاق أدناه ما يقرب من 200 نانومتر.
يوفر المعايرة كثافات إشارة S كدالة للتركيزات الإجمالية ليجند المضافة، لt. تركيزات يغاندس حرة وغير منضم، لو ولب، وخلاصة للأمر، وكما لب يساوي نتاج Y· آرتي وفقا المعادلة 3، 4 المعادلة تتحول إلى:
المعادلة 5
أسفر عن معادلة تربيعية،
معادلة 6
هو الحل العملي الذي،
المعادلة 7
وبالإضافة إلى ذلك، يمثل كثافة إشارة S (Lt) بتركيز محدد ليجند وأضاف لامتي العائد تشبع Y، بعد أن تم تصحيحه بطرح قيمة إشارة الحد الأدنى, Sدقيقة، وتطبيع للنطاق الديناميكي ، نظراً للفرق بين القيم إشارة الحد الأقصى والحد الأدنى، Sكحد أقصى و Sدقيقة:
المعادلة 8
المزيج من المعادلة 7 و 8 معادلة غلة الدالة الرياضية التي يرتبط كثافة إشارة S (Lt) مع تركيز يجند المضافة لt. فترة B· يمكن إضافة لt لوصف الإشارات الخلفية غير محدد مما يثير خطيا مع لt. ب هو ثابت التناسب للخلفية. وهكذا، وظيفة عامة لوصف منحنى معايرة:
المعادلة 9
هذه الدالة من منحنى المعايرة يتوافق مع دالة تتألف مع مصطلح جذر التربيعي ومصطلح خطية، التي تصف تفاعل معينة المستقبلات ويجند والتفاعلات غير محدد ليجند، على التوالي. هذه الوظيفة يختلف عن الدالة الذائدية المنحنى ملزمة (Lإس. Lf).
على النقيض من المنحنى ملزمة، فيها تركيزات يجند منضم المرسومة على المحور الصادي، منحنى المعايرة أكثر مرونة ويسمح أي إشارة، الذي يرتبط مع تركيز يجند ملزمة، لتكون المرسومة على المحور الصادي. هذه الإشارات يمكن أن تكون ملزمة التغيرية المكتشفة من جسم المرتبط بالانزيم (كما هو الحال في هذه القضية إليزا)، ولكن يمكن أن يكون أيضا إشارات والمطيافيه أخرى، مثل تغيير في امتصاص، تلوانيه التعميم9، استقطاب الفلورية21 ، وإشارات الرنين المغناطيسي النووي22. وعلاوة على ذلك، أيضا الإشارات الحرارية من معايرة متحاور القياس23 ينبغي التمكن من تقييم. دراسات أخرى تقارب ملزم من الحركية على تحديد وإيقاف معدلات لتكوين وتفكك من مجمع مستقبلات-يجند بقياس التغيرات في الوقت الحقيقي في الميدان زائل عن طريق السطحي مأكل مثل الطحين الرنين24،25 , في كتلة الترسب بلورة الكوارتز ميكروبالانسي26، أو في الأسفار بعبارة ثيرموفوريسيس26،27. أصبحت هذه القياسات في الوقت الحقيقي أدوات قوية بسبب البرامج المتطورة التقييم الخاصة بهم. معايرة أليسا وموارد البرنامج الخاصة بصفة عامة الأسلوب المفضل لدراسة ربط الشركاء في تحليل البروتين والكيميائية. بينما المعايرة أليسا تدابير ثابتة تقارب [ثرمودنميكلي] بالتحديد الكمي لمقدار يجند منضم في توازن مختلف الدول، موارد البرنامج الخاصة تستخدم نهجاً حركية وتقرب الثوابت معدل الحركية، كقبالة وكفي ، نسبة الذي يوفر الانفصال كينيتيكالي العزم ثابت24،25. اعتماداً على نهجين مختلفين، قد تختلف قيم K من بعضها البعض. في التجارب ملزمة المجال رهودوسيتين-α2A، كشفت البيانات موارد البرنامج الخاصة kإيقاف و kعلى معدل الثوابت، وبالتالي كينيتيكالي تحديد ثابت تقارب ك، ل مجمع رهودوسيتين-α2A19، التي تتشابه إلى حد كالقيم التي تقاس في هذه الدراسة بمعايرة أليسا. يمكن تفسير الاختلافات الطفيفة بتغيرات النشاط من دفعات مختلفة أو ظروف مختلفة والمدد الزمنية لتخزين عينات البروتين. في هذا الصدد في وقت لاحق، في المعايرة أليسا جميع العينات تقاس في نفس الوقت ولا التتابع مثل في الجهاز موارد البرنامج الخاصة. الآن، يجري رياضيا ميسرة وسهلة لإدارة مع معادلة منحنى المعايرة (9 المعادلة)، قد يصبح هذا القياس نقطة نهاية المعايرة أليسا فقط قوية كما كينيتيكالي تقييم القياسات في الوقت الحقيقي، الذي يتطلب جهاز موارد البرنامج الخاصة باهظة تكلفة.
هذه المعادلة تأخذ في الحسبان أن يتم تقليل التركيز الكلي ليجند بتركيز يجند منضم، لا سيما بتركيزات منخفضة [ليغند]. وهذا ما يسمح كثير تقريبية أفضل من منحنى المعايرة للبيانات عبر النطاق الكامل لتركيزات يجند. عيب واحد من المعايرة أليسا، بالمقارنة مع منحنى ملزمة، حتى الآن إلى صعوبة تقييم رياضيا منحنى المعايرة. بينما في منحنى ملزمة تركيز يجند مجاناً ل يساويf في النصف الأعلى تشبع ثابت التفكك، وهذا لا ينطبق على منحنى معايرة. وقد وضعت اثنين من خوارزميات بشكل مستقل لينيريزي بيانيا منحنيات المعايرة وتحديد ثابت التفكك. ومع ذلك، كلا خوارزميات لتجارب المعايرة الطيفية التي وضعتها ستوكيل et al. 8 وقبل Heyn & ويشيت9 تعاني من عيب أنه يجب تحديد إشارة الحد الأقصى للعائد تشبع Y بيانيا. مع اقتراب هذه القيمة هو مقارب، العائد تشبع وبالتالي ثابت تفكك المحسوبة هي جوهريا عرضه للخطأ. وفي المقابل، خوارزمية استناداً إلى معادلة 9 يستخدم البيانات الخام من تجارب المعايرة ويحسب ثابت تفكك ك، فضلا عن غيرها من المعالم في انحدار غير خطي العثور على حل أفضل احتواء (الشكل 2 والشكل 3 ). وعلاوة على ذلك، كما لا تحتاج هذه الخوارزمية لتقدير بيانيا إشارة الحد الأقصى ربما تصل إلى الخارج في تشبع يجند، عملية التقييم يصبح أسرع بكثير ودقيقة وأنه يحمل تحيز أقل من تقييم رسومية. ويمكن تقييم عدة منحنيات المعايرة بالتوازي. وهكذا، يمكن قياس عدة مجموعات من منحنيات المعايرة في الوقت نفسه، والمعلمات الخاصة بهم يمكن تحليلها إحصائيا ومقارنة. وعلاوة على ذلك، يعطي كل منحنى المعايرة على مجموعة من القيم، وبين لهم ثابت تفكك ك، تركيز مستقبلات المعطل تداولها والملزمة-نشطة آرتي، النطاق الديناميكي كالفرق بين الحد الأقصى والحد الأدنى من إشارة القيم Sكحد أقصى وقدقيقة ، فضلا عن إضافة عامل الخطي ب الذي يتوافق مع إشارة خلفية تجريبية باستخدام هذه القيم، تشبع العائد يمكن حسابها Y والمرسومة في الاعتماد على تركيز يجند لt. في مثل هذا إشباع غلة مؤامرة، تركيز يجند المضافة عند إشارة تشبع النصف الأعلى Lt(50%) يساوي مجموع ثابت تفكك K بالإضافة إلى نصف تركيز مستقبلات النشطة المعطل تداولها آرتي
معادلة 10
هذا يمكن أن يستمد من أجل Y = 0.5 مع 7 المعادلة. وهكذا، يمكن تحديد تركيز مستقبلات النشطة المعطل تداولها آرتي عن طريق إجراء المعايرة أليسا بتركيزات مختلفة طلاء المستقبلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.
Acknowledgments
البروتوكول والخوارزمية وضعت ضمن مشروع ممول من الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG منحة SFB1009 A09 و EB177/13-1). بفضل مقدم البلاغ باربرا شيدينج وفيلكس شمالبين للدعم الفني والدكتور نيلاند للغاية قراءة المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIS | neoFrox | 1125KG001 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Applichem | 1,316,591,214 | |
| MgCl2 | Merck | 172571 | |
| integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant | isolated in author's lab | ||
| NiNTA superflow column | Qiagen, Germany | 30821 | |
| Coomassie-Brilliant Blue R250 | Serva | 35050 | |
| bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit | Fisher Scientific | 23225 | |
| bovine serum albumine (BSA), fraction V | Applichem | A1391 | |
| 25 % solution of glutaraldehyde | Merck | 354400 | |
| anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | A9919 | |
| Glycine | Applichem | A1377 | |
| Zn(II)-acetate | Applichem | A4324 | |
| NaOH | Applichem | A1551 | |
| Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg) | Sigma-Aldrich | S0942 | |
| Costar half-area microtiter plate | Thermo Scientific | Corning 3690 | |
| micro reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Microplate ELISA reader | BioTek | Synergy HT |
References
- Klotz, I. M. The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium. Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).
- Klotz, I. M. Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept. J Biol Chem. 279 (1), 1-12 (2004).
- Bisswanger, H. Ch. 1: Multiple Equilibria, Principles and Derivations. Enzyme Kinetics: Principles and Methods. , Wiley VCH Verlag GmbH. 1-26 (2017).
- Shimura, K., Kasai, K. Affinity gel titration: quantitative analysis of the binding equilibrium between immobilized protein and free ligand by a continuous titration procedure. Anal Biochem. 149 (2), 369-378 (1985).
- Gong, M., Nikcevic, I., Wehmeyer, K. R., Limbach, P. A., Heineman, W. R. Protein-aptamer binding studies using microchip affinity capillary electrophoresis. Electrophoresis. 29 (7), 1415-1422 (2008).
- Hanes, M. S., Ratcliff, K., Marqusee, S., Handel, T. M. Protein-protein binding affinities by pulse proteolysis: application to TEM-1/BLIP protein complexes. Protein Sci. 19 (10), 1996-2000 (2010).
- Latour, R. A. The Langmuir isotherm: a commonly applied but misleading approach for the analysis of protein adsorption behavior. J Biomed Mater Res A. 103 (3), 949-958 (2015).
- Stockell, A. The binding of diphosphopyridine nucleotide by yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Biol Chem. 234 (5), 1286-1292 (1959).
- Heyn, M. P., Weischet, W. O. Circular dichroism and fluorescence studies on the binding of ligands to the α subunit of tryptophan synthase. Biochem. 14 (13), 2962-2968 (1975).
- Campbell, I. D., Humphries, M. J. Integrin structure, activation, and interactions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (3), (2011).
- Zeltz, C., Gullberg, D. The integrin-collagen connection--a glue for tissue repair? J Cell Sci. 129 (4), 653-664 (2016).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468 (7323), 580-584 (2010).
- Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annu Rev Immunol. 25, 619-647 (2007).
- Luo, B. H., Springer, T. A. Integrin structures and conformational signaling. Curr Opin Cell Biol. 18 (5), 579-586 (2006).
- Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978 (2011).
- Eble, J. A., Tuckwell, D. S. The α2β1 integrin inhibitor rhodocetin binds to the A-domain of the integrin α2 subunit proximal to the collagen-binding site. Biochem J. 376 (Pt 1), 77-85 (2003).
- Eble, J. A., et al. The α2β1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a cruciform, heterotetrameric molecule. FASEB J. 23 (9), 2917-2927 (2009).
- Eble, J. A., et al. Dramatic and concerted conformational changes enable rhodocetin to block α2β1 integrin selectively. PLoS Biol. 15 (7), e2001492 (2017).
- Bracht, T., Figueiredo de Rezende, F., Stetefeld, J., Sorokin, L. M., Eble, J. A. Monoclonal antibodies reveal the alteration of the rhodocetin structure upon α2β1 integrin binding. Biochem J. 440 (1), 1-11 (2011).
- Harlow, E., Lane, D. Chapter 5: Immunizations. Antibodies, a laboratory manual. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. 53-138 (1988).
- Lu, D. Analyzing interactions between SSB and proteins by the use of fluorescence anisotropy. Methods Mol Biol. 922, 155-159 (2012).
- Fielding, L. NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants. Curr Top Med Chem. 3 (1), 39-53 (2003).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr Opin Struct Biol. 11 (5), 560-566 (2001).
- McDonnell, J. M. Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 572-577 (2001).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), 54-61 (2000).
- Pesquero, N. C., et al. Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique. Biosens Bioelectron. 26 (1), 36-42 (2010).
- Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data. Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).
