Titration ELISA als eine Methode zur Bestimmung der Dissoziationskonstante Rezeptor Liganden Interaktion

Summary

Ein detailliertes Protokoll, eine Titrierung ELISA durchzuführen wird beschrieben. Darüber hinaus wird ein neuartiger Algorithmus, Titration ELISAs zu bewerten und zu einer Dissoziationskonstante Bindung eines lösliche Liganden an einen Mikrotiter Platte immobilisiert Rezeptor präsentiert.

Abstract

Die Dissoziationskonstante beschreibt die Wechselwirkung zwischen zwei Partnern in das verbindliche Gleichgewicht und ist ein Maß für die Affinität. Es ist ein entscheidender Parameter verschiedener Liganden, z.B., wettbewerbsfähige Inhibitoren, Protein-Isoformen und Mutanten, für ihre Bindungsstärke an einen Bindungspartner zu vergleichen. Dissoziation-Konstanten werden durch Konzentrationen von gebundenen gegenüber freien Liganden als verbindliche Kurven Plotten bestimmt. Im Gegensatz dazu sind Titrierung Kurven, in denen ein Signal, das proportional zur Konzentration des gebundenen Liganden ist gegen die Gesamtkonzentration an zusätzlichen Liganden geplottet wird leichter zu erfassen. Das Signal kann spektroskopisch und durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) erkannt werden. Dies wird in einem Protokoll für eine Titration ELISA illustriert, die die Bindung von der Schlange Venom-abgeleitete Rhodocetin in seiner immobilisierten Zieldomäne Integrin α2β1 misst. Titration ELISAs sind vielfältig und weit verbreitet. Jedes Paar von interagierenden Proteine können als immobilisierte Rezeptor und lösliche Liganden verwendet werden, vorausgesetzt, dass beide Proteine rein sind, und deren Konzentrationen sind bekannt. Die Schwierigkeit war bisher die Dissoziationskonstante aus einer Titration-Kurve zu bestimmen. In dieser Studie wird eine mathematische Funktion, die zugrunde liegenden Titrierung Kurven eingeführt. Ohne keine fehleranfällige grafische Schätzung einer Sättigung Rendite ermöglicht dieser Algorithmus Verarbeitung der Rohdaten (Signalintensitäten bei verschiedenen Konzentrationen von zusätzlichen Liganden) direkt durch mathematische Auswertung über eine nichtlineare Regression. So mehrere Titrierung Kurven können gleichzeitig aufgenommen und umgewandelt in eine Reihe von charakteristischen Parameter, darunter die Dissoziationskonstante und die Konzentration der Bindung-aktiv-Rezeptor, und sie können statistisch ausgewertet werden. In Kombination mit diesem Algorithmus Titration ELISAs profitieren die Dissoziationskonstante direkt zu präsentieren. Daher können sie in Zukunft effizienter genutzt werden.

Introduction

Die Dissoziationskonstante K ist ein wichtiger Parameter, die Affinität eines Rezeptors (R) für seine Liganden (L) zu beschreiben. Basierend auf dem Gesetz der Masse, wird K für das Gleichgewicht definiert in denen die Rezeptor-Ligand-komplexen RL in den R-Rezeptor und Ligand L: distanziert sich

            Gleichung 1

mit den Indizes f , die frei/ungebundenen Zustand von Rezeptor und Ligand. Die Konzentration der Rezeptor-Ligand-Komplex, RL, ist identisch mit der Konzentration der Rezeptor-gebundenen Liganden Lb. Da die Gesamtkonzentration an Rezeptor Rt die Summe der freien Rezeptor Rf und Liganden gebundenes Rezeptor Rb ist = Lb, die Dissoziationskonstante kann auch als geschrieben werden:

        Gleichung 2

Daher die Sättigung Ertrag Y, definiert als der Anteil der gebundenen Liganden Lb im Verhältnis der Konzentration des Rezeptors Rt,

        Gleichung 3

hängt von der Konzentration der freien Liganden Lf:

        Gleichung 4

Diese hyperbolische Beziehung beschreibt die verbindliche Kurve ein Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen und die Handlung zeigt die Konzentration der gebundenen Liganden Lb als eine Funktion der Konzentration der freien Liganden Lf. Die verbindliche Kurve kann die Dissoziationskonstante K als die Konzentration des freien Liganden mit Hälfte-maximale Sättigung Rendite ableiten. Darüber hinaus wurden verschiedene Algorithmen zur Bindung Kurven zu linearisieren, wie die doppelt-reziproke Handlung von Klotz^1,2, oder Transformationen nach Scatchard oder Hanes (rezensiert von Bisswanger³) eingerichtet. Alle Algorithmen leiden jedoch das Problem, das der maximale Wert der Sättigung-Ausbeute, die asymptotisch bei hohen Konzentrationen an freien Liganden in der Bindung Kurve nähert, hat in eine grafische Vorauswertung geschätzt werden und ist daher fehleranfällig.

Darüber hinaus erfordert die Bestimmung einer verbindlichen Kurve die Quantifizierung der freien und gebundenen Liganden während der Bindung Gleichgewicht. Zu diesem Zweck hat die freie Liganden von Rezeptor-gebundenen Liganden getrennt und quantifiziert werden. Daher müssen die Ligand und Rezeptor unterscheiden sich in ihren Eigenschaften, wie ein nicht-Protein-Ligand im Gegensatz zu einem Protein-Rezeptor. Wenn beide Bindungspartner Proteine sind, haben sie in ihrer Größe, Gebühren oder andere molekulare Eigenschaften unterscheiden. Dennoch ist die Quantifizierung der Liganden-Konzentrationen im kleinen verbindliche Ansätze eine schwierige Aufgabe. Radioaktive Markierung des Liganden ist oft notwendig sein, die geringe Konzentration von gebundenen Liganden zu erkennen gewesen, vor allem dann, wenn erhebliche Mengen an Rezeptoren nicht verfügbar oder erschwinglich waren. Darüber hinaus kann die Rezeptor-gebundenen Liganden während und nach der Isolierung in gewissem Sinne nicht zu vernachlässigenden distanzieren. Daher müssen komplexe Methoden, z. B. Gleichgewicht Gel Filtration⁴Kapillarelektrophorese⁵und Puls Proteolyse⁶, Rezeptor-gebundenen Liganden zu quantifizieren und trennen Sie ihn vom freien Liganden.

Im Gegensatz zu diesen verbindlichen Assays erfordern Titration Experimente nicht die quantitative Trennung von freien und gebundenen Liganden. Zu diesem Zweck ist ein Rezeptor auf eine konstante Konzentration mit verschiedenen Konzentrationen von zusätzlichen Liganden titriert. Durch die Bindung an den Rezeptor hat der gebundene Liganden eine biophysikalische Eigenschaft unterscheidet sie von den kostenlosen Liganden und ist messbar, z.B., Photometrie, Fluorometry oder Antikörpernachweis. So ein Signal S, die proportional zur Sättigung ist Ausbeute Y und folglich auch auf die Konzentration der Rezeptor-gebundenen Liganden (Lb) wird erkannt als Funktion der Gesamtkonzentration an zusätzlichen Liganden (Lt). Beide Parameter, das Signal S und die Gesamtkonzentration an zusätzlichen Liganden sind in gewissem Sinne direkter und einfacher als die Konzentrationen der freien und gebundenen Liganden quantifiziert. Vor allem, die Erkennung von Rezeptor-gebundenen Liganden durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) erlaubt die Reduktion von unter 100 µL Probenvolumen sowie parallele Messungen von mehreren Liganden-Konzentrationen in Multi-gut Mikrotiter-Platten. In eine Titrierung ELISA ist ein Rezeptor physisch zu einer Mikrotiterplatte in der gleichen Konzentration adsorbiert und titriert mit lösliche Liganden. Der Rezeptor wird im Wesentlichen durch hydrophobe Adsorption auf der Kunststoffoberfläche immobilisiert. Die Oberflächenkonzentration der immobilisierten Rezeptor korreliert mit der Beschichtung Konzentration des Rezeptors in eine nicht-lineare Beziehung, wahrscheinlich nach Langmuir´s Adsorption Isotherm⁷. Neben der Gesamtzahl der adsorbierten Rezeptormoleküle ist ihren Aktivitätszustand ein weiterer wichtiger Parameter für die Titration Assays. Nur immobilisiert Rezeptoren, die Liganden Bindung Aktivität bewahrt haben, sind relevant für die Titration-Assay und schließlich dazu beitragen, die Gesamtkonzentration der aktiven Rezeptoren Rt die Titration-Assays, die nicht direkt ermittelt werden kann.

Websites auf der Kunststoffoberfläche, die nicht durch die immobilisierten Rezeptor fallen sind anfällig für andere Proteine, wie z. B. die Liganden adsorbieren. Physikalische Adsorption des Liganden zu solchen Kunststoff Oberfläche Seiten würde in ein ähnliches Signal wie der Rezeptor-gebundenen Liganden und dennoch in einer unspezifischen Weise führen. Dieses unspezifische Signal Kunststoff Oberfläche Stätten der Mikrotiter-Platten zu reduzieren, die haben nicht mit Protein beschichtet wurden noch mit Rinderserumalbumin (BSA) blockiert werden. Jedoch können für einige Rezeptor-Ligand-Titration-Assays, unspezifischen Hintergrund Signale beobachtet werden. Dann, andere Blockern, wie eine Lösung von 0,2 % Gelatine oder von 0,04 % Tween 20, werden empfohlen.

Nach der Bindung an den Rezeptor, wird die freie Liganden durch zwei Waschschritte entfernt. Gebundenen Liganden bleibt mit dem Rezeptor, die auf die Kunststoffoberfläche des Brunnens Mikrotiter immobilisiert, und optional durch chemische Fixierung verstärkt. Für die anschließende kovalente Vernetzung von gebundenen Liganden und immobilisierten Rezeptor mit Glutaraldehyd ist die Puffer Substanz TRIS HEPES, ohne Änderung der Liganden Bindung ersetzt. HEPES, im Gegensatz zu TRIS, nicht Glutaraldehyd inaktivieren. Die kovalente Vernetzung mit Glutaraldehyd behebt die gebundenen Liganden mit seinen Rezeptor und verhindert seine Dissoziation bei Wasch- und Inkubation Folgeschritte. So die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen ist chemisch fixiert und gewährleistet eine Titration-Kurve, die von nachfolgenden Schritte des Waschens und Inkubation nicht betroffen ist. Glutaraldehyd Fixierung kann jedoch chemisch ändern, der Ligand und Rezeptor derart, dass ihre Interaktion reduziert oder abgeschafft ist. Modifikation von Epitopen innerhalb der Liganden kann darüber hinaus der Bindungsaffinität der Nachweis von Antikörper ändern, vor allem, wenn ein monoklonaler Antikörper verwendet wird, um gebundene Liganden zu quantifizieren. Obwohl keiner von diesen Nebenwirkungen von Glutaraldehyd Fixierung in dieser Titration ELISA auftritt, muss die Empfindlichkeit des Tests in Richtung Glutaraldehyd bei jeder Rezeptor-Ligand Interaktion vor der Titration Experiment getestet werden. Nach der Fixierung wird überschüssige Glutaraldehyd in drei Waschschritten mit TRIS-haltigen Puffer entfernt. TRIS inaktiviert verbleibenden Aldehyd-Gruppen, die nonspecifically mit Nachweis von Antikörpern in der Folgeschritt reagieren könnte.

Die Menge des gebundenen Liganden ist mit Enzym-linked Antikörper, quantifiziert die bieten eine photometrische Signal ELISA S. Dies ist im Vergleich zu den gesamten Liganden Konzentration Lt hinzugefügt geplottet in jede Vertiefung. Trotz seiner einfacher Erwerb ist die Titration Kurve keine hyperbolische Funktion im Gegensatz zu der Bindung-Kurve. Darüber hinaus war es unklar wie die Dissoziationskonstante K aus einer Titration Kurve zu berechnen. Obwohl Algorithmen zu linearisieren spektroskopisch erworbenen Titrierung Kurven unabhängig von Stockell⁸ und Heyn und Weischet⁹gemeldet wurden, fielen sie wegen ihrer Unsicherheit der Schätzung der maximalen Signals kurz schätzen, dass die Sättigung Ertrag nähert sich bei hohen Konzentrationen an zusätzlichen Liganden.

Hier sind eine Titrierung ELISA und eine nicht-lineare Regression-Algorithmus beschrieben, die Dissoziationskonstante K für eine Rezeptor-Ligand Interaktion aus einer Titration Kurve abzuleiten. Dieses Protokoll ist für das Zusammenspiel von Kollagen-Bindung A-Domäne der Integrin α2β1 mit einer Schlange Venom abgeleitet Inhibitor beispielhaft dargestellt. Integrine sind Zelle Adhäsionsmoleküle, die die Verankerung der Zellen der umgebenden extrazellulären Matrix oder die zugrunde liegenden Basalmembran^10,11zu vermitteln. Darüber hinaus vermitteln Integrine wichtige Signale zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix durch die Rekrutierung von zusätzlichen Signalmoleküle und bilden neue Zellorganellen, Adhesomes, bei der Zellmatrix Interaktion^{12,13, 14}. Kollagen, dem Liganden α2β1 Integrin, ist das am häufigsten vorkommende Protein des menschlichen Körpers und ist ein entscheidender Gerüstbau Bestandteil des Bindegewebe¹⁵. Die Interaktion zwischen α2β1 Integrin und Kollagen wird durch A-Domäne der Integrin α2 Untereinheit vermittelt. Die Integrin α2A-Domäne enthält einen zweiwertigen kationen, die für Kollagen Bindung erforderlich ist und seine Struktur stabilisiert. Der Wildtyp Form sowie Mutanten des Geschäftsfeldes α2A, wie dem, in dem die Oberfläche ausgesetzt Rückstände Y216 für ein Glycin ersetzt worden können leicht in eine bakterielle Expressionssystems rekombinant hergestellt und über ihre Oligo-His-Tags mit einem NiNTA isoliert Superflow Säule mit einer anschließenden Dialyse gegen TRIS gepufferte Kochsalzlösung (TBS; 50 mM TRIS/HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) mit 2 mM MgCl₂¹⁶. Deren Konzentrationen wurden mit dem Bicinchoninic Säure Assay (BCA) ermittelt und ihre Reinheiten von herkömmlichen SDS-PAGE getestet und mit Coomassie Brilliant Blue R250 befleckt sind.

Die Interaktion zwischen α2β1 Integrin und Kollagen wird durch die Bindung der Schlange Venom Komponente, Rhodocetin, von den malayischen Grubenotter (Calloselasma Rhodostoma)^16,17blockiert. Verwendet als lösliche Liganden in dieser Titration ELISA, Rhodocetin aus dem Rohöl gereinigt wurde Venom bereits¹⁶beschrieben. Es wird in HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBS; 10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 150 mM NaCl) gelöst und bei-20 ° c eingefroren werden gespeichert Seine Konzentration wurde von BCA und seiner Reinheit wurde nachgewiesen durch SDS-PAGE. Als Antagonist, Rhodocetin blockiert nicht nur Kollagen, die Bindung an das Integrin α2β1 A-Domäne, aber auch die inaktiven Konformation der Integrin und verhindert somit Signalisierung von Kollagen in den Zellen oder Thrombozyten¹⁸stabilisiert. Es ist von großer biomedizinischen Bedeutung zu bestimmen, die Dissoziationskonstante des Rhodocetin mit seinen Rezeptor-Ziel und somit zu entwirren, seiner molekularen Mechanismus und pharmazeutischen Potenzial z.B.als Vermittler antithrombotische. Zu diesem Zweck eine Titrierung ELISA beschrieb ist einschließlich ihrer Bewertung gilt das für fast jeder Rezeptor-Ligand Interaktion mit einer Stöchiometrie von 1:1 Interaktion.

Protocol

(1) auf lagerlösungen Um 100 mL 10 X TBS pH 7.4 Lösung vorzubereiten, 6,06 g TRIS und 8,77 g NaCl in 90 mL entionisiertem Wasser auflösen, anpassen des pH-Werts 7,4 mit 37 % HCl-Lösung, die Lautstärke auf 100 mL mit entionisiertem Wasser füllen und Filtern Sie die Lösung. 100 mL 1 vorbereiten M HEPES/NaOH, pH 7.4 Lösung 23,83 g HEPES in 90 mL entionisiertem Wasser auflösen, anpassen den pH-Wert 7,4 mit 1,5 M NaOH, füllen Sie die Lautstärke auf 100 mL mit entionisiertem Wasser und Filtern Si…

Representative Results

Nach der ELISA entwickelt wurde, die gelbe Farbe des Substrats konvertierten alkalische Phosphatase, Para- Nitrophenolate, weist darauf hin, dass die Menge des gebundenen Rhodocetin Liganden sinkt mit abnehmender Konzentration von zusätzlichen Rhodocetin aus Spalten 1 bis 11 (Abbildung 1). Die farblosen Vertiefungen in der Rhodocetin-freien Brunnen in Spalte 12 zeigen eine niedrige Hintergrundsignal. <p class="jove_content" fo:keep-together.with…

Discussion

Die Titration ELISA ist ein vielseitiger Testsystem für die Dissoziation von einem Rezeptor-Ligand Interaktion bestimmen. Als die Titration ELISA umgeht die Notwendigkeit, freie und gebundene Liganden effektiv zu trennen und ihre Konzentration quantitativ analysieren wesentlich mehr Studien und Publikationen haben Titration ELISAs beschäftigt, anstatt Bindung Kurven . Darüber hinaus sind Titration ELISAs einfach durchzuführen und erfordert relativ geringe Mengen an Rezeptor und Ligand. Für die genaue Analyse der Dis…

Materials

TRIS	neoFrox	1125KG001
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
NaCl	Applichem	1,316,591,214
MgCl2	Merck	172571
integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant		isolated in author's lab
NiNTA superflow column	Qiagen, Germany	30821
Coomassie-Brilliant Blue R250	Serva	35050
bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit	Fisher Scientific	23225
bovine serum albumine (BSA), fraction V	Applichem	A1391
25 % solution of glutaraldehyde	Merck	354400
anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase	Sigma-Aldrich	A9919
Glycine	Applichem	A1377
Zn(II)-acetate	Applichem	A4324
NaOH	Applichem	A1551
Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg)	Sigma-Aldrich	S0942
Costar half-area microtiter plate	Thermo Scientific	Corning 3690
micro reaction tubes	Eppendorf	30120086
Microplate ELISA reader	BioTek	Synergy HT