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Biochemistry

受容体リガンドの相互作用の解離定数の決定法として elisa 法の滴定

doi: 10.3791/57334 Published: February 15, 2018

Summary

Elisa 法の滴定を実行する詳細なプロトコルを説明します。また、滴定 Elisa を評価し、マイクロタイター プレート固定受容体に水溶性リガンドの結合の解離定数を取得する新たなアルゴリズムが表示されます。

Abstract

解離定数は結合平衡の 2 つのパートナー間の相互作用について説明し、彼らの親和性の尺度です。異なる配位子、例えば、競争の抑制剤、タンパク質アイソ フォームと結合パートナーに結合強さのための突然変異体を比較する重要なパラメーターです。解離定数は結合曲線として連結無料リガンドの濃度をプロットすることによって決定されます。対照的に、滴定曲線、バインドされたリガンドの濃度に比例した信号が追加された配位子の全濃度に対してプロットされますが記録するはるかに簡単。分光学的および酵素結合抗体法 (ELISA) による、信号を検出できます。Α2β1 インテグリンの固定ターゲット ドメインに蛇毒由来 rhodocetin 結合を測定する ELISA の滴定のためのプロトコルその最たるものが。滴定 Elisa は汎用性の高い、広く使用されています。両蛋白質が純粋で、その濃度が知られているである、水溶性リガンド固定化の受容体と相互作用の蛋白質の任意のペアを使用できます。難易度はこれまでのところ滴定曲線からの解離定数を決定してきました。本研究では、滴定曲線の基礎となる数学的な関数を導入する.彩度収量の任意のエラーが発生しやすいグラフィカルな見積もり、なしは、このアルゴリズムは、非線型回帰による数学的評価によって直接 raw データ (追加されたリガンド濃度の異なるで信号強度) の処理をできます。したがって、いくつかの滴定曲線を同時に記録し、解離定数と結合活性受容体濃度の特性パラメーターのセットに変換することができ、統計学的に評価できます。このアルゴリズムと組み合わせた場合、滴定 Elisa は解離定数を直接提示の利点を得る。したがって、将来的により効率的に使用可能性があります。

Introduction

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解離定数 K は、その配位子 (L) (R) 受容体の親和性を記述する重要なパラメーターです。質量作用の法則に基づき、K は、受容体 R と配位子 l: 受容体リガンドの複雑な RL が切り離されます、平衡状態の定義は

Equation 1             式 1

受容体とリガンドの無料非連結状態を示す指数のf 。RL、受容体-リガンド複合体の濃度は、受容体に結合リガンド Lbの濃度と同じです。受容体 Rtの濃度は無料受容体 Rfとリガンド受容体 Rbの合計 = Lb、解離定数として書き込むこともできます。

Equation 2         方程式 2

したがって、彩度をもたらす Y、バインドされた配位子 Lb受容体 Rtの濃度の関係の一部として定義されています。

Equation 3         式 3

無料配位子 Lfの濃度に依存します。

Equation 4         方程式 4

この双曲線関係受容体-リガンド相互作用の結合曲線をについて説明し、そのプロットは、無料配位子 Lfの濃度の関数としてバインドされた配位子 Lbの濃度を示しています。結合曲線から半最大彩度降伏無料リガンドの濃度として解離定数 K を派生できます。さらに、クロッツ12、または成人 t 細胞またはヘインズ (Bisswanger3によって再検討されました) に従って変換によって二重逆数プロットなど、バインディング カーブをリニア化するさまざまなアルゴリズムが確立されています。ただし、すべてのアルゴリズムは漸近無料リガンド結合曲線の高濃度に近づくと、彩度収量の最大値がグラフィカルな事前評価の推定すべきありしたがっては問題に苦しむエラーを起こしやすい。

さらに、結合曲線の測定無料とバインドされたリガンドの結合平衡時の定量化が必要です。この目的のために無料のリガンドが受容体に結合リガンドから分離し定量化します。したがって、リガンドと受容体タンパク質の受容体ではなく非蛋白質リガンドなどのプロパティで違う必要があります。両方の結合パートナーはタンパク質である場合彼らはそのサイズ、料金、またはその他の分子の機能の区別する必要があります。それにもかかわらず、小規模のバインディング方法をリガンド濃度の定量化は困難な作業です。放射性標識リガンドのよくされているバインドされたリガンドの濃度を検出する必要受容体の大量された利用可能なまたは手頃な場合は特に。さらに、受容体に結合リガンドが無視できない方法で分離後を切り離して考えます。したがって、平衡ゲルろ過4、キャピラリー電気泳動5、およびパルス分解6などの複雑な方法は受容体に結合リガンドを定量化し、無料配位子と区別する必要があります。

これらの結合の試金と対照をなして、滴定実験では連結および無料配位子の定量分離の操作は不要です。このため、追加されたリガンドの濃度の異なる一定濃度で受容体を滴定します。受容体に結合することにより連結配位子無料配位子からそれを区別する、例えば測光、蛍光分析、または抗体の検出で測定可能な生物物理プロパティがあります。したがって、信号彩度に比例する S Y を得、その結果も受容体に結合リガンド (Lb) 濃度が検出された追加配位子 (Lt) の濃度の関数として。両方のパラメーター、S 信号および追加の配位子の全濃度はバインドされ、無料のリガンドの濃度より直接かつ簡単に定量化しました。特に、酵素免疫測定法 (ELISA) 受容体に結合リガンドの検出はウェル マイクロ プレートで 100 μ L 以下にサンプル ボリュームの削減だけでなく、いくつかのリガンド濃度の並列測定を許可しました。Elisa 法、滴定の受容体は物理的に同じ濃度でマイクロ プレートに吸着、水溶性リガンドで滴定します。受容体は、疎水性吸着によって本質的にプラスチック表面に固定化します。Langmuir´s 吸着等温線7によると可能性が高い非線形関係における受容体のコーティング濃度固定受容体相関の表面濃度。吸着受容体分子の総数に加え、アクティビティの状態は滴定試金のための別の重要なパラメーターです。受容体リガンド結合活性を保持している、滴定試金に関連して、最終的に滴定試金は、直接決定することができないアクティブな受容体 Rt濃度に貢献を固定しただけ。

プラスチックの表面に固定化の受容体によってカバーされていないサイトは、リガンドなどの他の蛋白質を吸着する傾向があります。このようなプラスチック表面サイト リガンドの物理吸着はまだ非特異的な受容体に結合リガンドとして同じような信号になります。この非特異的な信号は、タンパク質でコーティングされていないまだウシ血清アルブミン (BSA) でブロックされるマイクロタイター プレートのプラスチック表面サイトを減らす。ただし、いくつかの受容体リガンド滴定試金のため非特異的なバック グラウンド信号を観察することがあります。その後、他のブロッキング剤 0.04%、0.2% のゼラチンの溶液などをトゥイーン 20、お勧めします。

受容体に結合後無料配位子は 2 つの洗濯手順によって削除されます。バインドされたリガンドの受容体がマイクロだけでなく、プラスチックの表面に固定化され必要に応じて化学固定法による鉄筋のままです。その後共有結合架橋結合リガンドとグルタルアルデヒドで固定化受容体のバッファー物質トリス、リガンド結合の変更なし、HEPES に置き換えられます。トリスと対照をなして、HEPES は、グルタルアルデヒドを不活化していません。グルタルアルデヒドで共有結合性の架橋受容体結合リガンドを修正し、以降の洗濯とインキュベーションの手順中に解離度を防ぎます。したがって、受容体-リガンド相互作用が化学的に固定、洗濯とインキュベーションの以降の手順で影響を受けるである滴定曲線を保証します。ただし、リガンドと受容体の相互作用が減少、廃止またはそのような方法で、グルタールアルデヒド固定化学的に変更可能性があります。また、モノクローナル抗体を使用してバインドされたリガンドを定量化する場合に特に、配位子内エピトープの変更は検出抗体の結合親和性を変更可能性があります。この滴定 ELISA のグルタルアルデヒド固定のこれらの副作用のいずれも発生しますが、グルタルアルデヒドに向けてテストの感度は滴定の実験の前にすべての受容体-リガンド相互作用のテストをする必要があります。固定後、余分なグルタルアルデヒドはトリスを含むバッファーと 3 つの洗浄のステップで削除されます。トリスは、後続の手順で抗体を検出と特異的反応かもしれない残りのアルデヒド グループを不活性化します。

フォト メトリック ELISA 信号 s. を提供する酵素抗体結合リガンドの量を定量化します。これは合計リガンド濃度 Lt追加対サ各ウェルに。簡単に買収にもかかわらず、滴定曲線は双曲線関数結合曲線とは対照的ではないです。さらに、それがはっきりしなかった滴定曲線からの解離定数 K を計算する方法。分光学的買収した滴定曲線をリニア化するアルゴリズムが独立して報告されていない Stockell8と Heyn および Weischet9によって、彼らは最大の信号を推定の不確実性のために短く落ちた値、追加配位子の高濃度で飽和量に近づきます。

ここでは、ELISA の滴定および非線形回帰アルゴリズム受容体リガンド相互作用滴定曲線からの解離定数 K を派生させるように記載されています。このプロトコルは、コラーゲン結合 A ドメイン インテグリン α2β1 蛇毒由来阻害剤との相互作用の例示です。インテグリンは細胞接着分子は、細胞周辺の細胞外マトリックスまたは基盤となる基底膜10,11へのアンカレッジを仲介します。また、インテグリンは募集追加シグナル分子と新しい細胞小器官、細胞マトリックスの相互作用12,13に、adhesomes を形成して細胞と細胞外マトリックスの重要な信号を伝える14. コラーゲン、α2β1 インテグリンのリガンドは人体の最も豊富な蛋白質、結合組織15の重要な足場コンポーネントです。Α2β1 インテグリンとコラーゲンの相互作用は、インテグリン α 2 サブユニットの A ドメインによって仲介される.インテグリン α2A ドメインには、コラーゲンのバインディングが必要ですし、その構造を安定化させる二価の陽イオンが含まれています。野生型のフォームと同様のものなど、グリシンが表面に露出した残渣 Y216 取り替えたされて α2A ドメインの変異体簡単に細菌の表現システムで recombinantly 生産でき、オリゴ-彼-タグを介して、NiNTA と分離トリス緩衝食塩水 (TBS; 50 mM トリス/塩酸で pH 7.4 では、150 mM の NaCl) 含む 2 mM MgCl216に対してその後透析スーパーフロウ ・列。ビシンコニン酸アッセイ (BCA) とその濃度を測定した、その純度を従来 SDS-PAGE によってテストし r250 という Coomassie ブリリアント ブルーで染色します。

Α2β1 インテグリンとコラーゲンの相互作用は、マレーマムシ (Calloselasma rhodostoma)16,17rhodocetin 蛇毒成分の結合によってブロックされます。この滴定 ELISA の水溶性リガンドとして使用すると、rhodocetin は、原油から精製された毒16を前述のよう。(HBS; 10 mM HEPES/水酸化ナトリウム、pH 7.4 では、150 mM の NaCl) HEPES バッファーの生理食塩水に溶解し、-20 ° C で凍結保存はその濃度は BCA によって決定され、その純度は、SDS-PAGE によって証明されました。として、rhodocetin だけでなくコラーゲン、インテグリンにバインドをブロック α2β1 A-ドメイン、細胞や血小板の18にコラーゲンから任意の信号を防ぐインテグリンの使用頻度の低い構造を安定化に対しても。その受容体ターゲットと rhodocetin の解離定数を決定し、こうしてその分子機構と製薬潜在的な、抗血栓剤としてを解明する生物医学重視のです。このために、ELISA はその評価を含めて説明されている滴定 1:1 の相互作用の化学量論とほぼすべての受容体-リガンド相互作用に適用されます。

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Protocol

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1. 原液

  1. 10 x TBS 100 mL pH 7.4 ソリューションを準備、6.06 g のトリスと 90 mL の脱イオン水に NaCl の 8.77 g を溶解、37% 塩酸溶液と 7.4 に pH 調整、脱イオン水 100 mL にボリュームを埋める、フィルター ソリューション。
  2. 1 の 100 mL を準備するには、M HEPES/水酸化ナトリウム、pH 7.4 ソリューションは 90 mL の脱イオン水に HEPES の 23.83 g を溶解、7.4 1.5 M NaOH で pH を調整、脱イオン水 100 mL にボリュームを埋めるし、フィルター ソリューション。
  3. 準備として 5 M 塩化ナトリウム溶液 100 mL、90 mL の脱イオン水に NaCl の 29.2 g を溶解します。脱イオン水 100 mL にボリュームを埋めるし、ソリューションをフィルターします。
  4. 1 M MgCl2溶液 100 mL を準備するには、溶解 MgCl2 · 20.33 g6 H2O 90 mL の脱イオン水に。脱イオン水 100 mL にボリュームを埋めるし、ソリューションをフィルターします。
  5. 水で 5% 熱不活化 BSA を準備、50 mL のチューブで BSA (分数 V, pH 7.0) の 2.5 g の重量を量るし、45 mL の脱イオン水に溶かします。脱イオン水 50 mL にソリューションを埋めるし、45 分の氷浴で冷却し、-20 ° C で保存 68 ° c の水浴のソリューションを加熱
  6. 25% グルタールアルデヒド水溶液を準備します。
    注意: グルタルアルデヒド飲み込んだ場合吸入すると有毒有害な、火傷します。手袋、防護服を着用し、保護眼鏡/保護面。
  7. 上記の19としてウサギ抗血清を上げます。抗体の力価は、標準プロトコル20によると決定しました。
  8. アルカリホスファターゼ標識ヤギからウサギ抗免疫グロブリン抗体を準備します。
  9. 0.1 M グリシン溶液 100 mL を準備するには、90 mL の脱イオン水にグリシンの 0.75 g を溶解します。10.4 1.5 M NaOH 溶液を pH 調整、脱イオン水 100 mL にボリュームを埋めるし、ソリューションをフィルターします。
  10. 0.5 M 亜鉛 (II) の 100 mL を準備する-酢酸溶液 10.98 g 亜鉛 (II) の溶解-酢酸 ·2 H2O 90 mL の脱イオン水に。脱イオン水 100 mL にボリュームを埋めるし、ソリューションをフィルターします。
  11. 1.5 M NaOH 溶液 100 mL を準備するには、90 mL の脱イオン水に水酸化ナトリウムの 6.0 g を溶かします。脱イオン水 100 mL にボリュームを埋めるし、ソリューションをフィルターします。

2. バッファーを準備してソリューション

  1. 5 mL 10 x TBS pH 7.4、45 mL の脱イオン水を希釈し、1 M MgCl2ストック溶液 100 μ L を追加します。部屋の温度でそれを維持します。TBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2ソリューションは、受容体とマイクロタイター プレートを洗浄の固定化です。
  2. 水の熱不活化 BSA の 5% と 10 x TBS 5 mL、50 mL の脱イオン水 pH 7.4 の 10 mL を希釈します。1 M MgCl2ストック溶液 100 μ L を追加し、ソリューションをよく混ぜます。氷の上にそれを維持し、-20 ° C でさらに実験のために保存注 1 %bsa を TBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2でその 2.5 mL 各滴定曲線に必要です。
  3. 1 の 2.5 mL を希釈 M HEPES/水酸化ナトリウム、pH 7.4 と 1.5 mL 5 M NaCl 水溶液 50 mL を脱イオン水に 100 μ L 1 M MgCl2ソリューションを追加し、徹底的に HBS、pH 7.4: 50 mM HEPES/水酸化ナトリウムの 50 mL を準備するソリューションをミックス、150 mM の NaCl。
  4. 1 M MgCl2ストック溶液 5 μ L と 2 μ L 0.5 M 追加 Zn (II)-酢酸原液 5 mL 0.1 M グリシン溶液、pH 10.4 アルカリフォスファターゼ (AP) バッファー (pH 10.4, 1 mM MgCl2、0.2 mM Zn(II)-acetate) 0.1 M グリシン溶液等を準備する

3. 受容体 (インテグリン α2A ドメイン) のマイクロタイター プレートの固定

  1. Tbs、pH 7.4、最終濃度 5 μ G/ml の 2 mM MgCl2インテグリン α2A ドメインの原液を希釈します。
    注: コーティング溶液の量は半分の領域マイクロタイター プレートの 12 も行で構成される 1 つの滴定曲線の 650 μ L です。
  2. インテグリン α2A ドメイン (野生型または変異体) の 5 μ g/mL コーティング溶液 50 μ L/ウェルで半分エリア マイクロタイター プレート上の行のすべての井戸を埋めます。少なくとも重複で滴定のすべての行を実行 (この例四つ子; として図 1にマイクロ プレートのレイアウトを参照してください)。
  3. 箔でプレートをシールまたはふたを閉じます。4 ° C でプレートを一晩おきます。

4. 洗浄コーティング井戸 tbs、pH 7.4 では、2 mM MgCl2 2 回プレートの

  1. 可溶性レセプターを削除するには、TBS、pH 7.4 では、2 mM の 50 μ L で、MgCl2がよくない物理吸着でプラスチック表面に固定されている、コーティング ソリューションを削除し、塗りつぶしは各分子。
  2. 洗浄ソリューションを削除します。井戸は、乾燥にならないかを確認します。したがって、残留液を削除する組織布の上にマイクロ プレートをタップしないように。すぐに、井戸を埋めるため多段ピペットやマルチ チャンネル ピペットを使用します。
  3. この洗浄工程をもう一度繰り返します。

5. 非特異的結合部位をブロックします。

  1. Tbs、pH 7.4 では、各ウェルに 2 mM MgCl2 1 %bsa 溶液 50 μ L を追加します。
  2. 箔と井戸を再シールかふたを閉じます。
  3. 井戸室温で 1 時間インキュベートします。
    注: このプロトコルのインキュベーションの手順のいずれかは、ロッキングまたは振動プラットフォームで実行できます。しかし、これは必須ではありません、実験の結果は変わりません。

6. 配位子、Rhodocetin のシリアル希釈行の準備

  1. Rhodocetin の開始濃度およびシリアルの希薄をリガンド濃度の適切な範囲を取得して、最小値と最大信号による滴定曲線を記録するための希釈倍率が異なります。この実験では 243 nM rhodocetin の開始濃度と希釈倍率 2.3 を採用してください。シリアル希釈行の高いリガンド濃度 rhodocetin 原液を希釈します。2.3 の希釈係数と各滴定曲線の準備 1 %243 nM (すなわち、15,2 μ g/mL) rhodocetin ソリューションの 115 μ L BSA/TBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2試験管 #1。
  2. TBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2 #2 #11 を介して 10 の試験管内で 1 %bsa 溶液 65 μ L をご記入ください。
  3. テスト チューブ #1 から rhodocetin 希釈の 50 μ L を転送テスト チューブ #2、ミックス両方のソリューション (容量: 115 μ L; 希釈倍率: 1:2. 3) 製粉、そしてテスト チューブ #3 等にこの混合物から転送 50 μ L に
  4. テスト チューブ #11 までこのシリアル希釈を続けます。
    注: 手順 6.1 6.4 は、ボリューム 1 つの滴定曲線に対して十分です。これらのボリュームを複製の数に掛けます。この場合、8 つの滴定曲線 (2 つの α2A ドメイン形式の四つ子) を実行、次のボリュームの準備: テスト チューブ #1; の最高濃度で rhodocetin ソリューションの 920 μ LTBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2各試験管に #2 #11; を埋めるために 1 %bsa の 520 μ L次のいずれか 1 つの管から転送量の 400 μ L。

7. 結合リガンド (Rhodocetin) に異なる濃度の固定受容器 (インテグリン α2A ドメイン)

  1. 真空ライン マイクロタイター プレート井戸からブロック ・ ソリューションを取り外します。
  2. すぐに 1 %rhodocetin 溶液 50 μ L を追加 BSA/TBS、列 1、列 2、TBS、pH 7.4 で 1 %bsa を追加 50 μ l を添加の井戸をテスト チューブ #2 のソリューションの井戸に試験管 #1 の pH 7.4/MgCl2ソリューション、2 mM MgCl2 (ブロックと希釈バッファー) 配位子無料コントロールとして列 12 (マイクロタイター プレート、図 1のレイアウトを参照してください) の井戸へ。
  3. 箔と井戸を再シールかふたを閉じます。
  4. 室温 (約 20-22 ° C) で 1.5 h の井戸を孵化させなさい。

8. 洗浄井戸のプレート 2 回 HBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2

  1. 非バインド リガンド分子を削除するには、バインドのソリューションを削除し、塗りつぶしは各 pH 7.4 では、2 mM MgCl2HBS の 50 μ L でも。洗浄液を取り出します。
  2. 井戸は乾燥にならないように注意してください。したがって、残留液を削除する組織布の上にマイクロ プレートをタップしないように。すぐに、井戸を埋めるため多段ピペットやマルチ チャンネル ピペットを使用します。
  3. この洗浄工程をもう一度繰り返します。

9. 2.5% 受容体に結合リガンドを固定 HBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2におけるグルタールアルデヒド

  1. 25% グルタルアルデヒド溶液の 1 部分、HBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2の 9 の部分を混合することによって新鮮な 2.5% グルタルアルデヒド溶液を準備します。
  2. HBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2で 2.5% グルタルアルデヒド溶液 50 μ L をマイクロタイター プレートの各ウェルを入力します。マイクロタイター プレート室温で 10 分間、インキュベートします。

10 TBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2の 50 μ L/ウェル プレートの 3 倍のは洗浄井戸

  1. 削除し、過剰なグルタルアルデヒドを不活性化、固定の解決を削除し、それぞれを記入 TBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2の 50 μ L でも。洗浄ソリューションを削除します。
    注: マイクロタイター プレートから固定のグルタルアルデヒドを含む解決を皿に注ぎ、それは TBS、pH 7.4 の等量によって不活化されている後固定液を捨てください。
  2. 井戸は乾燥にならないように注意してください。したがって、残留液を削除する組織布の上にマイクロ プレートをタップしないように。すぐに、井戸を埋めるため多段ピペットやマルチ チャンネル ピペットを使用します。
  3. この洗浄工程を 2 回繰り返します。

11. elisa 法による受容体に結合を配位子の定量

  1. Tbs、pH 7.4 では、2 mM MgCl21 %bsa の一次抗体溶液 50 μ L/ウェルを追加します。一次抗体はウサギ抗血清 rhodocetin19に対して提起、tbs、pH 7.4 では、2 mM MgCl21 %bsa で 1:2,000 を希釈します。
  2. 常温で 75-90 分のプレートを孵化させなさい。3 回と TBS、pH 7.4 では、2 mM MgCl2の 50 μ L/ウェル プレートのすべての井戸を洗浄します。洗浄手順、ティッシュにマイクロタイター プレートのタップ 3 中布は必要ではありません。
  3. Tbs、pH 7.4 では、2 mM MgCl21 %bsa の二次抗体溶液 50 μ L/ウェルを追加します。このためには、二次抗体、アルカリホスファターゼ、tbs、pH 7.4 では、2 mM MgCl21 %bsa で 1:2,000 すると共役ウサギ免疫グロブリン ターゲット ヤギ抗体を希釈します。常温で 75-90 分のプレートを孵化させなさい。
  4. 4-ニトロフェニル リン酸二ナトリウム水和物 (アルカリホスファターゼ基質) AP バッファー (pH 10.4、MgCl2 1 mM と 0.2 mM Zn(II)-acetate) を含む 0.1 M グリシン溶液等の 5 mL を含む 5 mg 錠剤を溶解することにより AP 検出ソリューションを準備します。
  5. 3 回で pH 7.4 では、次の手順を実行する前にすぐに 2 mM MgCl2TBS の 50 μ L/ウェル プレートのすべての井戸を洗浄します。液体のすべてのトレースを削除する最後の洗浄工程後組織布の上にマイクロ プレートをタップします。
  6. マイクロ プレートのウェルに AP 検出溶液 50 μ L/ウェルを追加します。可能な限り同時に酵素の変換を開始するすべての井戸に速やかに AP 検出ソリューションを追加します。したがって、マルチ チャンネル ピペットを使用します。
  7. リガンドの濃度と井戸のソリューションが黄色に変わるまでは、室温でプレートを孵化させなさい。
    注: 信号強度に応じて 1 h と 5 分間インキュベーション時間が異なる場合があります。
  8. 1.5 M 水酸化ナトリウム溶液 50 μ L/ウェルを追加することによって脱燐酸化酵素の基質の変換を停止します。両方のソリューションの混合力のないことを確認する数分間板立っているままにします。すべての井戸で同じ潜伏期間を保証するには、マルチ チャンネル ピペットを使用し、ステップ 11.8 で AP 検出基板の井戸に追加する順序と同じ順序で 1.5 M NaOH を追加します。
  9. 405 で光学濃度 (OD) を測定 ELISA リーダーによって各ウェルの nm。

12 滴定信号の評価

  1. Excel で、OD405 nm値の生データのテーブルを開きます。滴定曲線のこれらの信号の値が行の読んで、列と別の列に追加されたリガンドの濃度のラベルに値を置換します。
  2. グラフパッド プリズム 5 (バージョン 5.0) を開きます。メイン メニューで、新しいプロジェクト ファイルを開きます。[新しいデータとグラフXYフォーマットを選択します。Y 軸のオプション入力と値ごとに単一の点のプロットを選択します。
  3. 2 つの列は、追加されたリガンドの濃度をコピーし、値 (OD405 nm ) excel からファイルとしてグラフパッド プリズムのデータシートに貼り付けること信号 X と Y 値は、それぞれ。
  4. グラフパッド プリズム 5解析サブ プログラムを開き、[ XY 解析非線形回帰のオプションを選択します。ユーザー定義の式を選択し、新しい方程式を作成する新規作成] ボタンを押します。
  5. フォームの滴定曲線の数式を入力: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X))/(2*R) Smin + B * X は新しくオープンしたテンプレート シートに追加の配位子 L の濃度 X S、シグナル値をされている Y、R の濃度をされている固定受容体、解離定数をされている K と B の背景の中斜面します。K など、適切な制約を定義する > 0、R > 0。
    注: この式は、別の形の方程式 9の同じ方程式です。
  6. 新しく作成されたユーザー定義の式を選択することで、データ ・ シートの値を分析します。近似計算値のテーブルを開く (K、Rt、SmaxSと B) これはソフトウェア画面の左側にある [結果のセクション下に表示されます。
    注: ソフトウェアは、滴定曲線は、少なくとも 5 つのデータ ポイントで構成されて 場合にのみ、非線型回帰分析の反復的なあてはめによる 5 のパラメーターを決定します。
  7. パラメーター K、Rt、SmaxSと滴定曲線のすべてのグループの B は、統計的に評価し、グループ (変異や化学修飾したリガンド受容体) の特定の機能とパラメーターを関連付けます。

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Representative Results

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ELISA の後、開発されている変換アルカリホスファターゼ基質、パラnitrophenolate の黄色の色から追加された rhodocetin の濃度の低下とともに連結 rhodocetin 配位子の量を減少させることを示す列 1 に 11 (図 1)。コラムで 12 rhodocetin 無料井戸で無色の井戸は、低バック グラウンド信号を示します。

405 の吸光光度定量 nm 提供データ、解析ソフトウェアと非線型回帰と方程式 9を使用してに直接フィードバックすることができます、各滴定行の生データに近い、(ODに匹敵する信号 S を計算します405 nm) の濃度の機能追加 rhodocetin 配位子 Lt (図 2)。各受容体のフォーム (野生型および変異型) の 4 つの滴定曲線は再現性の高い、ほとんどお互いを superpose します。このグループ内分散が低いと対照をなしては、滴定曲線の 2 つのグループは互いから明確に分離します。Rhodocetin 配位子の高濃度が野生型フォームのものに類似した値の信号を得るための突然変異の α2A ドメインにバインドするために必要です。滴定曲線のこの右シフトは、変異体の配位子が配位子の低親和性を持っていることを示しています。したがって、インテグリン ドメイン18rhodocetin 結合部位の一部であるために、α2A ドメインに導入された突然変異は rhodocetin バインドを損ないます。

5 特徴的なパラメーターで滴定曲線を記述できる: (i) 解離定数 K、(ii) の濃度固定、生理活性受容体 Rt最大 (iii) および (iv) 最小信号 (Smax S)、(v だけでなく、) バック グラウンド信号 B. の斜面これらのパラメーターの中で解離定数 K は、不可欠であり、最も適切な滴定曲線の生物学的解釈です。すべての滴定曲線の 1 つの値を提供しますしたがって、シングル、またグループ化された滴定曲線は、相互に統計学的に比較しました。野生型と変異の α2A ドメインの 4 つの滴定曲線の解析は、図 3に示すです。Rhodocetin 野生型 α2A ドメインへの結合のための親和性定数は 5.80 ± 0.15 nM rhodocetin は、9.68 ± 0.18 nM の有意に低い親和性を持つ変異受容体に結合 (p < 0.0001)。

したがって、この数学的評価とともに ELISA 滴定は、リガンド、受容体とその変異や化学修飾した誘導体の高速かつ統計的に信頼の評価を使用できます。したがって、滴定 ELISA とアルゴリズムの評価は、構造と機能の関係を分析する貴重なツールです。

Figure 1
図 1: マイクロ プレート elisa 法の滴定のための代表的なレイアウトします。各行は、1 つの滴定曲線のデータを提供します。Rhodocetin (RC) リガンドの結合を比較するには、野生型 (行 A ~ D) または α2A ドメインの変異フォーム (行 E H) は 4 行 (四つ子決定) の井戸に固定化しました。水平ドット ラインは、滴定曲線の 2 つのグループを区切ります。Rhodocetin リガンドの濃度は、中列 12、縦ドット線の右側に示されている井戸がなく、rhodocetin、背景のコントロールを表す列 1 に 11 から減る。バインドされたリガンドはアルカリホスファターゼ基質が黄色パラnitrophenolate に変換されて ELISA によって定量化されます後、プレートが表示されます。3 つのうち 1 つの反復的な実験からのデータが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 代表的な滴定曲線。滴定の生データは、野生型を固定化し、近似の滴定曲線 (ライン) と同様に水溶性リガンド (記号) として rhodocetin とインテグリン α2A ドメインの変異形が半対数プロットで表示されます。野生型 (オープン シンボル) を固定化し、(塗りつぶしシンボル) α2A 受容体の変異、四つ子決定 (円、上下の三角形、正方形 4 つの滴定行ごと) の生のデータが表示されます。計算の滴定曲線、線として表示されます (固体、短い破線、点線、チェーン ドット) 野生型 (黒線) と受容体の変異 (灰色の線) フォームのため。(野生型および変異受容体) の 2 つのグループのそれぞれで 4 つの滴定曲線は滴定曲線明確に 2 つのグループ間で異なるに対し、superpose します。突然変異の α2A ドメインの滴定曲線は、その rhodocetin 結合変異受容体に低い親和性を示す rhodocetin 濃度が高いに移動されます。3 つのうち 1 つの反復的な実験からのデータが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 解離定数 K の統計的な比較は、滴定曲線から派生します。
図 2から 8 つの滴定曲線の分離の定数は印刷、α2A ドメインの野生型と変異型のフォームのグループ化します。個々 の値は、グループの意味や標準偏差はそれぞれポイント、黒破線、灰色のエラーバーが表示されます。各グループとグループの間の明確な違い内分散が小さい意味有意差を示す (p < 0.0001) 野生型と変異受容体のリガンドの親和性で。2 尾 Student´s t-テストは比較のために使用されました。3 つのうち 1 つの反復的な実験からのデータが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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Elisa 法の滴定は、受容体-リガンド相互作用の解離を決定する多彩なテスト システムです。滴定として ELISA を回避必要無料とバインドされている配位子を効果的に分離してその濃度を定量的に大幅により多くの研究および出版物は結合曲線を記録代わりに滴定 Elisa を採用しています。.また、滴定 Elisa 実行し、易い受容体とリガンドの合理的に低い量を必要とします。解離定数の正確な分析は、受容体とリガンドの純粋な準備を使用する必要があります。マイクロタイター プレートのプラスチックの表面上の吸着サイトの受容体と受容体準備内汚染タンパク質の競争します。彼らはリガンドを結合しないが、リガンド受容体の数を減らす、受容体溶液の不純物は滴定の ELISA の信号を減らします。受容体製剤の純度を改善できない場合はさらに、受容体に対する抗体マイクロタイター プレートに固定することができますでそして、井戸をブロックした後、不純物を含む準備から受容体をキャプチャします。キャプチャの抗体は、抗体の種の干渉のための第一次および二次抗体と結合リガンド検出を妨げないまたはそれはリガンド結合を妨げるようにそれにもかかわらず、注意が必要です。

データの包括的なセットを得るためには、それは感謝して、マイクロタイター プレートに固定化した他の実験では受容体として 1 つの実験の水溶性リガンドを使用し、それを滴定する相互方法で滴定 ELISA を実行するには水溶性リガンド パートナーとして適用される元の受容体。これは通常も固定化パートナーの 1 つの結合活性を不活化または滴定されたパートナーを検出する抗体などのツールが存在しないまたはが得にくい場合を除き動作します。グルタチオン S トランスフェラーゼ (GST) の後でよく働いたこれ rhodocetin α2A ドメイン バインド システム-部位は GST 抗体16とその検出を容易にするために α2A ドメインに融解。

滴 ELISA の別の利点は、追加配位子 (Lt) のではなく無料でバインドされたリガンドの濃度だけ (Lfと Lb、それぞれ)、知られている必要があります。したがって、配位子準備はできるだけきれいにする必要があります。これは不可能または ELISA がまだ採用される準備内配位子のモル比がされた後滴定法の限られた範囲にだけ可能で独立して決定、例えば、サンドイッチ elisa 法や免疫ブロット、SDS ページ。

ELISA 滴定法による問題が発生するは、受容体とリガンドとの親和性が低すぎる場合、またはグルタルアルデヒド固定結合相互作用を廃止します。後者の場合、滴定 ELISA の固定無料のプロトコルを確立する必要があります。実際には、解離定数のみが検出できる場合合理的に高い親和性、約 200 の下の範囲内にある結合パートナーの対話 nM。

滴定は、Lt追加配位子の全濃度の関数として信号強度 S を提供します。無料および非連結のリガンドの濃度、Lfと LbLtにまとめる L としてbに等しい Y· の製品とRt 式 3によると、式 4に変換されます。

Equation 5           式 5

二次方程式の結果

Equation 6         方程式 6

その現実的な解決策は、

Equation 7         方程式 7

さらに、追加配位子 Ltの特定の濃度で信号強度 S (Lt) Y、彩度収量を表します S、最小信号値の減算で修正してダイナミック レンジを正規化した後、信号の最大値と最小値、Smax Sの違いとして与えられます。

Equation 8           方程式 8

式 7式 8の組み合わせは、追加配位子 Ltの濃度と信号強度 S (Lt) を相互に数学関数を生成します。ポジション用語Tの L は、Ltの直線を発生させます非特異的なバック グラウンド信号を記述する追加できます。B は背景の比例定数です。したがって、滴定曲線を記述する一般的な関数です。

Equation 9         方程式 9

滴定曲線のこの機能は、それぞれ受容体とリガンド、リガンド、非特異的な相互作用の間の特定の相互作用を記述する線形項と平方根用語で作成した関数に対応します。この関数は、バインド曲線の双曲線関数とは異なる (Lbvs 。Lf)。

バインドされたリガンドの濃度が、y 軸にプロットされますバインディング曲線と対照をなして滴定曲線はより柔軟性を使用することができ、y 軸にプロットするようにあらゆる信号、バインドされたリガンドの濃度と相関。この信号がみて検出された例のようにこの ELISA の)、酵素抗体結合できるが、吸光度、円二色性9、蛍光偏光21 の変更など、他の分光信号もあります。、および NMR 信号22。さらに、また等温滴定熱量測定23から熱力学的信号はずを評価することが可能です。他の研究論から - 結合親和性を決定し、解離によるエバネッ セント場の測定のリアルタイム変更によって受容体-リガンド複合体の形成率を表面プラズモン共鳴24,25、マイクロ スケール働く26,27によって水晶振動子微量天秤26、または蛍光性の沈着を大量します。これらのリアルタイム測定の高度な評価版ソフトウェアのための強力なツールとなっています。滴定 elisa 法と SPR は、一般的にタンパク質化学分析の結合パートナーを確認する最適な方法です。Elisa 法の滴定は、異なる平衡状態でバインドされている配位子の量を定量化することで熱力学的親和定数を測定、SPR 論的アプローチを利用してし、の反応速度定数、kオフと kの近似、比を速度論的決定の解離定数24,25を提供します。2 つの異なるアプローチによって互いから K の値が異なる場合があります。Kオフと速度定数k rhodocetin α2A ドメイン結合実験で SPR データを明らかにし、その結果、速度論的に非常に似ている rhodocetin α2A 複雑な19、親和定数 K を決定します。K 値は、滴定法 elisa 法により本研究で測定。わずかな違いは、異なるバッチまたは異なる条件の活動変化と蛋白質のサンプルの保管期間によって説明できます。この後の点で滴定 ELISA のすべてのサンプルで測定されますような同時ではなく順番に SPR マシン。今、数学的にアクセスし、滴定曲線式 (式 9) で管理が容易であること、このエンドポイント測定 ELISA 滴定なる速度論的評価のリアルタイム計測と同じくらい強力でコストのかかる SPR マシンが必要です。

この式は、配位子の全濃度は低配位子濃度で特に、バインドされたリガンドの濃度が減考慮します。これは配位子濃度の範囲全体にわたるデータに滴定曲線の多くのよりよい近似をことができます。結合曲線と比較して, elisa 法を用いる滴定の 1 つの欠点は、滴定曲線を数学的に評価する難しさをされているところ。バインディング カーブ無料配位子 L の濃度でf半最大彩度で解離定数に等しいに対し、これは滴定曲線の真ではありません。グラフィカルに滴定曲線をリニア化して解離定数を決定するため、2 つのアルゴリズムが独立して開発されています。しかし、両方のアルゴリズムは Stockellによって分光滴定実験の開発8飽和量 Y の最大信号を視覚的に決定する必要が不利な点に苦しむ Heyn & Weischet9 。この値は漸近的に近づくと、彩度の収量およびその結果計算解離定数、本質的にエラーを起こしやすいです。対照的に、方程式 9に基づくアルゴリズム滴定実験の生データを使用し、非回帰 (図 2および図 3の最適ソリューションを見つけるための他のパラメーターと同様に、解離定数 K を計算します).また、このアルゴリズムをグラフィカルに配位子彩度で多分アウトに達する最大信号を推定する必要はありません評価プロセスがより迅速かつ正確なそれはグラフィカルな評価よりも以下のバイアスを負いません。いくつかの滴定曲線は、並列に評価することができます。したがって、滴定曲線のいくつかのグループを同時に測定することができます、そのパラメーターを統計的に分析および比較が可能します。また、すべての滴定曲線を与えるそれらの間での値のセット解離定数 K、固定化と結合活性受容体 Rtの濃度、S信号の最大値と最小値の最大の違いとしてダイナミック レンジ分、だけでなく、これらの値、彩度収量 Y を計算しての濃度依存性にプロットすることができますを使用して実験的バック グラウンド信号に対応する線形係数 B 配位子 Ltを追加しました。このような飽和収量プロットで半最大彩度信号 Lt(50%) で追加されたリガンド濃度解離定数 K プラス固定化活性受容体 Rtの半分の濃度の和に等しい

Equation 10        方程式 10

これは Y の派生できる方程式7 0.5 を =。したがって、固定されたアクティブな受容体 Rt濃度は受容体の異なったコーティング濃度を滴定法 elisa 法を実行することによって決定できます。

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Disclosures

著者は、何を開示します。

Acknowledgments

プロトコルとアルゴリズムは、ドイツ研究振興協会 (DFG グラント SFB1009 A09 と EB177/13-1) によって融資プロジェクト内で開発されました。著者は、バーバラ Schedding とテクニカル サポートのフェリックス ・ Schmalbein 博士ナイランド批判的に原稿を読み取るためのおかげでください。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TRIS neoFrox 1125KG001
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Applichem 1,316,591,214
MgCl2 Merck 172571
integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant isolated in author's lab
NiNTA superflow column  Qiagen, Germany 30821
Coomassie-Brilliant Blue R250 Serva 35050
bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit Fisher Scientific 23225
bovine serum albumine (BSA), fraction V Applichem A1391
25 % solution of glutaraldehyde Merck 354400
anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase Sigma-Aldrich A9919
Glycine Applichem A1377
Zn(II)-acetate Applichem A4324
NaOH Applichem A1551
Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg) Sigma-Aldrich S0942
Costar half-area microtiter plate Thermo Scientific Corning 3690
micro reaction tubes Eppendorf 30120086
Microplate ELISA reader BioTek Synergy HT

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References

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受容体リガンドの相互作用の解離定数の決定法として elisa 法の滴定
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Eble, J. A. Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction. J. Vis. Exp. (132), e57334, doi:10.3791/57334 (2018).More

Eble, J. A. Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction. J. Vis. Exp. (132), e57334, doi:10.3791/57334 (2018).

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