Summary
Nous présentons ici une méthode électrofilage modifiés pour fabriquer des prothèses vasculaires PCL avec fibres épaisses et des pores dilatés et décrire un protocole d’évaluation du rendement en vivo dans un modèle de rat de remplacement de l’aorte abdominale.
Abstract
Nous présentons ici un protocole pour fabriquer la prothèse vasculaire macroporeux PCL et décrire un protocole d’évaluation en utilisant un modèle de rat de remplacement de l’aorte abdominale. Les greffons vasculaires électrofilées possèdent souvent relativement petits pores, limitent l’infiltration cellulaire dans les greffes, qui entravent la régénération et le remodelage des neo-artères. Dans cette étude, greffes vasculaires PCL avec fibres plus épaisses (5-6 µm) et de plus grands pores (~ 30 µm) ont été fabriqués en utilisant une technique de traitement modifié. La performance à long terme du greffon a été évaluée par l’implantation dans un modèle d’aorte abdominale chez le rat. Analyse de l’échographie a montré que les greffons restent brevets sans anévrisme ou sténose survenant même après 12 mois d’implantation. Structure macroporeuse amélioré la croissance cellulaire et donc promu tissu régénéré à 3 mois. Plus important encore, il n’y avait aucun signe de remodelage indésirables, tels que la calcification dans la paroi de la prothèse après 12 mois. Donc, les prothèses vasculaires électrofilées PCL avec macroporeux mis à jour le traitement tenir potentiels comme un substitut de l’artère pour l’implantation à long terme.
Introduction
Des greffons vasculaires constitués de polymères synthétiques sont largement utilisés en clinique pour le traitement des maladies cardiovasculaires (maladies cardiovasculaires). Malheureusement, dans le cas de prothèses vasculaires de petit diamètre (D < 6 mm) il n’existe aucun produit avec succès en raison de la faible perméabilité déclenchée par la vitesse d’écoulement sanguin réduit, qui conduit souvent à la thrombose, l’hyperplasie intimale et d’autres les complications1.
Génie tissulaire fournit une autre stratégie afin de réaliser la perméabilité à long terme et l’homéostasie basé sur un échafaud guidée vasculaire régénération et reconstruction. Dans le détail, la prothèse vasculaire, comme un modèle en trois dimensions, pourrait fournir support mécanique et structurelle conseils pendant la régénération des tissus vasculaires et l’influence des fonctions cellulaires, y compris l’adhésion cellulaire, migration, prolifération, et sécrétion de la matrice extracellulaire2. Jusqu'à présent, divers polymères synthétiques ont été évalués pour des applications dans l’ingénierie des tissus vasculaires. Parmi ces polymères, poly(ε-caprolactone) (PCL) a été intensivement étudiée en raison de la cellule bonne compatibilité et de la lente dégradation allant de plusieurs mois à deux ans3. Un rat aorte modèle4,5,6, greffes vasculaires PCL traitées par électrofilage exposées excellente intégrité structurale et perméabilité, invasion des cellules aussi bien que sans cesse accrue et une néovascularisation dans le paroi de la prothèse pendant 6 mois. Cependant, transformant tissus indésirables, y compris la régression des cellules et les capillaires et les calcifications, a également observé à des intervalles plus longs, jusqu'à à 18 mois.
Cellularisation du greffon vasculaire est un facteur clé déterminant la régénération tissulaire et remaniement7. Électrofilage, comme une technique polyvalente, a été largement employé pour la préparation des greffons vasculaires avec structure fibreuse-nano8. Malheureusement, la structure de pore relativement faible entraîne souvent une infiltration cellulaire insuffisante dans la prothèse vasculaire électrofilées, qui limite la régénération des tissus ultérieures. Pour résoudre ce problème, diverses techniques ont tenté d’augmenter la taille des pores et porosité globale, y compris le sel/polymère lessivage9,10, modification des appareils de collecteur, après le traitement par rayonnement laser11 , etc.. En fait, la structure des greffes d’électrofilées (y compris les fibres diamètre, la taille des pores et porosité) est étroitement liée à la transformation des conditions12,13. Pendant électrofilage, le diamètre de la fibre peut être facilement contrôlé en changeant les paramètres, tels que la concentration de la solution de polymère, tension, débit, etc.. 14 , 15, et par conséquent, la taille des pores et porosité ont été améliorées en conséquence.
Nous avons récemment rapporté une greffe d’électrofilées mis à jour le PCL avec structure macroporeuse (fibres de diamètre de 5 à 7 µm et pores de 30 à 40 µm). In vivo l’implantation en remplaçant l’aorte abdominale de rat a montré un taux élevé de perméabilité, ainsi que bonne régénération endothélialisation et muscle lisse à 3 mois post-opératoire16. Plus important encore, aucun tissu indésirable remodelage dont la régression de la calcification et cellule n’on observe même après un an de l’implantation.
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Protocol
L’utilisation des animaux d’expérimentation a été approuvée par l’Animal expériences éthique Comité de Nankai University et effectuée selon le Guide d’entretien et d’utilisation des animaux de laboratoire.
1. fabrication des greffes électrofilées PCL
NOTE : Ici, une technique d’électrofilage a été utilisée pour fabriquer les prothèses vasculaires.
- Préparer des solutions PCL de 25 % en poids et 10 % en poids, en dissolvant PCL dans un mélange de méthanol et le chloroforme, respectivement, (rapport de volume 1:5), à température ambiante (RT) pendant 12 h.
- Chargez la solution PCL dans une seringue en verre de 10 mL.
- Placer la seringue avec une aiguille de 21 G.
- Placez le mandrin en acier inox (2 mm de diamètre, 25 cm de longueur) sur l’instrument de collecte.
- Pour les greffes de fibres plus épaisses, utilisez la solution PCL de 25 % en poids, la distance de travail de 17 cm de la pointe de l’aiguille au collecteur, débit de 8 mL/h et la tension de 11 kV comme paramètres électrofilage. Pour les greffes de diluant-fibre, utiliser la solution PCL de 10 % en poids, distance de travail de 20 cm de l’extrémité de l’aiguille au collecteur, un débit de 2 mL/h et la tension de 18 kV comme paramètres électrofilage.
- Faire en sorte que les greffons obtenus sont placés dans le vide pendant la nuit pour enlever le solvant résiduel. Stériliser tous les instruments avant la procédure et de maintenir une technique aseptique tout au long.
- Avant l’implantation, désinfecter les greffons en l’immergeant dans 10 mL d’éthanol 75 % pendant 30 min et ensuite les exposant à la lumière UV durant la nuit.
- Mesures de taille de fibre et pore : calculer le diamètre de la fibre moyenne à l’aide de logiciels ImageJ basée sur l’analyse des images de microscopie électronique (SEM).
- Essais mécaniques des échafaudages :
- Couper les échafaudages tubulaires en sections de 3 mm de longueur à l’aide d’une lame de rasoir. Mesurer l’épaisseur des échafaudages à l’aide d’un micromètre.
- Placer les échafaudages tubulaires sur une machine d’essai de traction avec une capacité de charge de 100 N.
- Fixez les échafaudages avec une distance de 1 mm pince inter et tirez longitudinalement à raison de 10 mm/min jusqu'à la rupture. Mesurer la résistance à la traction et l’ultime allongement à la rupture. Calculer le module de Young de la zone linéaire initiale (jusqu'à 5 % de déformation) de la courbe contrainte-déformation.
2. modèle de l’Implantation d’aorte abdominale chez le rat
Remarque : Tous les matériaux et instruments utilisés en chirurgie sont stériles. Pendant l’intervention, assurez-vous que l’opérateur porte un masque de gaze et de gants stériles pour éviter les infections. S’assurer que la température ambiante est maintenue à 27-30 ° C pour maintenir la température du corps animal. Suivez les directives IACUC locales au sujet de l’analgésie.
- Utiliser des rats Sprague Dawley mâles pesant 240-270 g pour recevoir le greffon vasculaire. S’assurer que le rat a jeûné 24 h avant la chirurgie. Le jeûne des rats pendant 24 h vise à vide les fèces dans le tractus intestinal suffisamment, et ainsi élargir les horizons de l’opérateur.
- Saisir la base du cou du rat et garder sa tête vers le bas, introduire l’aiguille de springe dans la cavité abdominale du bas-ventre. Induire le rat pour l’anesthésie avec l’hydrate de chloral (330 mg/kg) par injection intrapéritonéale.
- Confirmer anesthetization adéquate en veillant à ce que le rat a assoupli les muscles et la respiration régulière. Placez le rat sous le microscope d’opération en position couchée.
- Appliquer pommade ophtalmique vétérinaire de vaseline sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie. Administrer l’anticoagulation (100 UI/kg) avec une solution physiologique héparinée (50 UI/mL) par injection dans la veine queue avant la chirurgie.
- Raser la fourrure dans la paroi abdominale antérieure à l’aide d’une lame de rasoir et nettoyer la peau à l’aide de la solution d’iode et de solution d’alcool médical.
- Effectuer une incision de laparotomie médiane avec des ciseaux chirurgicaux et veiller à ce que l’incision est environ 4-5 cm de long, puis l’exposer la cavité abdominale.
- Rétracter et envelopper les intestins de gaze imbibé d’une solution saline préférentiellement.
- Analysez soigneusement l’aorte abdominale.
- Identifier et ligaturer toutes les petites branches à l’aide de sutures de nylon monofilament 9-0.
- Fixer la partie isolée (jusqu'à 1 cm de longueur) de l’aorte à l’aide de deux clamps vasculaires. L’aorte peut rester cramponné pendant 20-30 min.
- Transect de l’aorte abdominale entre deux pinces à l’aide de micro-ciseaux pour créer les sites anastomotiques.
- Rincer les deux extrémités de l’aorte à l’aide de solution de sérum physiologique hépariné (50 UI/mL) pour enlever les résidus de sang.
- Décollez de l’adventice à l’aide de micro-ciseaux.
- Anastomose du greffon avec diamètre intérieur de 2 mm et 1 cm de longueur à l’aorte abdominale du rat avec un motif de huit suture à l’aide de sutures de nylon monofilament 9-0.
- Tout d’abord, construire des quatre anastomoses selon l’ordre de 9, 3, 12 et 06:00 postes du côté proximal, puis s’anastomosent les bords coupés en 4 points de suture entre deux sutures. Après avoir terminé la suture proximale, suture du côté distal par la même méthode.
Remarque : Chaque point est nécessaire pour assurer que le côté natif est légèrement incorporé dans la prothèse. - Enlever la pince distale pour permettre au sang de circuler dans le greffon, puis ôter la bride proximale.
- Appuyez sur les extrémités de la suture pour arrêter le saignement à l’aide d’une boule de coton stérile ou un petit tampon de gaze. Appuyez sur pendant environ 3 min, jusqu'à ce que de l’hémostase.
- Retourner les intestins dans la cavité abdominale.
- Rincer la cavité abdominale à l’aide de solution physiologique chaud avec gentamicine (320 U/mL).
- Cousez vers le haut de la paroi abdominale en utilisant une suture de Nylon de 3-0 dans la couche de muscle et de peau, respectivement.
- Placez le rat dans une cage propre et sec et mettre un coussin chauffant sous la cage pour maintenir la température du corps animal ; puis attendez que le rat récupérer de l’anesthésie. Assister à l’animal jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
- Après qu’il reprend conscience, mettre le rat dans une cage simple avec la nourriture et l’eau. S’applique à iode sur la plaie pour prévenir l’infection après la chirurgie. Retourner le rat à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce qu’il récupère complètement.
- Euthanasier des rats selon directives institutionnelles à des moments prédéterminés.
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Representative Results
Les greffons PCL ont été cultivés à 3 et 12 mois après l’opération et analysés par des techniques histologiques standard pour l’hématoxyline et éosine (H & E), trichrome de Masson, Verhoeff-van Gieson (LCA), Von Kossa et immunofluorescence souillant pour α-SMA, MYH, vWF et l’élastine. Les images histologiques ont été prises à l’aide d’un microscope vertical, et les images d’immunofluorescence ont été prises à l’aide d’un microscope fluorescence.
Toutes les données sont exprimées en moyenne ± SD Une à deux paires de Student t-test a été utilisé pour comparer les différences. Une valeur de p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.
Roman électrofilées PCL greffes avec structure optimisée, c'est-à-dire les fibres plus épaisses et les pores plus grands, ont été fabriqués avec succès dans cette étude. Images de SEM démontrent que le diamètre de la fibre moyenne est presque 8 fois plus épais chez les greffons mis à jour le (Figure 1 a) que dans les classiques on (Figure 1 b) (5,59 ± 0,67 % versus de 0,69 µm ± 0,54). Par conséquent, la taille des pores sans moyenne était nettement accrue, de ~ 4.66 µm en diluant-fibre greffon à ~ 40.88 µm dans la fibre épaisse-un. Coupes transversales ont montré distribution fibre homogène au sein de la paroi des greffons tubulaires dans les fibres plus épaisses (Figure 1–F) et les groupes de diluant en fibres (Figure 1–j’ai). L’épaisseur du mur était d’environ 400 à 500 µm. Les propriétés mécaniques des greffes ont été caractérisées par l’essai de traction, et la courbe contrainte-déformation typique ont été montrée dans la Figure 1. Les propriétés mécaniques des deux greffes étaient évidemment différentes en termes d’allongement. La valeur correspondante des greffons de fibres plus épaisses était environ 3 fois plus élevée que les greffons de diluant-fibre, suggérant la ténacité améliorée.
Les greffons vasculaires préparés (diamètre intérieur de 2,0 mm) et longueur de 1 cm (Figure 2 a) ont été implantés pour remplacer un segment de l’aorte abdominale natif chez le rat (Figure 2 b). À des moments prédéterminés, la perméabilité des greffons implantés a été examinée par échographie. Résultats ont montré que la plupart des greffes sont brevet (Figure 2). En outre, la vitesse d’écoulement de sang était similaire entre le greffon et comprimer les vaisseaux sanguins natifs à 12 mois. Greffes explantés conservé bonne morphologie sans anévrisme (Figure 2D), et aucune sténose ou thrombus ne peuvent être observées sur la surface luminale (Figure 2E).
Régénération tissulaire et la sécrétion d’ECM à 3 mois étaient encore évalués par des analyses histologiques. La coloration H & E a montré qu’une couche de tissu-neo a été formée à la lumière de la prothèse (Figure 3-H). En outre, la coloration du vWF montrent que la surface luminale est entièrement couverte par endothélium nouvellement formé (Figure 3 a), qui ressemble à celle de l’aorte native (Figure 3 b). Pendant ce temps plusieurs couches de cellules MYH-positives ont été organisées le long de la direction circonférentielle, indiquant la régénération des médias vasculaire (Figure 3–D). Synthèse de la matrice extracellulaire a été observée par Masson et LCA coloration, respectivement. Une quantité importante de collagène et d’élastine fibreuse pouvait être observée dans le greffon (Figure 3I–J, K–L), qui joue un rôle important dans la régénération vasculaire et le remodelage. Immunofluorescence souillant a encore montré que la structure de l’élastine a été alignée sur sa circonférence dans un modèle comme ça dans l’artère native (Figure 3E–F).
En outre, les tissus régénérées, y compris l’endothélium et maintenu le muscle lisse intégrés et ne pas régresser après 12 mois d’implantation (Figure 4 a–C). Plus important encore, il n’y avait aucun signe de calcification survenant dans la paroi de la prothèse basée sur le Von Kossa coloration (Figure 4).
Figure 1 : La structure et les propriétés mécaniques du greffon PCL. Images de SEM d’électrofilées PCL nattes avec des fibres plus épaisses (A) et (B) les fibres plus minces. Sections transversales de greffes tubulaires de fibres plus épaisses (D–F) et des greffes de diluant en fibres (G–j’ai). La courbe représentative de souche-stress est montrée en (C). Ces chiffres ont été modifiés de Zhao, et al. 16 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Implantation des greffons vasculaires dans un modèle d’aorte abdominale chez le rat. Prothèse vasculaire Electrospun PCL de 1 cm de longueur (A) a été chirurgicalement interposée dans l’aorte abdominale chez le rat (B). L’image de l’échographie a montré que la prothèse était brevet in vivo à 1 an (C). Des images montrent que la prothèse était bien intégrée avec adjacente aorte natif sans anévrisme (D), et la surface luminale est propre et exempt de thrombus (E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Régénération des tissus et des dépôts d’ECM dans les greffons explantés à 3 mois en comparaison de l’aorte native. Des images en coupe des greffes régénérées (A, Cet E) et l’artère native (B, Det F) ont été immunocolorées pour détecter les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et l’élastine. La coloration H & E montre la régénération des tissus dans les greffons explantés (G) par rapport à l’aorte native (H). Masson de coloration a révélé que la présence de collagène dans les greffes explantés (j’ai) et l’aorte native (J). Coloration de la LCA a révélé la présence d’élastine dans les greffes explantés (K) et l’aorte native (L). Ces chiffres ont été modifiés de Zhao, et al. 16 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’analyse histologique des greffons explantés à 12 mois. (A) H & E coloration a montré la régénération des tissus dans les greffons explantés. (B) l’endothélium a été immunomarquées par anticorps vWF. Muscle lisse (C) a été immunomarquées par anticorps α-SMA. La Calcification (D) a été évaluée par Von Kossa coloration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Infiltration de cellules est essentiel pour la régénération et remodelage de la prothèse vasculaire en vivo16. L’infiltration des cellules est souvent liée à des pores relativement faibles du greffon qui empêchent la migration de cellules dans la paroi de la prothèse. Pour remédier à cette difficulté, nous avons développé une méthode modifiée pour préparer les greffons vasculaires d’électrofilées PCL avec structure de gros pores. Dans le détail, la taille des pores a augmenté avec l’augmentation de l’épaisseur de la fibre qui pourrait être facilement contrôlée par les paramètres de traitement. Les résultats ont montré que les cellules de l’hôte pourraient facilement s’infiltrer dans le mur de cette prothèse macroporeux après l’implantation in vivo et la cellularité est resté à un niveau relativement élevé sans régression évidente cellule à post-chirurgie de 12 mois.
Artère Native compose principalement de trois couches, c'est-à-dire, l’endothélium, les médias de tunica et adventice. L’endothélium, comme une interface anti-thrombogène, joue un rôle essentiel dans le maintien de la perméabilité à long terme du vaisseau sanguin. Dans notre étude, endothélialisation complet sur le greffon a été observée à 3 mois. En outre, les médias de tunica, constitué de plusieurs couches de cellules musculaires lisses sont très importants en fonction des vaisseaux sanguins de régulation et en fournissant des propriétés mécaniques appropriées de l’artère. La présente étude a révélé que l’électrofilées PCL greffes avec fibres épaisses et grand pore fortement amplifiée la régénération des médias de tunica fonctionnelle. En outre, la structure du muscle régénérée est semblable à celle des médias indigènes tunica. Immunofluorescence souillant a montré plusieurs couches de cellules MYH+ distribués au sein du réseau d’élastine, reflétant le phénotype contractile des cellules musculaires lisses sur sa circonférence. Plus important encore, régénéré tissus (muscle lisse et endothélium) gardées intactes et il n’y avait aucune retouche indésirables même après 12 mois en raison du déséquilibre entre ECM de synthèse et de dégradation.
La calcification est toujours un problème majeur lié à des implants cardiovasculaires, en particulier dans la prothèse vasculaire. Les cellules de muscle lisse vasculaire (CMLV) perdent leur phénotype original et expérience trans-différenciation vers la direction d’osteochondrogenic, conduisant à la minéralisation ectopique pendant le processus de calcification vasculaire. Notre étude a montré qu’il n’existe aucun dépôt de calcium qui se produisent au sein de la paroi de la prothèse même après 12 mois d’implantation. Les principales raisons de la calcification inhibée dans la prothèse vasculaire macroporeuse comprennent : (1) la structure du greffon macroporeuse favorise le métabolisme, tels que l’échange d’ions entre les cellules et le sang ; (2) les indices physiques de la structure du greffon pourraient réglementer ou inhiber la différenciation de la CMLV dans les ostéoblastes1, une infiltration cellulaire bon (3) dans les grands pores favorise la sécrétion de l’ECM et inhibe sa dégradation qui déclenchera calcification17et (4) CMLV normal ou fonctionnelle risquent d’empêcher les dépôts de calcium18.
En résumé, l’évaluation à long terme des greffons vasculaires de PCL macroporeuse électrofilées dans le modèle de rat aorte abdominale donne un aperçu important de défis potentiels des greffons vasculaires dégradables, qui orientera les recherches suivantes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier contradictoires.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financièrement par projets NSFC (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 et 81401534).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000) | Sigma | 704067 | |
| Methanol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1060 | |
| Alcohol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1083 | |
| Chloroform | Tianjin Chemical Reagent Company | A1007 | |
| Sucrose | Tianjin Fengchuan Company | 2296 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Sprague Dawley rats | Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences | ||
| Normal saline | Hebei Tiancheng Pharmaceutical company | ||
| Chloral hydrate | Tianjin Ruijinte chemical company | 2223 | |
| Heparin sodium Injection | Tianjin Biochem Pharmaceutical company | ||
| Gentamycin Sulfate Injection | Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company | ||
| Mouse anti-α-SMA primary antibody | Abcam | ab7817 | |
| Mouse anti-smooth MYH primary antibody | Abcam | ab683 | |
| Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody | Abcam | ab23748 | |
| Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody | Abcam | ab6994 | |
| Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150117 | |
| Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150077 | |
| 5% normal goat serum | Zhongshan Golden bridge | ZLI9022 | |
| Hematoxylin and eosin (H&E) | Beijing leagene biotech | DH0006 | |
| Masson's trichrome | Beijing leagene biotech | DC0032 | |
| Verhoeff-van Gieson (VVG) | Beijing leagene biotech | DC0059 | |
| Von Kossa | Beijing leagene biotech | DS0003 | |
| Surgical sutures needles with thread,3-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | G3002b | |
| Surgical sutures needles with thread,9-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | H901 |
References
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