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Biology

쥐 모델에 최적화 된 구조를 가진 Electrospun 혈관 이식 술의 이식

doi: 10.3791/57340 Published: June 27, 2018

Summary

여기, 우리는 PCL 두꺼운 섬유와 큰 모 공, 혈관 이식 조작 및 복 부 대동맥 교체의 쥐 모델에서 vivo에서 성능을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 하는 수정 된 전기 방법을 제시.

Abstract

여기, 우리는 macroporous PCL 혈관 이식 조작 및 복 부 대동맥 교체의 쥐 모델을 사용 하 여 평가 프로토콜을 설명 하는 프로토콜을 제시. Electrospun 혈관 이식 자주는 이식으로 세포 침투를 제한 하 고 재생성 하 고 개장 하는 신 동맥의 방해는 상대적으로 작은 구멍을가지고 있다. 이 연구에서는 두꺼운 섬유 (5-6 µ m)와 더 큰 모 (~ 30 µ m) PCL 혈관 이식 수정된 처리 기술을 사용 하 여 조작 했다. 이식의 장기 성능 쥐 복 부 대동맥 모델에 주입에 의해 평가 되었다. 초음파 분석은 이식 남아 동맥 또는 이식의 12 개월 후에 발생 하는 협 착 증 없이 특허를 보여주었다. Macroporous 구조는 셀 ingrowth를 개선 하 고 따라서 3 개월에서 재생성 조직 승진. 더 중요 한 것은, 12 개월 후 이식 벽 내 석 회화 등 불리 한 개장의 아무 표시도 없었다. 따라서, 처리 하는 수정 된 macroporous와 electrospun PCL 혈관 이식 장기 이식에 대 한 동맥 대체 될 잠재적인 개최.

Introduction

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합성 중합체에서 만든 혈관 이식 심장 혈관 질병 (CVDs)의 치료를 위한 병원에 널리 활용 됩니다. 불행히도, 작은 직경의 혈관 이식의 경우 (D < 6 m m) 사용할 수 없습니다 종종 이르게 혈전 증, 내 증식, 그리고 다른 감소 된 혈액 흐름 속도 의해 발생 하는 낮은 patency 성공적인 제품 있다 합병증1.

조직 공학 장기 patency 및 항상성 비 계 기반 혈관 재생 및 재건에 따라 실현 하는 대체 전략을 제공 합니다. 자세히, 혈관 이식, 3 차원 서식 파일로 제공할 수 있는 기계적인 지원 및 혈관 조직 및 기능의 영향 세포, 세포 접착, 이동, 확산를 포함 하 여 재생 하는 동안 구조 지도 기질2분 지금까지, 다양 한 합성 폴리머 혈관 조직 공학에서 응용 프로그램에 대 한 평가. 이러한 고분자 중 poly(ε-caprolactone) (PCL)가 집중적으로 조사 좋은 셀 호환성 및 느린 저하 몇 개월에서 2 년3에 이르기까지. 쥐 대동맥 모델4,,56, PCL 혈관 이식 전기 처리 우수한 구조적 무결성 및 patency, 뿐만 아니라 지속적으로 증가 세포 침입과에서 neovascularization 전시는 최대 6 개월까지 이식 벽입니다. 그러나, 불리 한 조직 세포와 모세 혈관의 석 회화, 회귀를 포함 하 여 리 모델링 또한 관찰 되었다 더 긴 timepoints에서 최대 18 개월.

Cellularization 혈관 이식의 조직 재생을 결정 하 고7을 remolding 핵심 요소입니다. 전기, 다양 한 기법으로는 널리 고용 나노 섬유 구조8혈관 이식의 준비에 대 한. 불행히도, 상대적으로 작은 기 공 구조는 종종 후속 조직 재생을 제한 하는 electrospun 혈관 이식에 부족 한 세포 침투를 끈다. 이 문제를 해결 하려면 다양 한 기술은 시도 기 공 크기와 전반적인 다공성,9,10, 수집 장치, 레이저 방사선11에 의해 치료 후의 수정 leaching 소금/폴리머를 포함 하 여 증가 , 등등. 사실, electrospun 이식 (를 포함 하 여 섬유 직경, 기 공 크기 및 다공성)의 구조는 밀접 하 게 관련이 처리 조건12,13. 중 전기, 섬유 직경 폴리머 솔루션, 흐름 속도, 전압 의 농도 같은 매개 변수를 변경 하 여 쉽게 제어할 수 있습니다. 14 , 15, 그러므로, 숨 구멍 크기와 다공성 향상 되었습니다 따라와.

우리는 최근 macroporous 구조 (5-7 µ m의 직경 및 30-40 µ m의 모 섬유) 수정된 PCL electrospun 이식을 했다. Vivo에서 쥐 복 부 대동맥을 대체 하 여 이식 3 개월 후 수술16patency, 좋은 endothelialization, 부드러운 근육 중생의 높은 비율을 보였다. 더 중요 한 것은, 아니 불리 한 조직의 석 회화 및 셀 회귀를 포함 하 여 개장 이식의 1 년 후에 관찰 될 수 있었다.

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Protocol

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실험 동물의 사용은 동물 실험 윤리 위원회의 난카이 대학에 의해 승인 하 고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 실시.

1입니다. Electrospun PCL 이식의 제조

참고: 여기, 전기 기술 혈관 이식 조작에 이용 되었다.

  1. 각각, 메탄올과 클로 프롬의 혼합물에서 PCL을 용 해 하 여 25 wt %와 10 wt %의 PCL 솔루션을 준비 (1:5 볼륨 비율), 실 온 (RT) 12 시간에서.
  2. 10 mL 유리 주사기를 PCL 솔루션을 로드 합니다.
  3. 21-G 바늘 주사기를 놓습니다.
  4. 컬렉션 악기에 스테인리스 스틸 맨 드릴 (2 mm 직경, 길이 25 c m)를 놓습니다.
  5. 두꺼운 섬유 이식에 대 한 사용 하 여 25 wt %의 PCL 솔루션, 수집기 바늘 끝에서 17 cm의 거리, 8 mL/h의 유량 및 11의 전압 전기 매개 변수로 kV. 얇은 섬유 이식 10 wt %, 수집기에 바늘 끝에서 20 cm의 거리, 2 mL/h의 유량 및 18의 전압의 PCL 솔루션 사용 전기 매개 변수로 kV.
  6. 얻은 이식 하룻밤 잔여 용 매를 제거 하는 진공 상태에서 배치 됩니다 확인 하십시오. 소독 절차 전에 모든 악기 고 무 균 기술을 통해 유지 합니다.
  7. 주입 전에 이식 30 분 75% 에탄올 10 ml에서 그들을 immersing 및 다음 하룻밤 UV 빛에 노출에 의해 소독.
  8. 섬유 및 기 공 크기 측정: 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 이미지에 따라 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 평균 섬유 직경을 계산.
  9. 기계 장비의 테스트:
    1. 면도날을 사용 하 여 길이 3 m m 섹션으로 관 건설 기계를 절단. 건설 기계는 마이크로미터를 사용 하 여 두께 측정 합니다.
    2. 100 북 아의 부하 용량 인장 테스트 기계에 관 건설 기계를 배치
    3. 파열까지 1mm 간 클램프 거리와 풀 10 m m/min의 속도로 경도 건설 기계 클램프. 인장 강도 및 파단 궁극적인 측정 합니다. 초기 선형 영역에서 탄성 계수를 계산 (최대 5% 변형) 응력-변형 곡선의.

2. 쥐 복 부 대동맥 이식 모델

참고: 모든 재료와 수술에 사용 되는 계기는 살 균. 수술 동안 거 즈 마스크와 감염을 피하기 위해 멸 균 장갑을 착용 하는 연산자 확인 하십시오. 실내 온도 동물 체온을 유지 하기 위해 27-30 ° C에서 유지 됩니다 확인 하십시오. 진통에 관한 현지 IACUC 지침을 따르십시오.

  1. 남성 Sprague Dawley 쥐 혈관 이식의 수신자로 240-270 g의 무게를 사용 합니다. 쥐 수술 하기 전에 24 시간 금식은 확인 합니다. 24 시간 단식 쥐의 목표는 빈 창 자에서 대변 충분히, 그로 인하여 확장 연산자의 수평선.
  2. 쥐의 백 목 잡고 아래쪽으로 머리를 유지, 낮은 복 부의 복 부 구멍으로 springe 바늘을 삽입. 복 주사에 의해 chloral 하이드 레이트 (330 mg/kg)과 마 취에 대 한 쥐를 유도.
  3. 쥐는 근육과 꾸준히 호흡을 완화 했다 함으로써 적절 한 anesthetization를 확인 합니다. 운영 현미경 쥐 부정사 위치에 놓습니다.
  4. 바 셀 린 안과 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다. 수술 전에 꼬리 정 맥 주입에 의해 heparinized 생리 염 분 해결책 (50 UI/mL)와 anticoagulation (UI/100kg)을 관리 합니다.
  5. 면도칼 블레이드를 사용 하 여 전방 복 벽에 털을 면도 하십시오 그리고 요오드 솔루션 및 의료 알코올 솔루션을 사용 하 여 피부를 청소.
  6. 수술가 위로 중간 개복 술 절 개를 수행 하 고 절 개 길이, 약 4-5 m 인지 확인 다음 복 부 구멍을 노출.
  7. 철회 하 고 우선적으로 생리 식 염 수를 적신 거 즈로 내장을 포장.
  8. 신중 하 게 복 부 대동맥 해 부.
  9. 식별 하 고 9-0 monofilament 나일론 봉합을 사용 하 여 모든 작은 가지를 선.
  10. 격리 된 섹션을 클램프 (길이 최대 1 c m) 2 개의 혈관 클램프를 사용 하 여 대동맥의. 대동맥 20-30 분 채워 남아 있을 수 있습니다.
  11. Anastomotic 사이트를 만들 마이크로-가 위를 사용 하 여 두 개의 클램프 사이의 복 부 대동맥 transect
  12. 잔여 혈액을 제거 하 heparinized 염 (UI/50ml) 솔루션을 사용 하 여 대동맥의 두 끝을 플러시.
  13. 마이크로-가 위를 사용 하 여 adventitia 벗기다.
  14. 9-0 monofilament 나일론 봉합을 사용 하 여 숫자의 8 봉합 패턴 2 m m 내경 및 쥐의 복 부 대동맥에 길이 1 cm 이식 anastomose.
  15. 첫째, 9, 3, 12, 및 근 위 측에 6 시 위치 순서 대로 4 개의 anastomoses을 구성 다음 두 봉합 사이 4 바늘 컷된 가장자리 anastomose. 근 위 봉합을 마치고 같은 방법으로 원심 측을 봉합.
    참고: 모든 스티치는 네이티브 쪽은 약간은 이식에 포함 된 보장 합니다.
  16. 이식, 흘러 혈액을 있도록 원심 클램프 다음 인접 클램프를 제거.
  17. 멸 균 면봉 또는 스폰지 작은 거 즈를 사용 하 여 출혈을 막으려고 봉합 끝을 누릅니다. 약 3 분, hemostasis 때까지 누릅니다.
  18. 복 부 구멍으로 내장을 반환 합니다.
  19. 플러시 gentamicin (320 U/mL)와 따뜻한 생리 식 염 수 솔루션을 사용 하 여 복 부 구멍.
  20. 각각 근육과 피부 층에 3-0 나일론 봉합 사를 사용 하 여 복 벽을 바느질.
  21. 깨끗 하 고 건조 감 금 소에 쥐를 놓고 동물 체온; 유지 케이지 난방 패드를 넣어 마 취에서 회복 하기 위해 쥐를 기다립니다. Sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 동물에 참석.
  22. 후 의식 회복, 음식과 물을 함께 단일 케이지에 쥐를 넣어. 수술 후 감염을 방지 하기 위해 상처에 요오드를 적용 합니다. 그것은 완벽 하 게 복구 될 때까지 다른 동물의 회사에는 쥐를 반환 합니다.
  23. 미리 정해진된 시간 지점에서 기관 지침에 따라 쥐 안락사

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Representative Results

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PCL 이식 했다 explanted 3 개월 및 12 개월에서 post-operatively 및 hematoxylin에 오신 (H & E), 표준 조직학 기술에 의해 trichrome Masson, 분석 Verhoeff 반 Gieson (VVG), 폰 Kossa, 면역 형광 α-SMA를 위한 얼룩 MYH, vWF, 그리고 엘라 스 틴입니다. 조직학 이미지 똑바로 현미경을 사용 하 여 찍은 그리고 면역 형광 이미지 fluorescence 현미경을 사용 하 여 찍은.

모든 데이터는 ± sd. 의미를 표현 했다 학생의 t쌍 두 꼬리-시험 차이 비교 하는 데 사용 되었다. P 의 값 < 0.05 통계적으로 간주 되었다.

최적화 된 구조, 즉, 두꺼운 섬유 및 더 큰 숨 구멍, 소설 electrospun PCL 이식이이 연구에 성공적으로 조작 했다. SEM 이미지 시연 평균된 섬유 직경은 약 8 시간에는 기존 보다 수정된 이식 (그림 1A)에서 두꺼운 하나 (그림 1B) (5.59 ± 0.69 ± 0.54 µ m 대 0.67). 그 결과, 평균된 기 공 크기는 현저 하 게 증가에서 ~를 얇은 섬유 이식에 4.66 µ m ~ 40.88 µ m는 두꺼운 섬유 하나에. 횡단면 두꺼운 섬유 (그림 1D-F)와 (그림 1G-) 얇은 섬유 그룹 관 이식의 벽 내의 균질 섬유 분포를 보였다. 벽 두께 대해서는 400-500 µ m. 이식의 기계적 성질은 인장 테스트, 특징 그리고 일반적인 응력-변형 곡선 그림 1C에 표시 했다. 2 이식의 기계적 특성 신장 면에서 분명히 달랐다. 두꺼운 섬유 이식의 해당 값 약 3 배 이상 향상 된 인 성 제안 얇은 섬유 이식 했다.

준비 된 혈관 이식 (안 직경 2.0 m m)와 1 cm의 길이 (그림 2A) 대체 하는 라트 (그림 2B) 네이티브 복 부 대동맥의 세그먼트를 이식 했다. 미리 정해진된 시간 지점에서 이식된 이식의 patency 초음파에 의해 시험 되었다. 결과 이식의 대부분 특허 것으로 나타났다 (그림 2C). 또한, 혈액의 흐름의 속도 12 개월에 이식 및 인접 한 네이티브 혈관 사이 유사 했다. Explanted 이식 없이 동맥 (그림 2D), 좋은 형태를 유지 하 고 협 착 증 또는 혈전 luminal 표면 (그림 2E)에 관찰 될 수 있었다.

조직 재생 및 ECM 분 비 3 개월 더 조직학 분석으로 평가 됐다. H & E 염색 (그림 3G-H) 이식의 루멘에 네오-조직 계층 형성 되었다 보여주었다. 또한, vWF 얼룩이 보여 luminal 표면 닮은 네이티브 대동맥 (그림 3B)의 새로 형성된 된 피 (그림 3A)에 의해 완전히 덮여 있었다. 한편 여러 계층 MYH 긍정적인 세포의 혈관 미디어 (그림 3C-D)의 재생을 나타내는 원주 방향을 따라 조직 되었다. 세포 외 기질 합성 Masson VVG 얼룩, 각각에 의해 관찰 되었다. 섬유 엘라 스 틴과 콜라겐의 상당한 금액 혈관 재생 및 리 모델링에서 중요 한 역할 (그림 3I-J, K-L), 이식에서 관찰 될 수 있었다. 엘라 스 틴의 구조는 원주에서 정렬 패턴 그런 네이티브 동맥 (그림 3E-F)에 보였다 추가 면역 형광 염색 법.

또한, 피와 부드러운 근육 유지를 포함 한 재생된 조직 통합 및 주입 (그림 4A-C)의 12 개월 후 복귀 하지 않았다. 더 중요 한 것은, 석 회화 (그림 4D) 얼룩 Von Kossa에 따라 이식 벽 내 발생의 아무 표시도 없었다.

Figure 1
그림 1 : 구조 및 PCL 이식의 기계적 성질. Electrospun의 SEM 이미지 PCL 두꺼운 섬유 (A)와 (B) 얇은 섬유 매트. 두꺼운 섬유 관 이식 (D-F) 및 (G-) 얇은 섬유 이식의 횡단면. 대표 긴장-긴장 곡선 (C)에 표시 됩니다. 이러한 수치 자오, 에서 수정 된 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 쥐 복 부 대동맥 모델에서 혈관 이식 술의 이식. 길이 (A)에서 1 cm의 Electrospun PCL 혈관 이식 수술 쥐 (B)에서 복 부 대동맥에 interposed 이었다. 초음파 이미지는 이식 했다 특허 vivo에서 1 년 (C)에서 나타났다. Stereomicroscopic 이미지 표시는 이식 했다 인접 한 네이티브 대동맥 동맥 (D) 없이 잘 통합 luminal 표면은 깨끗 하 고 혈전 (E)의 무료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 조직 재생 및 네이티브 대동맥에 비해 3 개월 explanted 이식에 ECM의 증 착. 재생성 된 이식 (A, C, E) 및 (B, DF) 네이티브 동맥의 단면 이미지 내 피 세포, 평활 근 세포, 그리고 엘라 스 틴을 검출 하기 위하여 immunostained를 했다. H & E 염색 네이티브 대동맥 (H)에 비해 조직 재생 explanted 이식 (G)에 표시 됩니다. Masson의 얼룩이 지 계시 하는 () explanted 이식에 네이티브 대동맥 (J) 콜라겐의 존재. VVG 얼룩 explanted 이식 (K)에 네이티브 대동맥 (L) 엘라 스 틴의 존재를 보여주었다. 이러한 수치 자오, 에서 수정 된 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 12 개월 explanted 이식의 조직학 분석. (A) H & E 얼룩 했다 explanted 이식에서 조직 재생. (B) 피 vWF 항 체에 의해 immunostained 이었다. (C) 평활 근 α-SMA 항 체에 의해 immunostained 이었다. (D) 석 회화 Von Kossa 얼룩에 의해 평가 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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셀 침투는 중생에 대 한 중요 하 고16 vivo에서혈관 이식의 개장 이다. 제한 된 셀 침투는 종종 이식 벽으로 세포의 이동 방해는 이식의 상대적으로 작은 구멍 관련이 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 우리는 큰 기 공 구조 electrospun PCL 혈관 이식 준비 하 수정된 방법을 개발. 세부 사항에, 기 공 크기는 쉽게 처리 매개 변수에 의해 제어 될 수 있는 섬유 두께의 증가 함께 증가. 결과는 호스트 세포 vivo에서 이식 후이 macroporous 이식의 벽에 쉽게 침투 수와 cellularity 수술 12 개월 후에 명백한 셀 회귀 하지 않고 상대적으로 높은 수준에서 유지 했다.

네이티브 동맥 주로 이루어져 있다 3 개의 층, 즉, 내 피, tunica 매체, 및 adventitia. 피 안티 thrombogenic 인터페이스, 혈관의 장기 patency 유지 하는 중요 한 역할을 재생 합니다. 우리의 연구는 이식에 전체 endothelialization 3 개월에서 관찰 되었다. 또한, 부드러운 근육 세포의 여러 레이어로 구성 된 tunica 매체 동맥의 적절 한 기계적 특성을 제공 하 고 혈관 기능 조절에 매우 중요 하다. 현재 연구는 electrospun PCL 두꺼운 섬유와 이식 큰 기 공 현저 하 게 향상 된 기능 tunica 매체의 재생 밝혔다. 게다가, 재생성 된 부드러운 근육의 구조는 네이티브 tunica 매체 비슷합니다. 면역 형광 염색 원주 부드러운 근육 세포의 수축 성 표현 형을 반영 하는 엘라 스 틴 네트워크 내에서 분산 MYH+ 세포의 여러 계층으로 나타났다. 더 중요 한 것은, 조직 (내 피 및 평활 근) 그대로 유지를 재생성 하 고 ECM 합성 저하 사이의 불균형으로 인해 12 개월 후에 아무 불리 한 개장 했다.

석 회화는 여전히 특히 혈관 이식에서에서의 심혈 관 임 플 란 트와 관련 된 주요 문제 이다. 혈관 평활 근 세포 (VSMCs) 그들의 원래 표현 형을 잃게 되 고 혈관 석 회화의 과정에서 소성 강화로 이어지는 osteochondrogenic 방향으로 트랜스-차별화를 경험. 우리의 연구는 없는 칼슘 증 착 이식의 12 개월 후에 이식 벽 내에서 발생 했다 보여주었다. 매크로 다공성 혈관 이식에 금된 석 회화에 대 한 주요 이유는: (1) 매크로 다공성 이식의 구조 세포와 혈액; 사이 이온 교환 등 신진 대사를 촉진 (2) 이식 구조의 물리적 단서 수 규제 또는 osteoblast1에 VSMC의 분화를 억제, 큰 숨 구멍에서 (3) 좋은 세포 침투 ECM의 분 비를 촉진 하 고 일으킬 것 이다 그것의 저하를 억제 석 회화17, 그리고 (4) 정상 또는 기능 VSMCs18칼슘 증 착 방지 하기 위해 가능성이 있다.

요약 하자면, 쥐 복 부 대동맥 모델에서 매크로 다공성 electrospun PCL 혈관 이식의 장기 평가 다음과 같은 연구를 직접 것입니다 분해성 혈관 이식의 잠재적인 문제에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 합니다.

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Disclosures

저자 아무 충돌 금융 관심 있다.

Acknowledgments

이 작품은 NSFC 프로젝트 (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699, 및 81401534)에 의해 재정적으로 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000) Sigma 704067
Methanol Tianjin Chemical Reagent Company 1060
Alcohol Tianjin Chemical Reagent Company 1083
Chloroform Tianjin Chemical Reagent Company A1007
Sucrose Tianjin Fengchuan Company 2296
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
Sprague Dawley rats Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences
Normal saline Hebei Tiancheng Pharmaceutical company
Chloral hydrate Tianjin Ruijinte chemical company 2223
Heparin sodium Injection Tianjin Biochem Pharmaceutical company
Gentamycin Sulfate Injection Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company
Mouse anti-α-SMA primary antibody Abcam ab7817
Mouse anti-smooth MYH primary antibody Abcam ab683
Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody Abcam ab23748
Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody Abcam ab6994
Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488) Invitrogen ab150117
Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488) Invitrogen ab150077
5% normal goat serum Zhongshan Golden bridge ZLI9022
Hematoxylin and eosin (H&E) Beijing leagene biotech DH0006
Masson's trichrome Beijing leagene biotech DC0032
Verhoeff-van Gieson (VVG) Beijing leagene biotech DC0059
Von Kossa Beijing leagene biotech DS0003
Surgical sutures needles with thread,3-0 silk Shanghai Jinhuan medical supplies company G3002b
Surgical sutures needles with thread,9-0 silk Shanghai Jinhuan medical supplies company H901

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References

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쥐 모델에 최적화 된 구조를 가진 Electrospun 혈관 이식 술의 이식
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Qin, K., Wu, Y., Pan, Y., Wang, K., Kong, D., Zhao, Q. Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model. J. Vis. Exp. (136), e57340, doi:10.3791/57340 (2018).More

Qin, K., Wu, Y., Pan, Y., Wang, K., Kong, D., Zhao, Q. Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model. J. Vis. Exp. (136), e57340, doi:10.3791/57340 (2018).

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