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Neuroscience

चूहों के बर्ताव में हिप्पोकैम्पस थीटा दोलनों की Optogenetic Entrainment

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57349
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2
1Systems Neurophysiology Research Group, Institute of Clinical Neuroscience and Medical Psychology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Behavioural Neurodynamics Group, Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP)/ NeuroCure Cluster of Excellence, 3Neuronal Circuits and Behavior Research Group, Max Planck Institute for Metabolism Research

Summary

हम चूहों व्यवहार में हिप्पोकैम्पस थीटा दोलनों (5-10 हर्ट्ज) के चुनिंदा जोड़तोड़ के लिए optogenetics और electrophysiological रिकॉर्डिंग के उपयोग का वर्णन । ताल entrainment की प्रभावकारिता स्थानीय क्षेत्र क्षमता का उपयोग करते हुए नजर रखी है. दृक्-और pharmacogenetic अवरोध का एक संयोजन हिप्पोकैम्पस तुल्यकालन के efferent readout पते ।

Abstract

के संबंधों पर व्यापक डेटा तंत्रिका नेटवर्क दोलनों के व्यवहार और मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन निर्वहन के संगठन के लिए नए उपकरणों के लिए कॉल चुनिंदा मस्तिष्क लय में हेरफेर करने के लिए. यहाँ हम हिप्पोकैम्पस थीटा दोलनों (5-10 हर्ट्ज) चूहों बर्ताव करने में उच्च निष्ठा नियंत्रण के लिए extracellular इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ प्रोजेक्शन-विशिष्ट optogenetics के संयोजन एक दृष्टिकोण का वर्णन. optogenetic entrainment की विशिष्टता channelrhodopsin-2 (ChR2) के औसत दर्जे का GABAergic कोशिकाओं की septal जनसंख्या को लक्षित करके हासिल की है, महत्वपूर्ण हिप्पोकैम्पस थीटा दोलनों की पीढ़ी में शामिल है, और एक स्थानीय सिंक्रनाइज़ सक्रियण के एक सबसेट के निरोधात्मक septal afferents में हिप्पोकैम्पस । optogenetic ताल नियंत्रण की प्रभावकारिता CA1 क्षेत्र के लेमिना भर में स्थानीय क्षेत्र क्षमता (LFP) के एक साथ निगरानी द्वारा सत्यापित किया जाता है और/ इस आसानी से लागू करने की तैयारी का उपयोग हम थीटा दोलनों की प्रेरण के लिए विभिंन optogenetic उत्तेजना प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता दिखाने के लिए और उनके आवृत्ति और नियमितता के हेरफेर के लिए । अंत में, प्रक्षेपण के साथ थीटा ताल नियंत्रण का एक संयोजन विशेष अवरोध efferent क्षेत्रों द्वारा हिप्पोकैम्पस तुल्यकालन के विशेष पहलुओं के readout पते ।

Introduction

स्तनधारियों में न्यूरॉन गतिविधि नेटवर्क दोलनों, जो के भीतर और मस्तिष्क क्षेत्रों1,2,3,4के बीच जानकारी हस्तांतरण सहायता द्वारा समंवित है । मस्तिष्क लय ultrafast करने के लिए (> २०० हर्ट्ज) आवृत्तियों बहुत धीमी (< ०.८ हर्ट्ज) से लेकर दोलनों शामिल हैं. सबूत की एक बड़ी शरीर विविध मस्तिष्क कार्यों में अनुभूति5,6,7,8,9,10 सहित नेटवर्क दोलनों की भागीदारी का समर्थन करता है , जन्मजात व्यवहार11,12 के साथ ही पार्किंसंस रोग और मिर्गी13,14,15जैसे neuropsychiatric विकारों । चयनात्मक और अस्थाई नेटवर्क दोलनों के प्रयोगात्मक हेरफेर के लिए सटीक तरीके इसलिए तुल्यकालन के शारीरिक रूप से प्रशंसनीय मॉडल के विकास के लिए आवश्यक है और व्यवहार के साथ कारण संबंध स्थापित करने के लिए ।

नेटवर्क तुल्यकालन विभिंन जैविक सब्सट्रेट और प्रक्रियाओं, आयन चैनलों की आणविक पहचान और उनके कैनेटीक्स उत्तेजित और नेटवर्क कनेक्टिविटी के neuromodulation से लेकर द्वारा मध्यस्थता है । लय जनरेटर16 के जैविक डिजाइन कई मस्तिष्क लय के लिए पता चला गया है, जिनमें से अलग पहलुओं (जैसे, आवृत्ति, आयाम) अक्सर अलग सेल प्रकार और नेटवर्क की गतिशीलता के बारे में लाया जाता है । उदाहरण के लिए, प्रमुख कोशिकाओं के सोमता को लक्षित निरोधात्मक न्यूरॉन्स आवृत्ति बैंड और मस्तिष्क क्षेत्रों में सबसे महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं17,18, थीटा सहित19,20, गामा20 , 21, और तरंग (140-200 हर्ट्ज)22 दोलनों. बारी में, दूर कोशिकाओं के चरण तुल्यकालन, जो ंयूरॉंस की गोलीबारी रीसेट करता है पिरामिड कोशिकाओं के मजबूत फ़ीड आगे संकेतन द्वारा सुनिश्चित किया जाता है । दोलनों का एक महत्वपूर्ण पैरामीटर, सिंक्रनाइज़ की गई न्यूरॉन जनसंख्या का आकार, बारीकी से मापा LFP दोलन के आयाम से संबंधित है और, के लिए तेजी से दोलनों के लिए, पर उत्तेजक ड्राइव पर निर्भर करता है2न्यूरॉन्स. इसके विपरीत, धीमी दोलनों, डेल्टा और थीटा लय की तरह, लंबी दूरी के प्रवेश छोरों द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं, cortico द्वारा गठित-thalamic23,24 और हिप्पोकैम्पस-औसत दर्जे का septal अनुमानों25, 26,27, क्रमशः । इस तरह के सर्किट में दोलनों के बारे में संकेत प्रचार में देरी, उत्तेजित प्रतिक्रियाओं, और भाग लेने वाले कोशिकाओं में उनकी आवृत्ति वरीयता की बातचीत द्वारा लाया जाता है28,29,30, 31 , ३२. निरोधात्मक अनुमानों से GABAergic parvalbumin (पीवी)-हिप्पोकैम्पस25,३३, parahippocampal क्षेत्रों और entorhinal प्रांतस्था26 में न्यूरॉन्स के लिए औसत दर्जे का पट (एमएस) के सकारात्मक कोशिकाओं रहे हैं औसत दर्जे का लौकिक पालि में थीटा दोलनों की पीढ़ी के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, नेटवर्क दोलनों और ंयूरॉंस तुल्यकालन के शारीरिक तंत्र एक वास्तविक समय परिशुद्धता के साथ optogenetics का उपयोग कर हेरफेर किया जा सकता है ।

हिप्पोकैम्पस और cortical दोलनों में इन विट्रो३४,३५,३६,३७,३८ के अध्ययन के लिए कक्ष प्रकार-विशिष्ट optogenetic जोड़तोड़ लागू किया गया है और vivo में30,३९,४०,४१,४२,४३,४४,४५, सहित फंक्शनल जांच के गामा5,12,३६,४६,४७,४८,४९,५०, ५१,५२ और तरंग दोलनों४०,५३,५४ और सो धुरीों५५,५६। हाल ही में हम एमएस, हिप्पोकैम्पस थीटा ताल की पीढ़ी के लिए एक महत्वपूर्ण क्षेत्र में एक Cre-निर्भर ChR2 वायरस, PV-Cre चूहों की व्यक्त की । इस तैयारी का उपयोग करना, हिप्पोकैम्पस थीटा दोलनों की सुविधाओं (आवृत्ति और लौकिक स्थिरता)11हिप्पोकैम्पस में एमएस के निरोधात्मक अनुमानों के optogenetic उत्तेजना द्वारा नियंत्रित किया गया । इसके अलावा, निरोधात्मक septo-हिप्पोकैम्पस अनुमानों के थीटा आवृत्ति optogenetic उत्तेजना जाग गतिहीनता के दौरान थीटा लय पैदा की । optogenetically entrained थीटा लय LFP और न्यूरॉन गतिविधि के स्तर पर माउस में सहज थीटा दोलनों के गुण प्रदर्शित.

इस प्रोटोकॉल की मुख्य विशेषताएं शामिल हैं: (1) एक निरोधात्मक मार्ग है कि शारीरिक रूप से सहज थीटा दोलनों के लिए महत्वपूर्ण है का उपयोग करते हुए हिप्पोकैम्पस उत्तेजितता पर विशिष्ट प्रभाव से परहेज; (२) axonal, अर्थात, प्रक्षेपण-विशिष्ट उत्तेजना को कम करने के लिए एक सीधा प्रभाव गैर-हिप्पोकैम्पस MS efferents पर; (3) स्थानीय थीटा-लयबद्ध प्रकाश उत्तेजना, थीटा-लयबद्ध septo-हिप्पोकैम्पस गतिशीलता और entrainment दोलनों की एक वैश्विक द्विपक्षीय थीटा के साथ एक न्यूनतम प्रत्यक्ष हस्तक्षेप सुनिश्चित करने; (4) थीटा दोलन आवृत्ति और नियमितता के पैरामीट्रिक नियंत्रण; और (5) उच्च लौकिक संकल्प के साथ entrainment निष्ठा के ठहराव LFP का उपयोग करने के लिए पशुओं के व्यवहार में मात्रात्मक करणीय विश्लेषण सक्षम करें । इस तैयारी के बाद से अनिवार्य रूप से थीटा पीढ़ी25,30में septo-हिप्पोकैम्पस अवरोध के एक प्रसिद्ध भूमिका पर कैपिटल, यह चूहों बर्ताव में थीटा दोलनों के कई मापदंडों पर मजबूत नियंत्रण सक्षम बनाता है. अध्ययन जहां अंय कम जांच रास्ते और septo-हिप्पोकैम्पस सर्किट के सेल प्रकार३८,३९,४७,४९,५०,५१ हेरफेर किया गया , ५२ , ५३ , ५४ , ५५ , ५६ , ५७ , ५८ थीटा ताल के आगे तंत्र का पता चलता है ।

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Protocol

पीवी-Cre में दस्तक-पुरुष चूहों५९, 10-25 सप्ताह पुराने, इस्तेमाल किया गया । चूहों पशु सुविधा में मानक शर्तों के तहत रखे गए थे और एक 12 ज प्रकाश/ सभी प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था, और स्थानीय स्वास्थ्य अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किए गए थे (Landesamt फर नत्र, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen).

1. वायरल इंजेक्शन

  1. पूरी प्रक्रिया के दौरान, जैविक सुरक्षा दिशानिर्देश६०का पालन करें । एक प्रयोगशाला कोट, एक शल्य मुखौटा, एक hairnet, और दस्ताने के दो जोड़े पहनते हैं ।
  2. लगभग 1 मीटर लंबाई के लिए एक बाँझ स्केलपेल या कैंची के साथ टयूबिंग कट, पंप के सिरिंज धारक ब्लॉक में डालने, और इसे ठीक.
    1. सिरिंज का उपयोग करके सिलिकॉन तेल के साथ पूरी तरह से टयूबिंग भरें ।
    2. जांच करें कि हवा बुलबुले टयूबिंग में दिखाई देते हैं । यदि हवा के बुलबुले मनाया, टयूबिंग फिर से भरना तेल के साथ कर रहे हैं ।
    3. पुशर ब्लॉक करने के लिए गोताख़ोर को ठीक करें ।
    4. धीरे गोताख़ोर की नोक छू ट्यूबिंग तक सिरिंज धारक ब्लॉक की ओर pusher अग्रिम.
    5. ट्यूबिंग में गोताख़ोर की नोक डालें और स्वचालित रूप से एक धीमी गति से आगे पुशर ब्लॉक चाल आदेश विंडो में "infusing" का चयन करके और एक कम अर्क दर (जैसे, ५०० nL/जब तक यह सिरिंज धारक ब्लॉक तक पहुँचता है ।
  3. इंजेक्शन सुई (34G) तैयार करें ।
    1. एक काटने डिस्क से जुड़े एक सटीक ड्रिल/चक्की का उपयोग कर एक स्पष्ट कटौती के साथ सुई हब निकालें । यदि आवश्यक हो, एक सुई का उपयोग करने के लिए हौसले से कटौती की सतह से धातु के अवशेषों को हटा दें ।
    2. धागा केशिका टयूबिंग (3-4 cm लंबाई) सुई के माध्यम से ।
    3. सुपर गोंद के साथ टयूबिंग के लिए सुई गोंद ।
    4. microsyringe पंप को जोड़ता है जो ट्यूबिंग के अंत करने के लिए इंजेक्शन सुई कनेक्ट ।
  4. सुई को stereotaxic धारक को अटैच कर देते हैं ।
  5. सुई के ऊपर पारदर्शी ट्यूब में एक हवा बुलबुला दिखाई दे रहा है जब तक हवा निकालो ।
  6. ऑक्सीजन में 1.5-3% isoflurane के साथ माउस को Anesthetize । लगभग 2-3 मिनट रुको, तो पुष्टि करें कि माउस पूरी तरह से एक पैर की अंगुली चुटकी के लिए अपनी प्रतिक्रिया का आकलन करके anesthetized है । सर्जरी के दौरान पशु श्वास पर नजर रखने और यदि आवश्यक हो तो isoflurane एकाग्रता समायोजित करें ।
  7. गैर-दर्दनाक कान धारकों का उपयोग कर स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में माउस रखें ।
  8. एक लिपिड जेल के साथ माउस की आंखों की रक्षा ।
  9. एक 0.01-1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 26G इंजेक्शन प्रवेशनी का उपयोग कर सिर त्वचा के तहत ०.१ मिलीलीटर lidocaine intradermally इंजेक्षन ।
  10. दाढ़ी और माउस के सिर को संक्रमित इथेनॉल समाधान का उपयोग कर । फिर वैकल्पिक तीन बार इथेनॉल के साथ 2% chlorhexidine शल्य साइट को संक्रमित करने के लिए ।
  11. bregma और लैंब्डा दिखाई दे रहे हैं ताकि आंखों के स्तर के लिए कान के पीछे से जा रहा है ठीक है और तेज कैंची का उपयोग कर एक midline चीरा प्रदर्शन.
  12. एक सिरिंज और एक कागज के ऊतकों और एक एयर पफ के साथ सूखी का उपयोग NaCl के लगभग ५० µ एल लागू करने से खोपड़ी साफ ।
  13. नाक क्लैंप के dorso-ventral स्तर को एडजस्ट करके माउस हेड को पोजिशन करें ताकि bregma और लैंब्डा एक ही dorso-ventral लेवल पर रहे (± ०.३ mm) ।
  14. एक छेद एमएस के ऊपर ड्रिल (एपी ०.९८ और bregma के संदर्भ में एल ०.५ mm) ।
  15. इस बिंदु पर, वायरस के एक aliquot ( AAV2/1. CAGGS. फ्लेक्स.ChR2. tdTomato. WPRESV40) के लगभग 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में कम से 2 µ एल शामिल करना चाहिए ।
  16. 1 मिनट के लिए आर टी पर लगभग ४,००० x जी में aliquot केंद्रापसारक ।
  17. पिपेट वायरस के 2 µ l को Parafilm के एक टुकड़े पर; पहले से सुरक्षित पक्ष का उपयोग करें ।
  18. तरल में इंजेक्शन सुई की नोक डूब और ध्यान से के बारे में ५०० nL/मिनट पर वापस लेने जबकि तरल के स्तर को देख । हवा चूषण को रोकने के लिए, वायरस से पहले निकासी बंद कर पूरी तरह से लिया जाता है । समाधान चिपचिपापन के अनुसार वापस लेने की दर को समायोजित करें; एक तेज दर उच्च चिपचिपापन के साथ एक वायरस की वापसी की सुविधा कर सकते हैं ।
  19. एक कागज के ऊतकों के साथ सुई साफ ।
  20. जांच करें कि वायरस ट्यूब में निहित है और वायरस और तेल एक हवाई बुलबुले से अलग कर रहे हैं । आदेश में वायरस सफलतापूर्वक इंजेक्शन के दौरान संचार किया है कि क्या नियंत्रण करने के लिए ट्यूब पर वायरस के स्तर को चिह्नित करें ।
  21. craniotomy के ऊपर सुई की स्थिति और धीरे से यह पहले इंजेक्शन बिंदु पर मस्तिष्क में डालने (एपी ०.९८, एल ०.५, वी-५.२, ५.५ ° पार्श्व).
  22. 100-150 nL/मिनट की दर से वायरस के ४५० nL सुई 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें । ध्यान से सुई अप ०.१ mm ले जाने और एक और 5 मिनट प्रतीक्षा करें ।
    1. दूसरा इंजेक्शन बिंदु (एपी ०.९८, एल ०.५, वी ४.६) के लिए सुई ले जाएँ और 100-150 nL/मिनट पर एक और ४५० nL सुई.
    2. ०.१ mm ऊपर सुई जाने से पहले 10 मिनट के लिए फिर से रुको । सुई को हटाने से पहले एक और 5 मिनट रुको ।
  23. सीवन रेशमी काले वर्ग समुद्री मील का उपयोग सीवन के साथ चीरा । एक लाल दीपक के साथ पशु गर्म करने के लिए वसूली की गति । प्रशासन एंटीबायोटिक दवाओं (०.३ मिलीलीटर Erycinum (1:4 बाँझ NaCl में)) और carprofen आईएफसआई दैनिक 2-3 सर्जरी के बाद दिन ।
  24. वायरस के स्तर संकेत दिया है कि निशान के ऊपर ट्यूब कट. ट्यूब आगे इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रत्येक इंजेक्शन से पहले एक ताजा इंजेक्शन सुई तैयार करें ।
    नोट: इस सर्जरी के बारे में 1-1.5 एच लेता है । पशु आमतौर पर सर्जरी के बाद 5 मिनट के भीतर जाग । पर्याप्त axonal अभिव्यक्ति के लिए 6 सप्ताह की एक ंयूनतम समय प्रतीक्षा करें, लेकिन स्टीरियोटैक्टिक प्रत्यारोपण प्रदर्शन से पहले 5 महीने से अधिक नहीं है, के रूप में अभिव्यक्ति का स्तर लगभग 6 महीने के बाद वायरस इंजेक्शन में कमी शुरू करते हैं ।

2. ऑप्टिक फाइबर की तैयारी (आंकड़ा 1a)

  1. बहुपद्वति ऑप्टिक फाइबर (१०५ µm कोर, सिलिका कोर, ०.२२ NA के साथ पहने कांच) का उपयोग करें । पट्टी १२५ µm फाइबर कोर के cladding एक माइक्रो खाल उधेड़नेवाला का उपयोग करते हुए फाइबर अभी भी फाइबर स्पूल से जुड़ा हुआ है.
  2. फाइबर एक हीरे चाकू का उपयोग लगभग 2-3 सेमी की लंबाई में कटौती ।
  3. एक zirconia सिरेमिक स्टिक सामी (ID: १२६ µm) में फाइबर डालें । लगभग 0.5-1 मिमी ऑप्टिक फाइबर सामी के उत्तल पक्ष से बहर चाहिए ।
  4. एक सुई का प्रयोग, सामी के दोनों सिरों को epoxy गोंद की एक बूंद लागू नहीं बल्कि सामी के पक्षों पर । वैकल्पिक रूप से, सुपर गोंद का उपयोग करें ।
  5. गोंद के लिए शुष्क करने की अनुमति देने के लिए ंयूनतम 30 मिनट ।
  6. हीरा अतिव्यापी फाइबर चमकाने फिल्म (3 µm धैर्य) का उपयोग कर सामी के उत्तल पक्ष पॉलिश ।
  7. परीक्षण प्रकाश एक ऑप्टिकल बिजली मीटर का उपयोग कर हस्तांतरण की निष्ठा ।
    1. बिजली मीटर पर तरंग दैर्ध्य के रूप में एक ही तरंग दैर्ध्य लेजर इस्तेमाल किया जा रहा सेट ।
    2. स्थिति संवेदक के केंद्र का सामना करना पड़ टिप के साथ पैच कॉर्ड । लेजर पर बिजली और बिजली मीटर से प्रकाश उत्पादन पढ़ा । मान रिकॉर्ड है ।
    3. एक संभोग आस्तीन के माध्यम से पैच कॉर्ड को ऑप्टिक फाइबर कनेक्ट और यह सेंसर के केंद्र का सामना करना पड़ फाइबर की नोक के साथ स्थिति । लेजर पर बिजली और बिजली मीटर से प्रकाश उत्पादन पढ़ा । मान रिकॉर्ड है ।
    4. संचरण दर की गणना: पहली मान से दूसरी मान विभाजित करें । अगर संचरण की दर ०.५ के नीचे है, फाइबर त्यागें, अंयथा यह आरोपण के लिए उपयोग करें ।
    5. प्रत्यारोपण से पहले प्रत्येक फाइबर के लिए संचरण की दर का परीक्षण ।
    6. बाद में प्रयोगों के लिए, ऑप्टिक फाइबर के संचरण की दर के लिए लेजर के प्रकाश की तीव्रता उत्पादन को समायोजित: 5-15 मेगावाट के फाइबर टिप से एक अंतिम प्रकाश उत्पादन को प्राप्त करने के लिए संचरण की दर से विभाजित 5-15 के लिए पैच कॉर्ड टिप से प्रकाश उत्पादन सेट.
      नोट: ऑप्टिक फाइबर की तैयारी के लिए भी रेफरी. ६१ देखें ।

3. LFP रिकॉर्डिंग के लिए टंगस्टन तार arrays की तैयारी (आंकड़ा 1b)

  1. गोंद कई (उदाहरण के लिए 6) १०० µm सिलिका ट्यूब टेप के एक टुकड़े के चिपचिपा पक्ष के समानांतर में गाइड । एक टुकड़ा काट, लगभग 4-6 mm, एक तार सरणी विधानसभा के लिए ।
  2. धागा formvar-अछूता ४५ µm टंगस्टन तारों गाइड ट्यूबों के माध्यम से संदंश का उपयोग कर ।
  3. पट्टी छह तामचीनी-अछूता ठीक तांबे संबंध तारों (लगभग 5 मिमी लंबे) और एक जमीनी तार (लगभग 2-3 सेमी लंबे) एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए दूर दोनों सिरों पर इंसुलेशन परिमार्जन द्वारा । nanoconnector पिन करने के लिए उन्हें मिलाप.
  4. क्रमशः चांदी प्रवाहकीय रंग की एक बूंद का उपयोग कर एक टंगस्टन तार करने के लिए प्रत्येक बंधन तार कनेक्ट । के लिए शुष्क कम से 30 मिनट चलो ।
  5. तारों को कवर करने के लिए सीमेंट की एक ंयूनतम राशि लागू करें । टंगस्टन तारों पर सीमेंट लागू नहीं है, जो मस्तिष्क के ऊतकों में या nanoconnector के ऊपरी हिस्से पर डाला जाएगा । सीमेंट को कम से 30 मिनट के लिए सूखने दें ।
  6. एक कोणीय कट (5-20 °) की कुंद स्टेनलेस स्टील कैंची का उपयोग करने के लिए नीचे या क्षेत्र ventrally बगल के तारों के विश्वसनीय आरोपण सक्षम करने के लिए परत pyramidale, जहां थीटा आयाम के आकलन के लिए बहुत कम है entrainment निष्ठा ।
  7. टिप (लगभग 2 मिमी) जमीनी तार के एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए दूर इंसुलेशन परिमार्जन से अछूता । यह फ्लक्स और के साथ इलाज ।
  8. एक डिजिटल मीटर का उपयोग इलेक्ट्रोड के बीच संभावित क्रॉस-वार्ता की जाँच करें. ऐसा करने के लिए, कनेक्टर पिन करने के लिए मीटर, जो प्रतिरोध मापन मोड के लिए सेट किया जाना चाहिए करने के लिए कनेक्ट करें । चैनलों के pairwise संयोजनों की जांच करना; 5 MΩ नीचे मीटर पर एक पढ़ने महत्वपूर्ण पार बात इंगित करता है ।
  9. एक प्रतिबाधा मीटर का उपयोग कर खारा में प्रत्येक तार इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा की जाँच करें. ठेठ प्रतिबाधा मान १०० kΩ नीचे हैं.
  10. आरोपण की सुविधा के लिए, तार सरणी के लिए गोंद एक ऑप्टिक फाइबर इतना है कि फाइबर की नोक कम तार के स्तर पर है और फाइबर टिप करीब निकटता में है, लेकिन टंगस्टन तारों को छू नहीं. फाइबर के कोण के रूप में संभव के रूप में छोटे आदेश आरोपण के दौरान ऊतक नुकसान को रोकने के लिए रखें ।
    नोट: टंगस्टन तार arrays के निर्माण के लिए भी ref. ६२ देखें ।

4. Stereotaxic आरोपण

  1. चरण 1.6-1.13 में वर्णित के रूप में तैयारियां करते हैं ।
  2. खोपड़ी के ऊपर से संयोजी ऊतक निकालें और रिकॉर्डिंग के दौरान मांसपेशी कलाकृतियों को रोकने के लिए लगभग 2 मिमी द्वारा अच्छी तरह से गर्दन की मांसपेशियों को धक्का ।
  3. एक कपास का उपयोग कर खोपड़ी साफ-टिप applicator और खारा, और ड्रिल 4 छेद (सामने और 2 सेरिबैलम, ०.८ mm व्यास) के ऊपर अस्थि स्टेनलेस स्टील शिकंजा (00-96x1/16) जमीन और प्रत्यारोपण के स्थिरीकरण के लिए जगह (1 डी) । स्थिति जमीन पेंच, एक तांबे के तार से जुड़ा (लगभग 2-3 सेमी लंबाई) सेरिबैलम के ऊपर ।
  4. electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान मांसपेशी कलाकृतियों को रोकने के लिए सीमेंट के साथ पूरी तरह से जमीन-पेंच को कवर करें । सभी शिकंजा (चित्रा 1E) को जोड़ने के लिए एक सीमेंट की अंगूठी का निर्माण ।
  5. आरोपण पक्ष के ऊपर एक craniotomy प्रदर्शन (हिप्पोकैम्पस, एपी १.९४, एल १.४, bregma के संदर्भ में V १.४). मस्तिष्क ऊतक की सतह पर बाँझ NaCl के लगभग 5 µ एल लागू करें.
  6. धीरे तार सरणी कम craniotomy में stereotaxis का उपयोग कर । एकात्मक रिकॉर्डिंग के लिए, एक सिलिकॉन जांच के बजाय एक तार सरणी६३प्रत्यारोपण; आदेश में optoelectric प्रकाश कलाकृतियों को रोकने के लिए, सीधे जांच (चित्रा 1C -मैं) का सामना करना पड़ नहीं फाइबर टिप के साथ हिप्पोकैम्पस में अलग ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण । गोलार्द्धों के बीच entrainment के समंवय की जांच के लिए, contralateral हिप्पोकैम्पस CA1 क्षेत्र में एक अतिरिक्त ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण ।
  7. लागू लगभग 5 गर्म तरल मोम की µ एल/आयल तेल, ७० डिग्री सेल्सियस से अधिक गरम, आरोपण साइट के ऊपर एक सिरिंज के साथ मस्तिष्क के ऊतकों की रक्षा के लिए ।
  8. तार सरणी के आसपास सीमेंट लागू करें और सीमेंट के साथ खोपड़ी को कवर ।
  9. एक सुई का उपयोग करते हुए जमीन पेंच से जुड़ा है, और एक टांका लगाने की मशीन का उपयोग तारों फ्यूज तार-मिलाप जमीन के लिए प्रवाह की एक बूंद लागू करें/
  10. पूरे जमीन के तार को सीमेंट से ढक कर ।
  11. प्रशासन ०.३ मिलीलीटर Erycinum (1:4 बाँझ NaCl में) और carprofen (5दिन/एमएल) आईएफसआई सर्जरी के बाद और के लिए दो दिनों के बाद कम. माउस आमतौर पर सर्जरी के बाद 15 मिनट के भीतर जाग । एक लाल दीपक के साथ पशु गर्म करने के लिए वसूली की गति ।
  12. सर्जरी के बाद पहले सप्ताह के लिए दैनिक माउस के वजन की निगरानी या जब तक वजन स्थिर है । वजन घटाने सर्जरी से पहले दर्ज माउस वजन के 10% से अधिक नहीं होना चाहिए । वजन के स्थिरीकरण में तेजी लाने के लिए, सर्जरी के बाद पहले दिन के दौरान गीले भोजन और गाढ़ा दूध के साथ माउस की आपूर्ति ।
  13. entrainment के दौरान हिप्पोकैम्पस सेलुलर गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए, हिप्पोकैम्पस में एक सिलिकॉन जांच प्रत्यारोपण (एपी-१.९४, एल १.४, V 1, बाद कम करने के साथ) ref. ६२ (चित्रा 1C -I) में वर्णित के रूप में । एपी-3, एल १.४, V १.६, ३९ ° caudal-rostral में हिप्पोकैम्पस में ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण । प्रत्यारोपण एमएस में एक अतिरिक्त ऑप्टिक फाइबर (एपी + ०.९८, एल 1, V ३.९, 15 ° पार्श्व) यदि कोशिका सोमता की उत्तेजना वांछित है ।

५. Optogenetic उत्तेजन आणि Electrophysiological डेटा अर्ज

  1. Habituate रिकॉर्डिंग सेटअप करने के लिए माउस (जैसे, 15 मिनट सत्र, 3 दिनों के लिए प्रति दिन 1-2 सत्र) । पहले प्रयोगों के साथ शुरू करने से पहले पशु के व्यवहार की जांच करें । अगर माउस चैंबर में घूम रहा है, पर्यावरण की खोज, सूंघने, प्रदर्शन रियर, आदि, पहला प्रायोगिक सत्र शुरू करते हैं ।
  2. एक ही कमरे में अन्य जानवरों के अभाव में एक परिचित कक्ष में माउस रखें ।
  3. जानवर की स्थिति को ट्रैक करने के लिए चिपकने वाला टेप का उपयोग कर सिर मंच के लिए एक एलईडी संलग्न. सुनिश्चित करें कि एलईडी प्रकाश कैमरे द्वारा अवधि भर में कब्जा कर लिया है कि पशु रिकॉर्डिंग चैंबर खोज है प्रयोगों शुरू करने से पहले । एलईडी लाइट को ट्रैक करने के क्रम में अंधेरे में रिकार्ड । रिकॉर्डिंग चैंबर के ऊपर एक कैमरा की स्थिति ।
  4. पैच कॉर्ड से प्रकाश उत्पादन की जांच करें । फाइबर प्रत्यारोपण के संचरण की दर के आधार पर कनेक्शन के बाद फाइबर टिप से प्रकाश उत्पादन का अनुमान । सुनिश्चित करें कि फाइबर की नोक से प्रकाश उत्पादन 5-15 मेगावाट के बीच है, विश्वसनीय entrainment सक्षम करने के लिए ।
  5. headstage एम्पलीफायर को लंबे प्रत्यारोपित कनेक्टर से कनेक्ट करें । optogenetic उत्तेजना प्रयोगों के लिए जीर्ण प्रत्यारोपित हिप्पोकैम्पस फाइबर के लिए fiberoptic पैच कॉर्ड कनेक्ट । नियंत्रण प्रकाश उत्तेजना प्रयोगों में, एक डमी हेडसेट से जुड़े सामी को ऑप्टिक फाइबर कनेक्ट ।
  6. रिकॉर्डिंग चैंबर में माउस रखें ।
  7. सॉफ्टवेयर को उत्तेजना जनरेटर को नियंत्रित करने के लिए उत्तेजना प्रोटोकॉल उत्पंन खोलो ।
  8. उस चैनल का चयन करें जो ४७३ एनएम DPSS लेजर को नियंत्रित करता है । पहली पंक्ति में ३,००० एमवी (1 कॉलम) दर्ज करें, समय 30 ms (2 कॉलम), मान 0 एमवी (3 कॉलम), समय ११२ ms (4 कॉलम), पंक्ति दोहराने ८४०, और समूह दोहराने 1, 30 ms लंबी दालों के साथ 7 हर्ट्ज उत्तेजना के 2 मिनट के लिए एक प्रोटोकॉल उत्पन्न करने के लिए. 4 कॉलम और पंक्ति पुनरावृत्ति की संख्या में समय की अवधि को समायोजित अगर एक और आवृत्ति या एक अलग अवधि में उत्तेजना की आवश्यकता है । दूसरी पंक्ति में चुनें 0 मेगावाट (1 कॉलम), समय ५०० ज (2 कॉलम), पंक्ति दोहराने 1, और समूह दोहराने 1, यह सुनिश्चित करने के लिए कि लेजर बंद किया जा रहा है उत्तेजना प्रोटोकॉल समाप्त होने के बाद ।
  9. "फ़ाइल > इस रूप में सहेजें" क्लिक करें और फ़ाइल को किसी इच्छित नाम से सहेजें ।
  10. विश्वास दिलाता है कि उत्तेजितकर्ता TTL उत्पादन लेजर ट्रिगर डिजिटल लिंक्स एनालॉग इनपुट बोर्ड से जुड़ा है electrophysiological और optogenetic डेटा के अधिग्रहण सिंक्रनाइज़ करने के लिए.
  11. वैकल्पिक रूप से, parametrically थीटा दोलन आवृत्ति की परिवर्तनशीलता को विनियमित करने के लिए, एक गाऊसी वितरण के बाद अवधियों के साथ अलग अंतर-पल्स अंतराल पर प्रकाश दालों की गाड़ियों लागू होते हैं । भिन्न प्रोटोकॉल के लिए अंतर-पल्स अंतराल के फैलाव को संशोधित करें, उदा., चरण ३.२ से १५.१ ms2. इन प्रोटोकॉल लागू थीटा आवृत्ति के विभिंन परिवर्तनशीलता (चित्रा 6) के साथ थीटा कछु उत्पंन करने के लिए ।
  12. रिकॉर्डिंग सिस्टम का सॉफ़्टवेयर खोलें । पर क्लिक करें "ACQ" प्राप्त करने के लिए और रिकॉर्ड करने के लिए "आरईसी". आधारभूत व्यवहार रिकॉर्ड करने के लिए प्रकाश उत्तेजना के दीक्षा से पहले प्रतीक्षा करें (उदा., बेसलाइन प्लेस फ़ील्ड को निकालने के लिए 30 मिनट या आधारभूत गति को प्राप्त करने के लिए 2 मिनट) ।
  13. सॉफ्टवेयर को नियंत्रित करने के लिए उत्तेजना जनरेटर खोलो । "फ़ाइल > खोलें" पर क्लिक करें और पसंद की प्रोटोकॉल फ़ाइल चुनें. प्रकाश उत्तेजना शुरू करने के लिए "डाउनलोड और शुरू" पर क्लिक करें ।
    नोट: प्रयोग सर्वेक्षण किया जा सकता है, और उत्तेजना रिमोट कंट्रोल के माध्यम से शुरू कर दिया; इस जानवर के व्यवहार पर प्रयोगकर्ता की उपस्थिति के प्रभाव को शामिल नहीं । अध्ययन के लक्ष्य के आधार पर, उत्तेजना शुरू किया जा सकता है और विशिष्ट व्यवहार के दौरान समाप्त ।

6. Optogenetic Entrainment और प्रक्षेपण के लिए एक संयुक्त दृष्टिकोण-हिप्पोकैम्पस उत्पादन के विशिष्ट अवरोध

  1. एक्सप्रेस ChR2 के एमएस GABAergic कोशिकाओं में पीवी-Cre चूहों, के रूप में खंड 1 में वर्णित है ।
  2. इसके अलावा, CamKIIα आश्रित halorhodopsin (enphr 3.0, AAV2/1. CamKIIa. enphr 3.0-eyfp. WPRE. hGH) के २.४ µ l की कुल सुई दोनों पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस गोलार्द्धों में (AP-१.७; एल ± १.०५; V-२.०५ और-१.४ मिमी; AP-१.७; एल ± १.७; V-२.०५ और-१.५५ मिमी; AP-२.३; एल ± १.५; V-२.२ और-१.३ मिमी; AP-२.३; एल ± २.२; वी-१.६५ और-२.४५ मिमी).
  3. अभिव्यक्ति समय के 6 सप्ताह की अनुमति दें ।
  4. हिप्पोकैम्पस CA1 क्षेत्र में ऑप्टिक फाइबर के साथ एक टंगस्टन तार सरणी प्रत्यारोपण, के रूप में खंड 4 में वर्णित है । इसके अतिरिक्त, पार्श्व पट में द्विपक्षीय ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण (रास, एपी ०.१, एल ०.२५, वी-२.२५ मिमी, और एपी ०.५, एल-०.३, वी-२.७ मिमी) ।
  5. optogenetic थीटा entrainment प्रयोगों के रूप में चरण 5.4-5.5 में वर्णन किया गया है ।
    1. रास के लिए हिप्पोकैम्पस उत्पादन के एक साथ अवरोध के लिए, एक प्रोटोकॉल उत्तेजना पीढ़ी उत्पन्न: उदाहरणके लिए, ट्रिगर करने से पहले उत्पादन चैनल की शुरुआत ५९३ एनएम DPSS लेजर 15 एस एक सतत कुल ४५ एस में टिकाऊ पल्स के साथ, से कनेक्ट ४७३ एनएम DPSS लेजर के लिए दलहन उत्पादन ।
    2. एक ५९३ एनएम DPSS लेजर के लिए एक बहुपद्वति फाइबर ऑप्टिक युग्मक का उपयोग पैच तार के माध्यम से रास में दोनों फाइबर कनेक्ट ।
    3. रिकॉर्डिंग शुरू करने और डाउनलोड करने और उत्तेजना पीढ़ी को नियंत्रित करने के लिए प्रोटोकॉल ट्रिगर ।

7. डाटा प्रोसेसिंग

  1. electrophysiological संकेतों को कनवर्ट करें और ट्रैकिंग डेटा Neurophysiological डेटा (ND) प्रबंधक के साथ. dat और. pos स्वरूपों, क्रमशः६४स्थान ।
  2. १,२५० हर्ट्ज एनडी प्रबंधक६६का उपयोग करने के लिए वाइड बैंड संकेत के कम से गुजारें छानने और नीचे-नमूने से LFP प्राप्त करें ।
  3. प्रत्येक रिकॉर्डिंग में, थीटा दोलनों (Neuroscope का उपयोग करते हुए)19के अधिक से अधिक आयाम के साथ चैनल का चयन करें ।
  4. लेजर दालों के स्टांप का पता लगाने और उत्तेजना कछु के साथ एक सीमा एल्गोरिथ्म का पता लगाने (MATLAB समारोह findpeaks. m का उपयोग कर या इसी तरह)11.
  5. एक मल्टी चैनल डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में. dat फ़ाइल को आयात करने के लिए, क्लिक करें "फ़ाइल > आयात", डेटा प्रकार के रूप में "बाइनरी फ़ाइलें" का चयन, और. dat फ़ाइल का चयन करें । कॉन्फ़िगरेशन संवाद में, चैनलों की सही संख्या और १,२५० हर्ट्ज का एक नमूना दर दर्ज करें, "ठीक" क्लिक, और. smr फ़ाइल के रूप में सहेजें. "विश्लेषण > नया परिणाम देखें > PowerSpectrum" का चयन करके पावर स्पेक्ट्रा प्लॉट । सेटिंग्स में, उच्चतम थीटा आयाम और १६,३८४ FFT आकार के साथ चैनल का चयन करें, "नया", क्लिक के रूप में परिभाषित "प्रारंभ समय" उत्तेजना युग की शुरुआत और "अंत समय" उत्तेजना युग के अंत के रूप में, और क्लिक करें "प्रक्रिया" ।
  6. optogenetic उत्तेजना आवृत्ति रेंज के भीतर संचयी शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व (psd) के अनुपात के रूप में entrainment निष्ठा की गणना (उत्तेजना आवृत्ति ± ०.५ हर्ट्ज), संचयी PSD में थीटा (5-12 हर्ट्ज) बैंड के साथ multitaper विधि (= = 3, विंडो आकार ८,१९२) के लिए 10 s कछु (उदा., टूलकिट < http://chronux.org/>).
  7. रिकॉर्डिंग कछु जहां प्रमुख PSD चोटी ≤ है विश्लेषण से 5 हर्ट्ज (गैर थीटा कछु, MATLAB समारोह find. एम) का उपयोग कर बाहर है ।
  8. संगणना entrainment निष्ठा के अनुसार सभी दर्ज कछु के लिए LFP पावर स्पेक्ट्रा के रैस्टर का प्लाट (MATLAB functions का प्रयोग sortrows. मी और pcolor. मी.) "फ़ाइल > खोलें" पर क्लिक करके पावर स्पेक्ट्रा और entrainment निष्ठा लोड करें, संग्रहित चर in. Type पावर = sortrows (in, 1); pcolor (पावर (:, 2: end)) ।

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Representative Results

अनुभाग 1 में वर्णित MS में GABAergic कक्षों में ChR2 का लक्ष्यीकरण चित्र 2aमें सचित्र है । एक ऑप्टिक फाइबर जो CA1 क्षेत्र entrains में उत्तेजना की आवृत्ति पर थीटा दोलनों ipsilateral (चित्रा बी) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से contralateral के ऊपर प्रत्यारोपित है के माध्यम से एमएस GABAergic कोशिकाओं के axons के Optogenetic उत्तेजना गोलार्द्ध (चित्रा 2c) । थीटा दोलनों optogenetic उत्तेजना (3ए), जो की प्रभावकारिता एक रिश्तेदार थीटा LFP शक्ति उत्तेजना आवृत्ति, यानी चारों ओर के रूप में प्रत्येक रिकॉर्डिंग युग के लिए गणना की गई थी द्वारा अधिक या कम कुशलता से entrained हो सकता है, entrainment निष्ठा (चित्र बी) । ०.३ ऊपर Entrainment निष्ठा, यानी, सहज प्रकाश की तुलना में उच्च रिकॉर्डिंग बंद, रिकॉर्डिंग युग के लगभग ८०% में मनाया गया । गैर-थीटा आवृत्तियों पर Optostimulation कम प्रभावी (आंकड़ा 3सी) था ।

स्पष्ट यानी, थीटा दोलनों आवृत्ति के पैरामीट्रिक हेरफेर थीटा नियमितता के आकस्मिक परिवर्तन के साथ है: आयाम और थीटा दोलनों की आवृत्ति के लौकिक नियमितता उच्च के साथ कछु के दौरान बढ़ गया था entrainment निष्ठा । दोलनों की स्थिरता भी प्रकाश दालों की गाड़ियों को लागू करने के द्वारा विनियमित parametrically किया जा सकता है, अवधि जो विभिन्न फैलाव (चित्रा 4) के साथ गाऊसी वितरण का पालन करें.

दोलनों आवृत्ति पर नियंत्रण Optogenetic (चित्रा 5) आंदोलन के दौरान आरोही afferents द्वारा एमएस के माध्यम से आवृत्ति नियंत्रण के साथ समझौते में थीटा आवृत्ति और चल गति, के बीच सहसंबंध समाप्त हो गया । Optostimulation भी (चित्रा 5B) गतिहीनता के दौरान थीटा दोलनों प्रेरित । ख्यात पिरामिडीय कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में CA1 क्षेत्र में दर्ज अधिमानी गोलीबारी चरणों optogenetically entrained थीटा दोलन के सापेक्ष अपरिवर्तित जब सहज थीटा (चित्रा 6) की तुलना में थे.

गतिवान के थीटा-मध्यस्थता नियमन में पार्श्व पट मार्ग को हिप्पोकैम्पस के योगदान का अध्ययन करने के लिए, हम इस मार्ग को बाधित optogenetically. Halorhodopsin (enphr 3.0) द्विपक्षीय हिप्पोकैम्पस पिरामिडीय कोशिकाओं (चित्रा 7A) में व्यक्त किया गया था, जबकि ChR2 एमएस GABAergic कोशिकाओं में ऊपर के रूप में व्यक्त किया गया था और थीटा दोलनों optogenetically entrained (चित्रा 7B) थे । थीटा entrainment गति से चलने की परिवर्तनशीलता कम लेकिन जब रास मार्ग के लिए हिप्पोकैम्पस (चित्रा 7C) बाधित किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: ऑप्टिक फाइबर, इलेक्ट्रोड और सर्जरी का चित्रण. (क) एक ऑप्टिक फाइबर का चित्रण । (ख) एक तार सरणी के चित्रण हिप्पोकैम्पस थीटा दोलनों के entrainment के दौरान हिप्पोकैम्पस LFP की रिकॉर्डिंग के लिए एक ऑप्टिक फाइबर से चिपके । (ग) हिप्पोकैम्पस सेलुलर गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए, एक सिलिकॉन जांच एक microdrive पर मुहिम शुरू की है । (घ) लघु शिकंजा खोपड़ी पर तैनात हैं । तांबे के तारों को जमीन और संदर्भ पेंच के लिए उंहें सेरिबैलम के ऊपर स्थिति से पहले टांका रहे हैं । (ङ) सीमेंट को कवर करने और शिकंजा जोड़ने के लिए लागू किया जाता है. ऊपरी नीले वृत्त इंगित करता है जहां craniotomy सिलिकॉन जांच के आरोपण के लिए प्रदर्शन किया गया था । लोअर ब्लू सर्कल इंगित करता है, जहां craniotomy हिप्पोकैम्पस में ऑप्टिक फाइबर के आरोपण के लिए प्रदर्शन किया गया था । (च) हिप्पोकैम्पस CA1 क्षेत्र को लक्षित करने के लिए एक caudal-rostral कोण में एक ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपित की जाती है. एक दूसरे फाइबर औसत दर्जे का पट में प्रत्यारोपित किया जा सकता है अगर कोशिका सोमता की उत्तेजना (वैकल्पिक) वांछित है । (छ) सिलिकॉन जांच हिप्पोकैम्पस CA1 क्षेत्र के बस के ऊपर कम है । (ज) microdrive और कनेक्टर की सीमाओं प्रत्यारोपण और जमीन के लिए सीमेंटेड हैं, और संदर्भ तारों टांका रहे हैं । (I) तांबे मेष प्रत्यारोपण के चारों ओर का निर्माण किया है और एक फैराडे पिंजरे के रूप में सेवा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: optogenetic हिप्पोकैम्पस थीटा entrainment के लिए तैयारी । (क) ChR2 pv+ औसत दर्जे का septal कोशिकाओं में पीवी-Cre चूहों (ऊपरी योजना) में व्यक्त किया गया था । उज्ज्वल एमएस (1, 2) में प्रतिदीप्ति सोमता में सफल निर्माण अभिव्यक्ति की पुष्टि करता है । fornix (एफ) और fimbria (fi) हिप्पोकैम्पस (3-6) के माध्यम से एमएस फाइबर परियोजना; ऐका: पूर्वकाल संयोजिका; पूर्वकाल भाग. HDB: तिरछे बैंड के क्षैतिज अंग के नाभिक; या: परत oriens. नीली बत्ती के साथ optogenetic उत्तेजना के लिए ऑप्टिक फाइबर हिप्पोकैम्पस एरिया CA1 (लोअर स्कीम) की हवामहल लेयर के ऊपर प्रत्यारोपित की जाती है । स्केल बार्स: ५०० µm (छवियां 1, 3, 4) और ५० µm (छवियां 2, 5, 6) । (ख) सहज थीटा दोलनों (बाएँ) और ७ हर्ट्ज (मध्य) या १० हर्ट्ज (दाएँ) optogenetic entrainment के दौरान हिप्पोकैम्पस LFP. नीली पट्टियां लाइट अनुप्रयोग के समय विंडो को इंगित करती हैं । नोट चरण एक तीर द्वारा इंगित प्रकाश पल्स द्वारा रीसेट करें । सहज और entrained थीटा, शारीरिक थीटा लय का एक संकेतक के दौरान गामा लिफाफे । परत oriens (एसटीआर. या.) और परत radiatum (str. राड.) के बीच चरण उत्क्रमण भी entrainment के दौरान बनाए रखा है । (ग) ipsilateral (ऊपरी कथानक) के दौरान Entrainment विश्वसनीय है, साथ ही contralateral (लोअर कथानक) optogenetic उत्तेजना है. योजनाओं इलेक्ट्रोड पदों के संबंध में तंतुओं की स्थिति का वर्णन । उदाहरण के दौरान LFP अंश थीटा और हल्की दालों के अनुप्रयोग बीच में दिखाए जाते हैं. दाईं ओर, हिप्पोकैम्पस LFP के पावर स्पेक्ट्रा के दौरान ipsi-और contralateral उत्तेजन रंग-के अनुसार कोडित उत्तेजना आवृत्ति. यह आंकड़ा ref .11से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: optogenetic हिप्पोकैम्पस थीटा entrainment की निष्ठा । (क) निम्न और उच्च entrainment निष्ठा के दौरान LFP निशान हिप्पोकैम्पस उदाहरण. (ख) शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व की 10 s कछु सहज थीटा के दौरान, प्रमुख थीटा आवृत्ति के अनुसार आदेश पंक्तियों के साथ (बाएँ), और दौरान 7 हर्ट्ज (मध्य) और 10 हर्ट्ज (दाएँ) optogenetic उत्तेजना, पंक्तियों के साथ entrainment निष्ठा के अनुसार आदेश दिया. संबंधित उदाहरण पावर स्पेक्ट्रा (एक तीर द्वारा दर्शाया गया) इसके ऊपर प्लॉट किए गए हैं । नोट भर में विश्वसनीय entrainment निष्ठा कछु. दाईं ओर, थीटा आवृत्तियों के लिए entrainment निष्ठा की संचयी प्रायिकता दिखाई जाती है. (ग) Entrainment थीटा लयबद्ध उत्तेजना की आवश्यकता है । हिप्पोकैम्पस नेटवर्क गतिविधि 6-12 हर्ट्ज के बीच आवृत्तियों का उपयोग सफलतापूर्वक entrained जा सकता है. कम आवृत्तियों (जैसे, 2 या 4 हर्ट्ज) या उच्च आवृत्तियों (जैसे, 20 हर्ट्ज) entrainment विश्वसनीय नहीं है. यह आंकड़ा ref .11से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: थीटा दोलनों नियमितता के पैरामीट्रिक हेरफेर. (क) उत्तेजना ७.८ हर्ट्ज के एक मतलब आवृत्ति के साथ थीटा रेंज के भीतर अलग आवृत्तियों पर लागू किया गया था एक गाऊसी वितरण के बाद. अंतर पल्स अंतराल के मानक विचलन σ = ३.१९ से σ = १५.०९ करने के लिए प्रोटोकॉल में बढ़ गया था । कुल में, 11 प्रोटोकॉल उत्पंन और लागू किया गया, 1 मिनट की उत्तेजना युग की कुल अवधि के साथ प्रत्येक । उन में से, 5 प्रोटोकॉल की संभावना वितरण आंकड़ा के बाईं ओर दिखाए जाते हैं । 1-14 हर्ट्ज की एक सीमा के भीतर बिजली वर्णक्रमीय घनत्व संबंधित प्रोटोकॉल के आवेदन के दौरान हिप्पोकैम्पस LFP के आंकड़े के बीच में रची जाती हैं । संबंधित प्रोटोकॉल के आवेदन के दौरान थीटा अवधि की संभावनाओं को सही पर सचित्र हैं । (ख) लागू अंतर-पल्स अंतराल के प्रसरण समवर्ती थीटा काल के प्रसरण का निर्धारण करते हैं (पियरसन ' s r = ०.९४, p = ०.०००२). (ग) थीटा आयाम परिवर्तनशीलता और अंतर-पल्स अंतराल के बीच संबंध (पियरसन के r = ०.६१, p = ०.०८) । यह आंकड़ा ref. ७०से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Optogenetic थीटा लयबद्ध entrainment व्यवहार के दौरान हिप्पोकैम्पस LFP निर्धारित करता है । (क) Optogenetic उत्तेजना कव निर्धारित थीटा कव दौरान गतिवान. इसलिए, गति से संबंधित afferents हिप्पोकैम्पस थीटा आवृत्ति प्रभाव नहीं है, और एक परिणाम के रूप में, गति थीटा आवृत्ति के साथ संबंधित नहीं है (नीला) के रूप में यह सहज थीटा (काला) के दौरान है । डेटा को अर्थ ± s.e.m. के रूप में प्रस् तुत किया जाता है (B) शांत जागना के दौरान, हिप्पोकैम्पस थीटा को आंदोलन के अभाव में निकाला जा सकता है । हिप्पोकैम्पस LFP से पहले और के दौरान सफल entrainment ऊपर दिखाए गए हैं, और entrainment के दौरान रिकॉर्ड किए गए उदाहरण गति ट्रैस नीचे दिखाए गए हैं (लाल ट्रेस ऊपर चित्रित हिप्पोकैम्पस LFP ट्रेस करने के लिए संगत है) । नीली पट्टियों प्रकाश उत्तेजना दालों की समय खिड़कियों के निशान । यह आंकड़ा ref .11से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: थीटा entrainment के दौरान हिप्पोकैम्पस सेलुलर गतिविधि । (A) सेलुलर गतिविधि सिलिकॉन जांच (योजना) का उपयोग कर दर्ज की गई । एकल न्यूरॉन्स और पिरामिड कोशिकाओं अलग और उनके संबंधित तरंग के अनुसार पहचाने गए थे. यहां दिखाया औसत तरंग (मध्य) और ऑटो एक उदाहरण के correlogram अलग पिरामिड कक्ष है । (ख) पिरामिड कोशिकाओं (Pyr) के पसंदीदा निर्वहन चरण सहज (काले, एन = 29 ंयूरॉंस में) और optogenetically entrained (नीले, n = 30 में) थीटा (पी = ०.७९) के दौरान अलग नहीं था । (ग) यहां दिखाया गया है ऑटो-correlogram (बाएं) और अधिमानी गोलीबारी का चरण एक तेज-गोलीबारी के दौरान न्यूरॉन सहज और optogenetically entrained थीटा. नीचे इसी हिप्पोकैम्पस LFP लय के दौरान सहज (बाएँ) और entrained (दाएँ) थीटा. (घ) फास्ट-फायरिंग न्यूरॉन्स के पसंदीदा निर्वहन चरण सहज (काले में) और optogenetically entrained (नीले, एन = 28 न्यूरॉन्स) थीटा (पी = ०.९७) के दौरान अलग नहीं था. औसत ऑटो-correlogram बाईं ओर दिखाया गया है । (ङ) औसत ऑटो-correlogram str. oriens कोशिकाओं । (च) str के पसंदीदा निर्वहन चरण oriens न्यूरॉन्स सहज (काला) और optogenetically entrained (नीला, n = 10 ंयूरॉंस) थीटा (पी = ०.५६) के दौरान अलग नहीं था । पसंदीदा निर्वहन चरणों के हिस्टोग्राम सही पर दिखाए जाते हैं । (छ) औसत फायरिंग दर थीटा entrainment द्वारा पिरामिडीय कोशिकाओं (p = ०.९८), तेज-फायरिंग न्यूरॉन्स (p = ०.९६) या str में प्रभावित नहीं थे । oriens न्यूरॉन्स (पी = ०.८५). यह आंकड़ा ref .11से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: रास के माध्यम से हिप्पोकैम्पस subcortical उत्पादन के हिप्पोकैम्पस थीटा entrainment और optogenetic निषेध का संयोजन । (क) enphr 3.0 (halorhodopsin) हिप्पोकैम्पस हवामहल कोशिकाओं (उपरी योजना) में व्यक्त किया गया था. निर्माण की सफल अभिव्यक्ति हिप्पोकैम्पस (ऊपरी छवियों) में सोमता में उज्ज्वल प्रतिदीप्ति द्वारा की पुष्टि की थी और रास में axons (कम छवियों) । ऑप्टिक फाइबर लोकसभा (निचली योजना) के ऊपर द्विपक्षीय प्रत्यारोपित किए गए. स्केल बार्स: ५०० µm (बाईं ओर छवियां), ५० µm (दाईं ओर छवियां) । (ख) हिप्पोकैम्पस थीटा को रास मार्ग के हिप्पोकैम्पस के निषेध के दौरान सफलतापूर्वक entrained गया है. यहां दिखाया गया है बिजली वर्णक्रमीय घनत्व के लिए 9 हर्ट्ज नीले प्रकाश उत्तेजना उत्पादन अवरोध के दौरान. (ग) प्रमुख हिप्पोकैम्पस subcortical उत्पादन मार्ग की बाधा गति पर हिप्पोकैम्पस थीटा entrainment के प्रभाव को रोकता है । यहां दिखाया optogenetic entrainment पर गति परिवर्तनशीलता में कमी है (नीले रंग की सीमाओं के साथ सफेद पट्टी), साथ हिप्पोकैम्पस के रास मार्ग (नीली सीमाओं के साथ पीली पट्टी) के एक साथ निषेध पर अनुपस्थित है । संबंधित औसत आधारभूत गति बाईं ओर दिखाया गया है । यह आंकड़ा ref .11से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां हम चढ़ना करने के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति प्रस्तुत की और व्यवहार पशु में हिप्पोकैम्पस थीटा दोलनों में लाना । यह दृष्टिकोण सूचना प्रसंस्करण और व्यवहार में थीटा ताल के कार्यों के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है । इस विधि के महत्वपूर्ण पहलुओं में शामिल हैं: (1) opsin के विकल्प और हिप्पोकैम्पस में एमएस कोशिकाओं के axons करने के लिए ChR2 के लक्ष्यीकरण, (2) प्रत्यारोपित ऑप्टिक फाइबर के मजबूत ऑप्टिकल और विद्युत सुविधाओं-तार सरणी विधानसभाओं सतत उत्तेजना और LFP सुनिश्चित करने के लिए चूहों व्यवहार में रिकॉर्डिंग, (3) थीटा आवृत्तियों पर प्रकाश की एक इष्टतम राशि के आवेदन, (4) entrainment निष्ठा के पोस्ट हॉक ठहराव, और (5) optoelectrical कलाकृतियों का नियंत्रण.

पहले बिंदु के मुख्य चेतावनी है एक सुरक्षित वायरस इंजेक्शन औसत दर्जे का स्थित शिरापरक जाल छोड़ । इस कदम के उपइष्टतम शल्य निष्पादन इंजेक्शन की सफलता की दर में कमी और संभावित परिणाम के अधिग्रहण में देरी कर सकते हैं । कैनेटीक्स एक opsin माना जाना चाहिए, ChR2 (सक्रियकरण समय: 2 ms, निष्क्रियण समय: 9 ms६५) । दूसरा मुद्दा प्रत्यारोपण से पहले प्रकाश संचरण निष्ठा और इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग की प्रतिबाधा के नियंत्रण की मांग, और आम तौर पर अतिरिक्त प्रत्यारोपण के समय पर निर्माण से लाभ.

तीसरे विचार optogenetics के लिए आम है बड़े पैमाने पर सर्किट जोड़तोड़ में लक्ष्य है, और प्रकाश स्रोतों और ऑप्टिकल कनेक्शन है, जो 5-15 मेगावाट के मस्तिष्क में एक १०० µm फाइबर प्रकाश शक्ति के माध्यम से उद्धार शामिल है । प्रत्येक माउस के लिए और प्रत्येक रिकॉर्डिंग से पहले, एक परीक्षण रिकॉर्डिंग प्रयोग के लिए इष्टतम तीव्रता के लिए प्रकाश उत्पादन सेट करने के लिए किया जा सकता है । प्रकाश उत्पादन पर्याप्त उच्च के लिए अनुमानों की एक पर्याप्त संख्या को सक्रिय करने के लिए थीटा दोलनों के विश्वसनीय entrainment की अनुमति है, लेकिन बहुत अधिक नहीं है, ताकि थर्मल-पैदा प्रतिक्रियाओं और ऊतक नुकसान को रोकने के लिए होना चाहिए ।

आगे पहलू प्रकाश दालों और LFP डेटा के तुल्यकालन का संबंध है, एक ही विज्ञापन कनवर्टर के माध्यम से दोनों डेटा प्रकार नमूना द्वारा उच्चतम परिशुद्धता के साथ हासिल की । सिंक्रनाइज़ समय टिकटों ंयूरॉन निर्वहन और LFP के अध्ययन में लक्ष्य अंय संभावित अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से आवश्यक हैं । Entrainment प्रभावकारिता के बीच और उत्तेजना कछु के भीतर भिन्न हो सकते हैं; यह सबसे अधिक संभावना है क्योंकि rhythmicity हस्तक्षेप के आंतरिक और/या संवेदी प्रेरित संकेतों के साथ optogenetic उत्तेजना द्वारा निर्धारित की वजह से होता है, थीटा ताल के कई जनरेटर के कारण16,६६,६७, ६८. इस अत्यधिक गतिशील optogenetic हेरफेर६९ के तात्कालिक निष्ठा के ठहराव इसलिए कारण अनुमान के लिए अत्यंत उपयोगी है, यानी, एक प्रभाव परिमाण के बीच संबंध प्रकट करने के लिए (उदा. , व्यवहार में परिवर्तन) और चयनित तुल्यकालन पहलुओं के optogenetic नियंत्रण की क्षणिक प्रभावकारिता । महत्वपूर्ण बात, एकाधिक दोलन मापदंडों optogenetic उत्तेजना से प्रभावित हो सकता है, उदा, entrainment मध्यस्थों न केवल आवृत्ति लॉकिंग लेकिन यह भी थीटा दोलनों की एक अधिक नियमित आयाम11.

पांचवां, optogenetic उत्तेजना अक्सर optoelectrical कलाकृतियों, photoelectrochemical प्रभाव से धातु इलेक्ट्रोड में पैदा के साथ जुड़ा हुआ है । उनकी डिग्री इलेक्ट्रोड सामग्री, ऑप्टिक फाइबर के लिए इलेक्ट्रोड टिप की निकटता पर निर्भर करता है, और प्रकाश शक्ति. यहां वर्णित प्रयोगों में, optoelectrical कलाकृतियों फाइबर और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी बढ़ाने से बचा जा सकता है, जो की बंद पोजीशनिंग थीटा दोलन निगरानी के लिए आवश्यक नहीं है. Optoelectrical कलाकृतियों समय में सुसंगत आकार और चैनलों के बीच प्रदर्शन और, इसलिए, वे आम तौर पर एक अलग क्लस्टर में वर्गीकृत किया जाता है छंटाई के दौरान, और दर्ज ंयूरॉंस७०के साथ ओवरलैप नहीं है । एक ही समय में, कार्रवाई की क्षमता का एक छोटा सा अंश, जिनमें से waveforms कलाकृतियों द्वारा बदल रहे हैं, अन्य spikes के साथ एल्गोरिदम छंटाई द्वारा समूहीकृत नहीं कर रहे हैं एक ंयूरॉन द्वारा निकाल दिया. लामिना LFP प्रोफाइल विभिंन इलेक्ट्रोड विंयास का उपयोग कर प्राप्त तार arrays (आंकड़ा बी) और रैखिक सिलिकॉन जांच सहित, कलाकृतियों और सच LFP पैटर्न के एक स्पष्ट भेदभाव, पूर्व के निरंतर चरण के आधार पर सक्षम है और बाद के शारीरिक लामिना चरण ऑफसेट । आधारभूत रिकॉर्डिंग से पहले ऐसी विशिष्ट लामिना चरण प्रोफाइल के रूप में विशेषता थीटा सुविधाओं के अंवेषण सक्षम उत्तेजना ।

थीटा दोलनों का Optogenetic नियंत्रण हिप्पोकैम्पस CA1 परत की सभी परतों में थीटा entrainment की ओर जाता है और यहां तक कि contralateral entrainment को भी । यह अगर एक प्रयोग एक स्थानीय उत्तेजना के उद्देश्य से है खाते में ले जाया जाना चाहिए (यदि एक सीमित उपक्षेत्र या एक उपजनसंख्या के एक उत्तेजना के प्रभाव का अध्ययन किया जा करने के लिए उद्देश्य से कर रहे हैं) । दूसरी ओर, एमएस PV+ कोशिकाओं के हिप्पोकैम्पस अनुमानों के स्थानिक सीमित उत्तेजना यहां प्रस्तुत थीटा दोलनों की एक कम नियतात्मक हेरफेर सक्षम बनाता है, यानी, entrainment, की तुलना में दैहिक optogenetic उत्तेजना करता है एमएस PV+ कोशिकाओं को हाल ही में anaesthetized चूहों७१में लागू किया । बाद दैहिक उत्तेजना लगातार ४० हर्ट्ज तक हिप्पोकैम्पस दोलन की आवृत्तियों में परिणाम और इस तरह एक अत्यधिक विश्वसनीय लयबद्ध पेसिंग के मामले का प्रतिनिधित्व करता है. इसके विपरीत, axonal उत्तेजना यहां प्रस्तुत थीटा आवृत्ति बैंड (चित्रा 3सी), और इसलिए अधिक entrainment के समान है, संभवतः में Kuramoto संक्रमण७२, अर्थात्के माध्यम से प्रभावी है, पर काम आवृत्तियों उत्तेजना शुरुआत सहज थीटा दोलनों पर मौजूद लोगों के पास ।

जबकि optogenetic तैयारी यहां वर्णित थीटा दोलन सुविधाओं के हेरफेर सक्षम बनाता है, शारीरिक optogenetic के निषेध एमएस निरोधात्मक न्यूरॉन्स के कुशल निषेध के लिए लागू किया गया है थीटा दोलनों के दौरान शेष नींद७३. दो तकनीकों का एकीकरण का उपयोग कर optogenetic के नियंत्रण का विरोध करने के लिए न्यूरॉन्स (जैसे, 12) संभावित रूप से आगे के अध्ययन के लिए एक ही जानवर में थीटा ताल के द्वि-दिशा नियंत्रण सक्षम कर सकते हैं नेटवर्क दोलनों और व्यवहार के विभिंन पहलुओं के बीच कनेक्शन ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए डेटा विश्लेषण और जेनिफर Kupferman के साथ विशेषज्ञ की मदद के लिए मारिया Gorbati शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था (DFG; Exc २५७ NeuroCure, टी और एपी; प्राथमिकता कार्यक्रम १६६५, 1799/1 (2), हाइजेनबर्ग कार्यक्रम, 1799/2-1, एपी), वैज्ञानिक अनुसंधान और विकास के लिए जर्मन-इजरायल फाउंडेशन (GIF; I-1326-421.13/2015, TK) और मानव सीमांत विज्ञान कार्यक्रम (HFSP; RGY0076/2012, टी) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PV-Cre mice The Jackson Laboratory B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotaxis David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA Model 963 Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument
Drill bits, 0.8 mm Bijoutil, Allschwil, Switzerland 49080HM
0.01-1 ml syringe Braun, Melsungen, Germany 9161406V
Sterican cannulas Braun 26 G, 0.45x25 mm BL/LB
Fine and sharp scissors Fine Science Tools Inc., Vancouver, Canada 14060-09
Forceps Fine Science Tools Inc. 11210-10 Dumont AA - Epoxy Coated Forceps
Blunt stainless steel scissors Fine Science Tools Inc. 14018-14
Soldering station Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany WSD 81
Erythromycin Rotexmedica GmbH, Trittau, Germany PZN: 10823932 1g Powder for Solution for Infusion
Name Company Catalog Number Comments
Optogenetics
Hamilton pump PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA model 703008 PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism
Hamilton 5 µL Syringe, 26 gauge PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Hamilton 5 µL Plunger PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Tubing Fisher Scientific, Pittsburgh, USA PE 20 Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043")
Sterican cannulas Braun, Melsungen, Germany 27 G, 25x0.40 mm, blunt
Precision drill/grinder Proxxon, Wecker, Luxemburg fbs 240/e
Cutting disks Proxxon NO 28812
Cre dependent channelrhodopsin Penn Vector Core, Philadelphia, PA, USA AV-1-18917P Contruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42x1013 vg/ml
Cam kinase dependent halorhodopsin Penn Vector Core AV-1-26971P Construct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml
Multimode optic fiber ThorLabs, Dachau, Germany FG105LCA 0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 - 2400 nm
Ceramic stick ferrule Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA CFLC126 Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um
Polishing paper Thorlabs LF3D 6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet
Power meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD
Multimode fiber optic coupler Thorlabs FCMM50-50A-FC 1x2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC
Fiberoptic patch cord Thorlabs FG105LCA CUSTOM-MUC custom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule
Sleeve Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA ADAL1 Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules
473 nm DPSS laser Laserglow Technologies, Toronto, ON, Canada R471005FX LRS-0473 Series
593 nm DPSS laser Laserglow Technologies R591005FX LRS-0594 Series
MC_Stimulus II Multichannel Systems, Reutlingen, Germany STG 4004
Impedance conditioning module Neural microTargeting worldwide, Bowdoin, USA ICM
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology
Tungsten wires California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USA CFW0010954 40 µm, 99.95%
Capillary tubing Optronics 1068150020 ID: 100.4 µm
Omnetics nanoconnector Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, USA A79038-001
Screws Bilaney, Düsseldorf, Germany 00-96x1/16 stainless-steel
Silicone probe NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USA B32
Headstage Neuralynx, Bozeman, Montana USA HS-8 miniature headstage unity gain preamplifiers
Silver conductive paint Conrad electronics, Germany 530042
Liquid flux Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Germany Lötöl ST DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)
LED Neuralynx HS-LED-Red-omni-10V
Name Company Catalog Number Comments
Software
MATLAB Mathworks, Natick, MA, USA
MC_Stimulus software Multichannel, Systems
Neurophysiological Data Manager NDManager, http://neurosuite.sourceforge.net
Klusters http://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006
Software of the recording system Neuralynx Cheetah https://neuralynx.com/software/cheetah
Multi-channel data analysis software Cambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GB Spike2

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