Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57349
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2
1Systems Neurophysiology Research Group, Institute of Clinical Neuroscience and Medical Psychology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Behavioural Neurodynamics Group, Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP)/ NeuroCure Cluster of Excellence, 3Neuronal Circuits and Behavior Research Group, Max Planck Institute for Metabolism Research

Summary

Describimos el uso de optogenetics y grabaciones electrofisiológicas para la manipulación selectiva de oscilaciones de hippocampal de la theta (5-10 Hz) en ratones de comportarse. La eficacia del arrastre de ritmo se controla usando el potencial de campo local. Una combinación de opto - e inhibición farmacogenética aborda la lectura eferente del hipocampo sincronización.

Abstract

Datos extensos sobre las relaciones de las oscilaciones de la red de los nervios al comportamiento y organización de descarga neuronal en regiones cerebrales convocatoria de nuevas herramientas manipular selectivamente ritmos cerebrales. Aquí se describe un enfoque que combina proyección específica optogenetics con electrofisiología extracelular para alta fidelidad control de oscilaciones de hippocampal de la theta (5-10 Hz) en ratones comportarse. La especificidad de la optogenetic de arrastre se logra apuntando channelrhodopsin-2 (ChR2) a la población de GABAérgico de células septales mediales, crucialmente implicadas en la generación de oscilaciones de la theta del hipocampo, y un local sincronizado activación de un subconjunto de los aferentes septales inhibitorios en el hipocampo. La eficacia del control de ritmo optogenetic es verificada por un seguimiento simultáneo del local campo potencial (LFP) a través de la lámina de la zona CA1 y de la descarga neuronal. Utilizando esta preparación fácilmente implementable muestran eficacia de diferentes protocolos de estimulación optogenetic para la inducción de las oscilaciones de la theta y la manipulación de la frecuencia y regularidad. Por último, una combinación del control de ritmo theta con la inhibición específica de proyección aborda la lectura de determinados aspectos de la sincronización hipocampo regiones eferentes.

Introduction

La actividad neuronal en los mamíferos es coordinada por las oscilaciones de la red, que ayudan a la transferencia de información dentro y entre el cerebro regiones1,2,3,4. Ritmos cerebrales son oscilaciones que van desde muy lento (< 0,8 Hz) hasta ultra rápida (> 200 Hz) frecuencias. Un cuerpo grande de evidencia apoya participación de oscilaciones de la red en las funciones cerebrales diversas, incluyendo la cognición5,6,7,8,9,10 , comportamientos naturales11,12 , así como trastornos neuropsiquiátricos como la enfermedad de Parkinson y epilepsia13,14,15. Selectivos y temporal precisos métodos para la manipulación experimental de las oscilaciones de la red por lo tanto son esenciales para el desarrollo de modelos fisiológicamente plausibles de la sincronización y para establecer relaciones causales con el comportamiento.

Sincronización de red está mediada por procesos, que van desde la identidad molecular de los canales iónicos y su cinética de neuromodulación de la excitabilidad y conectividad de red y diversos substratos biológicos. El diseño biológico de ritmo generadores16 ha sido revelado por muchos aspectos distintos (p. ej., frecuencia, amplitud), ritmos cerebrales son a menudo provocada por la dinámica de redes y tipos de células distintas. Por ejemplo, interneuronas inhibitorias dirigidas a los Somas de las células principales son los jugadores más importantes a través de las bandas de frecuencia y cerebro regiones17,18, incluyendo theta19,20, gamma20 , 21y22 oscilaciones de ondulación (140-200 Hz). A su vez, sincronización de la fase de células distantes es asegurada por robusto feed-forward de señalización de las células piramidales, que restablece la leña de interneuronas. Un parámetro fundamental de oscilaciones, el tamaño de la población neuronal sincronizada, está estrechamente relacionada con la amplitud de la oscilación medida de LFP y, al menos para las oscilaciones rápidas, depende de la unidad excitadora sobre interneuronas2. Por el contrario, las oscilaciones más lentas, como ritmos de la theta y delta son generadas por largo alcance bucles reentrantes, formados por cortico-talámico23,24 y proyecciones septal medial hipocampo25, 26,27, respectivamente. Oscilaciones en dichos circuitos son generadas por interacciones de retardos de propagación de señal, excitables respuestas y sus preferencias de frecuencia en células participantes de28,29,30, 31 , 32. proyecciones inhibitorias de GABAérgico parvalbúmina (PV)-células del septo medial (MS) a interneuronas en el hipocampo25,33, regiones de parahippocampal y entorhinal cortex26 son positivas esencial para la generación de oscilaciones de la theta en el lóbulo temporal medial. Así, los mecanismos fisiológicos de las oscilaciones de la red y sincronización neuronal pueden ser manipulados usando optogenetics con una precisión en tiempo real.

Manipulaciones de células optogenetic tipo-específicas se han aplicado para estudios de oscilaciones corticales y hippocampal en vitro34,35,36,37,38 y en vivo30,39,40,41,42,43,44,45, incluyendo funcional las investigaciones de gamma5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52 y ondulación oscilaciones40,53,54 y sueño husos55,56. Recientemente, expresamos un virus dependiente de la Cre ChR2 en la MS, una región clave para la generación del ritmo hippocampal de la theta, de ratones PV-Cre. Con esta preparación, características de las oscilaciones theta hippocampal (frecuencia y estabilidad temporal) fueron controlados por el estímulo optogenetic de proyecciones inhibitorias de la MS en el hipocampo11. Además, estimulación de frecuencia theta optogenetic de proyecciones FCSP-hippocampal inhibitorias evoca ritmo theta durante inmovilidad despierto. La optogenetically arrastrado ritmo theta muestran propiedades de oscilaciones theta espontánea en el ratón en la LFP y los niveles de actividad neuronal.

Características principales de este protocolo son: (1) utilización de una vía inhibitoria que es fisiológicamente importante para oscilaciones theta espontánea evitando efectos inespecíficos en la excitabilidad del hipocampo; (2) axonal, es decir, estímulo específico de proyección para minimizar una influencia directa sobre no hippocampal MS eferentes; (3) local theta rítmica estimulación de luz, asegurando una mínima interferencia directa con theta rítmica dinámica FCSP-hipocampo y un arrastre global bilateral de las oscilaciones theta; (4) paramétrico control de frecuencia de las oscilaciones theta y regularidad; y (5) cuantificación de fidelidad de arrastre con alta resolución temporal con la LFP para permitir análisis de causalidad cuantitativa en comportamiento de animales. Ya que esta preparación esencialmente capitaliza un papel bien conocido de la FCSP-hippocampal desinhibición en theta generación25,30, permite control robusto sobre varios parámetros de las oscilaciones de la theta en comportarse ratones. Estudios donde menos investigados caminos y tipos de la célula de la circuitería de FCSP-hipocampo fueron manipulan38,39,47,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 además revelar mecanismos del ritmo theta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

PV-Cre knock-en ratones machos59, 10-25 semanas de edad, fueron utilizados. Ratones fueron alojados bajo condiciones estándar en las instalaciones de animales y mantenidos en un ciclo de 12 h luz/oscuridad. Todos los procedimientos fueron realizados con arreglo a directrices nacionales e internacionales y fueron aprobados por las autoridades sanitarias locales (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen).

1. viral inyección

  1. Durante todo el procedimiento, siga las directrices de seguridad biológica60. Usar una bata de laboratorio, una mascarilla quirúrgica, una redecilla y dos pares de guantes.
  2. Corte el tubo con tijeras o bisturí estéril de aproximadamente 1 m de longitud, introducir en el bloque de soporte de la jeringa de la bomba y arreglarlo.
    1. Llenar el tubo con aceite de silicona mediante el uso de la jeringa.
    2. Compruebe si aparecen burbujas de aire en la tubería. Si se observan burbujas de aire, llenar el tubo otra vez con aceite.
    3. Fijar el émbolo para el bloque de empuje.
    4. Haga avanzar lentamente el empujador hacia el bloque de soporte de la jeringa hasta que la punta del émbolo toca la tubería.
    5. Inserte la punta del émbolo en el tubo y mover automáticamente el bloque de empuje hacia adelante a una velocidad lenta seleccionando "Infundir" en la ventana de comandos y una tasa de infusión bajas (p. ej., 500 nL/min) hasta que alcanza el bloque de soporte de jeringa.
  3. Preparar la aguja de inyección (34G).
    1. Retire el eje de la aguja con un claro corte mediante un taladro/grinder precisión conectado a un disco de corte. Si es necesario, utilice una aguja para eliminar residuos de metal de la superficie recién cortada.
    2. Tubo capilar (3-4 cm de longitud) del hilo de rosca a través de la aguja.
    3. Pegue el tubo de la aguja con pegamento.
    4. Conecte la aguja de inyección hasta el final del tubo, que conecta a la bomba de la microjeringa.
  4. Conecte la aguja en el soporte estereotáxicas.
  5. Retire el aire hasta que una burbuja de aire en el tubo transparente por encima de la aguja es visible.
  6. Anestesiar el ratón con 1.5-3% de isoflurano en oxígeno. Esperar aproximadamente 2-3 min, luego confirmar que el ratón es totalmente anestesiado por evaluar su respuesta a un pellizco del dedo del pie. A lo largo de la cirugía supervisar la respiración del animal y ajustar la concentración de isoflurano si es necesario.
  7. Coloque el ratón en el marco estereotáctico usando titulares no traumática de la oreja.
  8. Proteger los ojos del ratón con un gel de lípidos.
  9. Inyectar la lidocaína 0,1 mL por vía intradérmica en la piel principal usando un 0.01-1 mL jeringa y una cánula de inyección 26G.
  10. Afeitarse y desinfectar con solución de etanol la cabeza del ratón. Luego alternar la clorhexidina 2% tres veces con etanol para la desinfección del sitio quirúrgico.
  11. Realizar una incisión de línea media con unas tijeras finas y afiladas va entre la parte posterior de las orejas hasta el nivel de los ojos para que el bregma y lambda son visibles.
  12. Limpiar el cráneo aplicando aproximadamente 50 μl de NaCl mediante una jeringa y secar con un pañuelo de papel y un soplo de aire.
  13. Posición de la cabeza de ratón ajustando el nivel dorso-ventral de la pinza de la nariz para que el bregma y lambda son en el mismo nivel dorso-ventral (± 0,3 mm).
  14. Perfore un agujero encima de la MS (AP 0.98 y L 0,5 mm en el vértice).
  15. En este punto, descongele una alícuota del virus (debe contener por lo menos 2 μl de AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
  16. Centrifugue la alícuota a aproximadamente 4.000 x g a temperatura ambiente durante 1 minuto.
  17. Pipeta 2 μl del virus sobre un trozo de Parafilm; Utilice el lado previamente protegido.
  18. Sumerja la punta de la aguja de inyección en el líquido y retirar con cuidado a cerca de 500 nL/min mientras observa el nivel del líquido. Para evitar la aspiración de aire, deje de retirada antes de que el virus es totalmente tomado. Ajustar la tasa de retiros según la viscosidad de la solución; un ritmo más rápido puede facilitar la retirada de un virus con una viscosidad más alta.
  19. Limpie la aguja con un pañuelo de papel.
  20. Comprobar que el virus está contenido en el tubo y el virus y el aceite están separados por una burbuja de aire. Marque el nivel del virus en el tubo para controlar si el virus está impregnado con éxito durante la inyección.
  21. Coloque la aguja sobre la craneotomía e introduzca lentamente en el cerebro en el primer punto de la inyección (AP 0.98, L 0.5, V-5.2, lateral de 5,5 °).
  22. Inyecte 450 nL del virus a razón de 100-150 nL/min esperar 10 minutos cuidadosamente mueva la aguja hasta 0.1 mm y espere otros 5 minutos.
    1. Mover la aguja hasta el segundo punto de la inyección (AP 0.98, L 0.5, V-4.6) e inyectar otro 450 nL en 100-150 nL/min.
    2. Espere 10 minutos antes de mover la aguja hasta 0,1 mm. Espere otros 5 minutos antes de retirar la aguja otra vez
  23. Sutura la incisión con sutura seda negra trenzada con nudos cuadrados. Caliente al animal con una luz roja para acelerar la recuperación. Administrar antibióticos (0,3 mL Erycinum (1:4 en NaCl estéril)) y carprofeno i.p. diario 2-3 días después de la cirugía.
  24. Corte el tubo por encima de la marca que indica el nivel del virus. El tubo puede utilizarse para más inyecciones. Preparar una aguja de inyección fresca antes de cada inyección.
    Nota: Esta cirugía toma aproximadamente 1-1.5 horas. El animal se despierta normalmente dentro de 5 minutos después de la cirugía. Espere un mínimo de 6 semanas para la expresión axonal suficiente pero no más de 5 meses antes de realizar implantes stereotactic, como niveles de expresión comienzan a disminuir aproximadamente 6 meses después de la inyección del virus.

2. preparación de fibras ópticas (figura 1A)

  1. Uso de fibra óptica multimodo (105 μm núcleo, vidrio con base de silicona, NA 0.22). Revestimiento de la base de la fibra utilizando una micro-stripper mientras que la fibra es colocada en el carrete de fibra en tira 125 μm.
  2. Cortar la fibra a una longitud de aproximadamente 2-3 cm con un cuchillo de diamante.
  3. Inserte la fibra en una virola de palillo de cerámica de zirconia (ID: 126 μm). Aproximadamente 0.5-1 mm de la fibra óptica debe sobresalir de la parte convexa de la virola.
  4. Utilizando una aguja, aplique una gota de pegamento epóxico en ambos extremos de la férula pero no a los lados de la abrazadera. Como alternativa, utilizar pegamento.
  5. Deje que el pegamento se seque durante al menos 30 minutos.
  6. Polaco el lado convexo de la virola mediante diamante lapping fibra pulido (3 μm Arenas) la película.
  7. Prueba de la fidelidad de la transferencia de luz usando un medidor de potencia óptica.
    1. Establecer la longitud de onda en el medidor de potencia para la misma longitud de onda como el láser se utiliza.
    2. Posición de la cuerda de remiendo con la punta hacia el centro del sensor. Encienda el láser y leer la salida de luz desde el medidor de energía. Registre el valor.
    3. Conectarse el cordón a través de un manguito de acoplamiento de la fibra óptica y posición con la punta de la fibra hacia el centro del sensor. Encienda el láser y leer la salida de luz desde el medidor de energía. Registre el valor.
    4. Calcular la tasa de transmisión: dividir el segundo valor por el primer valor. Si la tasa de transmisión es inferior a 0.5, deseche la fibra, de lo contrario usarlo para la implantación.
    5. Prueba la velocidad de transmisión para cada fibra antes de la implantación.
    6. Para los experimentos posteriores, ajuste la salida de intensidad de la luz del láser a la velocidad de transmisión de la fibra óptica: fijar la salida de luz de la punta de la cuerda de remiendo a 5-15, dividido por la tasa de transmisión para lograr una potencia final de la punta de la fibra de 5 a 15 mW.
      Nota: Ver también Ref. 61 para la preparación de fibras ópticas.

3. preparación del alambre de tungsteno de matrices para la LFP grabaciones (figura 1B)

  1. Pegue varios (por ejemplo 6) 100 μm guías de tubo de silicona en paralelo con el lado pegajoso de una pieza de cinta. Corte una pieza, aproximadamente 4-6 mm, para montaje de un cable serie.
  2. Hilo formvar 45 μm tungsteno alambres a través de los tubos de guía usando fórceps.
  3. Tira seis aislado fina Unión cobre alambres (aproximadamente 5 mm de largo) y un cable de tierra (aproximadamente 2-3 cm de largo) usando un bisturí raspe el aislamiento en ambos extremos. Soldarlos a las patillas de nanoconnector.
  4. Conecte cada cable pegado al alambre de uno tungsteno usando una gota de barniz conductor de plata, respectivamente. Dejar secar durante al menos 30 minutos.
  5. Aplique una cantidad mínima de cemento para cubrir los cables. No aplicar cemento en los alambres de tungsteno, que se inserta en el tejido cerebral o en la parte superior de la nanoconnector. Deje que el cemento seco durante al menos 30 minutos.
  6. Realizar un corte angular (5-20°) de los cables de tungsteno utilizando tijeras de acero inoxidable embotados para permitir la implantación fiable de cables por debajo o por encima de la zona ventral adyacente al pyramidale del estrato, donde la amplitud de la theta es demasiado baja para la estimación de la fidelidad de arrastre.
  7. Deinsulate la punta (aproximadamente 2 mm) del cable de conexión utilizando un bisturí raspe el aislamiento. Tratar con flujo y presolder.
  8. Comprobar posibles Cruz-conversaciones entre electrodos utilizando un digital multímetro. Para ello, conectar las patillas del conector con el multímetro, que se debe establecer en el modo de medición de resistencia. Comprobar combinaciones de pares de canales; una lectura en el multimetro debajo de MΩ 5 indica conversaciones significativas.
  9. Verifique la impedancia de cada electrodo de alambre en solución salina con un medidor de impedancia. Valores de impedancia típica están por debajo de 100 kΩ.
  10. Para facilitar la implantación, pegue una fibra óptica a la matriz de alambre para que la punta de la fibra está a la altura del cable más corto y la punta de la fibra está en proximidad cercana, pero no tocar los cables de tungsteno. Mantener el ángulo de la fibra más pequeña posible para evitar daño de tejido durante la implantación.
    Nota: Ver también Ref. 62 para la fabricación de matrices de alambre de tungsteno.

4. estereotáxicas implantes

  1. Realizar preparaciones como se describe en pasos 1.6-1.13.
  2. Retire el tejido conectivo de la parte superior del cráneo y empuje hacia abajo de los músculos del cuello bien por aproximadamente de 2 mm para evitar artefactos musculares durante la grabación.
  3. Limpiar el cráneo usando un aplicador de punta de algodón y una solución salina y taladre 4 agujeros (2 en la parte frontal) y 2 por encima del cerebelo, diámetro de 0,8 mm para tornillos de acero inoxidable de hueso (00-96 x 1/16) para el suelo y la estabilización del implante (figura 1). Coloque el tornillo a tierra, conectado a un alambre de cobre (aproximadamente 2-3 cm de longitud) sobre el cerebelo.
  4. Cubre el tornillo de tierra completamente con cemento para evitar artefactos de músculo durante las grabaciones electrofisiológicas. Construir un anillo de cemento conectando todos los tornillos (Figura 1E).
  5. Realizar una craneotomía sobre la parte de implantación (hipocampo, AP-1.94, 1.4 L, V 1.4 en referencia el bregma). Aplicar aproximadamente 5 μl de NaCl estéril sobre la superficie del tejido de cerebro.
  6. Baje lentamente la matriz de alambre mediante stereotaxis en la craneotomía. Para las grabaciones unitarias, implante una sonda de silicona en lugar de una matriz de alambre63; con el fin de evitar artefactos luz optoeléctricos, implantar la fibra óptica por separado en el hipocampo con la punta de la fibra no directamente frente a la sonda (figura 1 -I). Para la investigación de la coordinación del arrastre entre hemisferios, implante un adicional de fibra óptica en la zona de CA1 de hipocampo contralateral.
  7. Aplicar aproximadamente 5 μl de aceite de cera/parafina líquida caliente, precalentado a 70 ° C, con una jeringa sobre el sitio de implantación para proteger los tejidos del cerebro.
  8. Aplicar el cemento alrededor de la matriz de alambre y cubrir el cráneo con cemento.
  9. Aplique una gota de flujo el cable de tierra de referencia presoldered y el presoldered alambre conectado a tierra al tornillo por ejemplo utilizando una aguja y fundir los cables utilizando una máquina de soldadura.
  10. Cubrir el alambre de tierra todo con cemento.
  11. Administrar 0.3 mL Erycinum (NaCl estéril de 1:4) y i.p. carprofen (5mg/mL) después de la cirugía y para al menos los dos días siguientes. El ratón normalmente se despierta dentro de 15 min después de la cirugía. Caliente al animal con una lámpara roja para acelerar la recuperación.
  12. Vigilar diariamente el peso del ratón durante la primera semana después de la cirugía o hasta que el peso es estable. Pérdida de peso no debe exceder el 10% del peso del ratón antes de la cirugía. Para acelerar la estabilización del peso, la fuente del ratón con comida húmeda y leche condensada durante los primeros días después de la cirugía.
  13. Para grabar la actividad celular hipocampal durante el arrastre, implante una sonda de silicona en el hipocampo (AP-1.94, 1.4 L, V 1, con posterior descenso) como se describe en Ref. 62 (figura 1 -I). Implantar la fibra óptica en el hipocampo en AP -3, 1.4 L, 1.6 V, 39 ° caudal y rostral. Implante de una fibra óptica adicional en las MS (AP +0.98, L 1, 3.9 V, lateral de 15 °) si se desea la estimulación de Somas celulares.

5. Optogenetic estimulación y adquisición de datos electrofisiológicos

  1. Habituar el ratón a la configuración de grabación (por ejemplo, sesiones de 15 min, 1-2 sesiones al día durante 3 días). Examinar el comportamiento del animal antes de comenzar con los primeros experimentos. Si el ratón se mueve en la cámara, explorar el entorno, oliendo, realización de crias, etc., iniciar la primera sesión experimental.
  2. Coloque el ratón en una cámara familiar en ausencia de otros animales en la misma habitación.
  3. Conecte un LED a la cabeza-etapa utilizando cinta adhesiva para seguir la posición del animal. Asegúrese de que la luz es capturada por la cámara durante todo el período que el animal está explorando la cámara de grabación antes de comenzar los experimentos. Grabar en la oscuridad para seguir la luz. Coloque una cámara encima de la cámara de grabación.
  4. Compruebe la salida de luz de la cuerda de remiendo. Estimar la intensidad de luz desde la punta de la fibra después de la conexión según tarifa de la transmisión de la fibra implantada. Asegúrese de que la salida de luz de la punta de la fibra es entre 5-15 mW, para habilitar el arrastre confiable.
  5. Conectar el preamplificador headstage al conector crónicamente implantado. Conecte la cuerda de remiendo de fibra óptica a la fibra hippocampal crónicamente implantada para los experimentos de estimulación optogenetic. En experimentos de control de estímulo luz, conectar la fibra óptica a un maniquí virola conectado al auricular.
  6. Coloque el ratón en la cámara de grabación.
  7. Abra el software para controlar el generador de estímulos para generar el protocolo de estimulación.
  8. Seleccione el canal que controla el láser DPSS 473. En la primera fila entre 3.000 mV (1ª columna), tiempo ms 30 (2ª columna), valor de 0 mV (columna 3), tiempo 112 ms (4ª columna), la fila repita 840 y grupo 1 repetición, para generar un protocolo de 2 min de estimulación de 7 Hz con pulsos largos de ms de 30. Ajustar la duración del tiempo en la 4 º columna y número de repeticiones de la fila si es necesario el estímulo en otra frecuencia o una duración diferente. En la segunda fila seleccionar 0 mW (1ª columna), tiempo 500 h (2ª columna), fila de repetición 1 y el grupo 1, para asegurarse de que el láser es apagado después de terminado el protocolo de estimulación.
  9. Haga clic en "archivo > Guardar como" y guarde el archivo con un nombre deseado.
  10. Asegurar que el estimulador TTL salida disparo del láser está conectado a la tarjeta de entrada analógica Digital lince para sincronizar la adquisición de electrofisiológicos y datos optogenetic.
  11. Por otra parte, para regular la forma paramétrica la variabilidad de la frecuencia de oscilación de la theta, aplicar trenes de pulsos de luz en diferentes intervalos entre pulsos, con períodos siguiendo una distribución gaussiana. Modificar la dispersión del pulsos entre intervalos para diferentes protocolos, por ejemplo, en el paso 3.2 a 15.1 ms2. Aplicar estos protocolos para generar épocas theta con la diferente variabilidad de la frecuencia de la theta (figura 6).
  12. Abra el software del sistema de grabación. Haga clic en "ACQ" adquirir y "REC" para grabar. Esperar antes de la iniciación del estímulo luz para registrar el comportamiento de la línea de base (por ejemplo, 2 minutos para recuperar la velocidad de línea de base o 30 min para extraer los campos de lugar de referencia).
  13. Abra el software para controlar el generador de estímulos. Haga clic en "Archivo > abrir" y seleccione el archivo de protocolo de elección. Haga clic en "Descargar y empezar" para iniciar la estimulación de luz.
    Nota: El experimento puede ser examinado, y la estimulación comenzó a través de control remoto; Esto excluye la influencia de la presencia del experimentador sobre el comportamiento del animal. Dependiendo el objetivo del estudio, estimulación puede ser iniciada y terminada en comportamientos específicos.

6. un enfoque combinado para el arrastre de Optogenetic y la inhibición específica de la proyección de la salida del hipocampo

  1. Expresar ChR2 en células GABAérgicas MS de ratones PV-Cre, como se describe en la sección 1.
  2. Además, inyectar un total de 2.4 μL de CamKIIα halorodopsina dependiente (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) en ambos hemisferios hipocampales dorsales (AP-1.7; L ± 1.05; V-2.05 y - 1.4 mm; AP-1.7; L ± 1.7; V-2.05 y - 1,55 m; AP -2,3; L ± 1.5; V-2.2 y - 1.3 mm; AP -2,3; L ± 2.2; V-1.65 y - 2.45 mm).
  3. Permite 6 semanas de tiempo de expresión.
  4. Implante de una matriz de alambre de tungsteno con fibra óptica en la región CA1 hipocampal, como se describe en la sección 4. Además, implantar fibras ópticas bilateralmente en el tabique lateral (LS, AP 0.1, L 0.25 V-2,250 mm y AP 0.5, L -0,3, V-2,70 mm).
  5. Realizar experimentos de arrastre optogenetic theta como se describe en los pasos 5.4-5.5.
    1. Para la inhibición simultánea de la salida del hipocampo a la LS, generar una generación de estímulo de protocolo: p. ej., disparador del inicio del canal de salida conectado al 593 nm DPSS láser 15 s con un pulso continuo que dura en total 45 s, antes de accionar la salida de pulsos para el láser DPSS 473.
    2. Conectar ambas fibras en el LS por latiguillos utilizando un acoplador óptico de fibra multimodo a un láser DPSS 593.
    3. Iniciar la grabación y descargar y activar el protocolo para el control de la generación del estímulo.

7. procesamiento de datos

  1. Convertir las señales electrofisiológicas y coloque los datos de seguimiento con el Gerente de datos neurofisiológicos (ND) a formato .dat y .pos, respectivamente64.
  2. Obtener la LFP por filtrado de paso bajo y de abajo-muestreo de la señal de banda ancha a 1.250 Hz usando Gerente ND66.
  3. En cada grabación, seleccionar el canal con la máxima amplitud de theta oscilaciones (usando Neuroscope)19.
  4. Detectar las marcas de tiempo de los pulsos del láser y de las épocas de la estimulación con un umbral de detección del algoritmo (utilizando MATLAB función findpeaks.m o similar)11.
  5. Para importar el archivo .dat en un software de análisis de datos multicanal, haga clic en "Archivo > Importar", selecciona "binarios" como el tipo de datos y seleccione el archivo de .dat. En el cuadro de diálogo de configuración, escriba el número correcto de canales y una velocidad de muestreo de 1.250 Hz, haga clic en "Aceptar" y guardar como archivo de .smr. Trama de espectros de potencia seleccionando "Análisis > nuevo resultado Ver > PowerSpectrum". En la configuración, seleccionar el canal con la mayor amplitud de theta y 16.384 tamaño FFT, haga clic en "Nuevo", definir como "Hora de inicio" el principio de la época de estimulación y como "Tiempo final" el final de la época de estimulación y haga clic en "Proceso".
  6. Calcular la fidelidad de arrastre como el cociente de la densidad espectral de potencia acumulativa (PSD) dentro de la gama de frecuencia de estimulación de optogenetic (estimulación frecuencia ± 0,5 Hz), para el PSD acumulado en la banda theta (5-12 Hz) con el método multitaper (NW = 3, tamaño de la ventana 8.192) para 10 épocas de s (p. ej., kit de herramientas < http://chronux.org/>).
  7. Excluir la grabación épocas donde el pico dominante de PSD es ≤ 5 Hz de análisis (no-theta épocas, utilizando MATLAB función find.m).
  8. Trama de la trama de los espectros de energía de la LFP para todas las épocas registradas según la fidelidad de arrastre computada (usando pcolor.m y sortrows.m de funciones MATLAB). Cargar los espectros de potencia y arrastre fidelidad haciendo clic en "File > Open", almacenan pulg tipo potencia variable = sortrows(In,1); Pcolor(Power(:,2:end)).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Orientación de ChR2 células GABAérgicas en el MS como se describe en la sección 1 se ilustra en la figura 2A. Optogenetic estimulación de los axones de células GABAérgicas MS en el hipocampo dorsal a través de una fibra óptica que se implanta encima de la zona CA1 arrastra las oscilaciones de la theta en la frecuencia del estímulo en el ipsilateral (figura 2B) y contralateral Hemisferio (figura 2). Oscilaciones de la theta pueden ser más o menos eficientemente arrastradas por la estimulación de la optogenetic (Figura 3A), la eficacia de la que se calculó para cada época de la grabación como una theta relativa potencia LFP alrededor de la frecuencia de estimulación, es decir, fidelidad de arrastre (figura 3B). Fidelidad de arrastre por encima de 0.3, es decir, mayor que en las grabaciones apagado espontáneas, se observó en aproximadamente el 80% de las épocas de grabación. Optostimulation en las frecuencias theta no era menos eficaz (figura 3).

Explícita , es decir, paramétrica manipular oscilaciones theta frecuencia se acompaña de cambios emergentes de regularidad de la theta: la regularidad temporal de la amplitud y la frecuencia de las oscilaciones de la theta fue aumentadas durante épocas de alta fidelidad de arrastre. La estabilidad de las oscilaciones se puede regular de forma paramétrica mediante la aplicación de los trenes de pulsos ligeros, períodos de los cuales siguen distribuciones Gaussianas con diferentes dispersiones (figura 4).

Optogenetic control de la frecuencia de las oscilaciones elimina la correlación entre la frecuencia de la theta y velocidad, de acuerdo con el control de frecuencia mediante el MS por ascendentes aferentes durante el movimiento (figura 5A). Optostimulation también induce oscilaciones theta durante la inmovilidad (figura 5B). Las fases de cocción preferencial en el área CA1 en supuestas células piramidales y interneurons se modificaron en relación con la oscilación de theta optogenetically arrastrado comparado con theta espontáneo (figura 6).

Para estudiar la contribución del hipocampo a la vía lateral del tabique en la regulación theta-mediada de la locomoción, nos optogenetically inhiben esta vía. Halorodopsina (eNpHR3.0) bilateral fue expresada en las células piramidales hipocampales (Figura 7A), mientras que ChR2 fue expresado en las células GABAérgicas MS como por encima y las oscilaciones de la theta se optogenetically arrastrado (figura 7B). El arrastre de theta reducida variabilidad de funcionamiento velocidad pero no cuando el hipocampo a la vía del LS fue inhibido (figura 7).

Figure 1
Figura 1: ilustración de fibras ópticas, electrodos y cirugía. Ilustración (A) de una fibra óptica. (B) ejemplo de una matriz de alambre pegada a una fibra óptica para la grabación de LFP hipocampo durante el arrastre de las oscilaciones theta hippocampal. (C) para la grabación de la actividad celular hipocampal, una sonda de silicona se monta en un microdrive. (D) tornillos miniatura se encuentran en el cráneo. Los alambres de cobre se presoldered al suelo y referencia de tornillo antes de colocar sobre el cerebelo. Cemento (E) se aplica para cubrir y conectar los tornillos. El circulo azul superior indica que la craneotomía fue realizada para la implantación de la sonda de silicona. Menor círculo azul indica donde la craneotomía fue realizada para la implantación de la fibra óptica en el hipocampo. Fibra óptica (F) uno se implanta en un ángulo caudal rostral a la región CA1 hipocampal. Una segunda fibra puede ser implantado en el tabique medial si se desea el estímulo de Somas celulares (opcional). Punta de prueba (G) la silicona se baja apenas sobre el área CA1 hipocampal. (H) las fronteras del microdrive y el conector se cementan a los implantes y la tierra, y se sueldan los cables de referencia. () Cobre malla está fabricada para rodear el implante y servir como una jaula de Faraday. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: preparación para arrastre de hippocampal de la theta optogenetic. ChR2 (A) se expresó en células septales mediales del PV+ en ratones PV-Cre (esquema superior). Fluorescencia brillante en MS (1, 2) confirma construcción exitosa expresión en Somas. Las fibras MS proyectan vía fórnix (f) y la fimbria (fi) al hipocampo (3-6); aca: comisura anterior; parte anterior. HDB: núcleo de la rama horizontal de la banda diagonal; O: estrato oriens. La fibra óptica para la estimulación de la optogenetic con la luz azul se implanta encima de la capa piramidal del hipocampo área CA1 (esquema inferior). Barras de escala: (imágenes 1, 3, 4) de 500 μm y 50 μm (imágenes 2, 5, 6). (B) LFP Hippocampal durante las oscilaciones de la theta espontánea (izquierdas) y 7 Hz (medio) o Hz 10 arrastre de optogenetic (derecha). Rayas azules indican las ventanas de tiempo de aplicación ligera. Tenga en cuenta la fase de reajuste por el pulso de luz indicado por una flecha. Nota gamma sobres durante theta espontánea y ocluido, un indicador del ritmo theta fisiológica. Fase de reversión entre estrato oriens (Str. o.) y radiatum del estrato (Str. reportes) se mantiene también durante el arrastre. (C) arrastre es confiable durante ipsolaterales (parcelas superiores), así como contralaterales (parcelas inferiores) estimulación de optogenetic. Esquemas ilustran posiciones de fibras respecto a posiciones de electrodos. Se muestran rastros LFP ejemplo en theta y la aplicación de pulsos de luz en el medio. A la derecha, alimentación de espectros de LFP hippocampal durante ipsi - y contralateral estimulación codificadas por colores según la frecuencia de estimulación. Esta figura ha sido modificada de ref. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: fidelidad del arrastre de hippocampal de la theta optogenetic. (A) ejemplo hippocampal LFP rastros durante la fidelidad de arrastre bajo y alto. (B) las densidades espectrales de 10 épocas de s de energía espontánea theta, con registros ordenados según principales frecuencia theta (izquierda) y durante 7 Hz (medio) y estimulación de 10 Hz optogenetic (derecha), con registros ordenados según fidelidad de arrastre. Espectros de potencia ejemplo respectivo (indicados por una flecha) se trazan por encima. Nota fidelidad confiable arrastre a través de las épocas. A la derecha, se muestra la probabilidad acumulada de la fidelidad de arrastre para las frecuencias de la theta. (C) arrastre requiere estimulación rítmica theta. Actividad de la red hipocampo puede con éxito arrastrada con frecuencias entre 6-12 Hz. A bajas frecuencias (por ejemplo, 2 o 4 Hz) o mayor arrastre de frecuencias (e.g., 20 Hz) no es confiable. Esta figura ha sido modificada de ref. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: manipulación paramétrico de regularidad de las oscilaciones theta. (A) estímulo fue aplicado a diferentes frecuencias dentro de la gama theta con una frecuencia media de 7,8 Hz siguiendo una distribución gaussiana. La desviación estándar de los intervalos entre pulsos se incrementó a través de protocolos de σ = 3.19 a σ = 15.09. En total, 11 protocolos fueron generados y aplicados, cada uno con una duración total de la época de estimulación de 1 minuto. De las personas, la distribución de probabilidad de 5 protocolos aparecen en la izquierda de la figura. Las densidades espectrales de potencia dentro de un rango de 1-14 Hz de la LFP hipocampal durante la aplicación de los protocolos respectivos se trazarán en el centro de la figura. Las probabilidades de los períodos de theta durante la aplicación de los protocolos respectivos se ilustran a la derecha. Intervalos de pulsos entre (B) la varianza de la aplicación determinaron la variación del período concurrente theta (r de Pearson = 0.94, p = 0.0002). (C) la relación entre la variabilidad de amplitud theta y el pulso entre intervalo (r de Pearson = 0,61, p = 0,08). Esta figura ha sido modificada de ref. 70. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: arrastre rítmica de Optogenetic theta determina LFP hippocampal durante comportamiento. (A) Optogenetic estimulación frecuencia determina la frecuencia theta durante la locomoción. Por lo tanto, aferentes relacionadas con la velocidad de impacto frecuencia theta hippocampal, y como consecuencia, velocidad no se correlaciona con la frecuencia theta (azul) ya que es durante el espontáneo theta (negro). Los datos se presentan como media ± SEM (B) durante la vigilia tranquila, theta hippocampal puede ser sacado en ausencia de movimiento. Hippocampal rastros LFP antes y durante el arrastre exitoso se muestran por encima de, y a continuación se muestran las trazas de velocidad ejemplo registrados durante el arrastre (el rastro rojo corresponde a la traza LFP hippocampal representada arriba). Franjas azules marcan las ventanas de tiempo de pulsos de estimulación de luz. Esta figura ha sido modificada de ref. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: actividad celular hipocampal durante el arrastre theta. Se registró actividad celular (A) usando puntas de prueba de silicona (esquema). Solo interneuronas y células piramidales fueron aisladas e identificadas según su forma de onda respectiva. Se muestra aquí es la forma de onda media (medio) y auto-correlogram de una célula piramidal aislado de ejemplo. (B) fase de descarga preferido de las células piramidales (Pyr) no fue diferente durante el espontáneo (en negro, n = 29 neuronas) y optogenetically arrastrado (en azul, n = 30) theta (p = 0,79). (C) se muestra aquí es la auto-correlogram (izquierda) y fase de disparo preferencial de una interneurona de la rápido-leña durante espontánea y optogenetically arrastrado theta. A continuación el correspondiente ritmo LFP hippocampal espontánea (izquierda) y theta (derecha) ocluido. (D) fase de descarga preferido de interneuronas de la rápido-leña no fue diferente durante la espontánea (en negro) y optogenetically arrastrado (en azul, n = 28 neuronas) theta (p = 0,97). Medio auto-correlogram se muestra a la izquierda. Células de (E) promedio auto-correlogram Str. oriens. (F) fase de descarga preferido de interneuronas oriens de Str. no fue diferente durante el espontáneo (negro) y optogenetically arrastrado (azul, n = 10 neuronas) theta (p = 0,56). Histogramas de descarga recomendado: fases aparecen en la derecha. Las tasas de disparo promedio (G) no fueron afectadas por el arrastre de la theta en las células piramidales (p = 0.98), interneuronas de la rápido-leña (p = 0.96) o interneuronas oriens de Str. (p = 0,85). Esta figura ha sido modificada de ref. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: combinación de hippocampal de la theta arrastre y optogenetic inhibición de la hippocampal subcortical de salida a través del LS. (A) eNpHR3.0 (halorodopsina) fue expresado en las células piramidales hipocampales (esquema superior). Expresión acertada de la construcción fue confirmada por fluorescencia brillante en Somas en el hipocampo (imágenes superiores) y los axones en el LS (imágenes inferiores). Fibras ópticas se implantaron bilateralmente sobre el LS (esquema inferior). Barras de escala: 500 μm (imágenes de la izquierda), 50 μm (imágenes a la derecha). Theta Hippocampal (B) es arrastrado con éxito durante la inhibición del hipocampo al camino de LS. Aquí se muestran densidades espectrales de potencia para el estímulo de luz azul 9 Hz durante la inhibición de la salida. (C) inhibición de la vía principal salida subcortical hipocampal evita efectos de arrastre de hippocampal de la theta en velocidad. Aquí se muestra es disminución de la variabilidad de la velocidad sobre el arrastre de optogenetic (blanco de la barra con bordes azules), con ausencia en la inhibición simultánea del hipocampo al camino de LS (barra amarilla con bordes azules). Velocidad inicial promedio respectivo aparece en la izquierda. Esta figura ha sido modificada de ref. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí presentamos una metodología ampliamente accesible para arrastrar y provocar oscilaciones de la theta del hipocampo en el comportamiento animal. Este enfoque puede ser útil para estudios de funciones de ritmo theta en procesamiento de la información y el comportamiento. Aspectos críticos de este método incluyen: (1) elección de la opsina y el señalamiento de ChR2 en axones de MS de las células en el hipocampo, características ópticas y eléctricas (2) robustas de asambleas de matriz implantado hilos de fibra óptica para asegurar la continua estimulación y LFP grabación en comportarse ratones, (3) aplicación de una cantidad óptima de luz en las frecuencias theta, (4) cuantificación de post hoc de la fidelidad de arrastre y (5) control de artefactos optoelectrical.

La principal salvedad del primer punto es una inyección de virus seguro ahorrar el plexo venoso situado medialmente. Ejecución quirúrgica subóptima de este paso puede disminuir la tasa de éxito de las inyecciones y potencialmente retrasar la adquisición de los resultados. Cinética de una opsina se debe considerar, ChR2 (tiempo de activación: 2 ms, tiempo de inactivación: 9 ms65). El segundo punto exige control de la fidelidad de la transmisión de la luz y la impedancia de los electrodos antes de la implantación de la grabación y generalmente de fabricación oportuna de implantes adicionales.

La tercera consideración es optogenetics manipulaciones de circuito a gran escala con el objetivo común e implica fuentes de luz e interconexiones ópticas, que entregan a través de una energía ligera de fibra de 100 μm en el cerebro de 5 a 15 mW. Por cada ratón y antes de cada grabación, una grabación de prueba puede realizarse para establecer la salida de luz a la intensidad óptima para el experimento. La salida de luz debe ser lo suficientemente alta como para activar un número suficiente de proyecciones para permitir el arrastre confiable de las oscilaciones theta, pero no demasiado alto, y para prevenir respuestas evocados térmicamente y daño tisular.

El cuarto aspecto mira la sincronización de pulsos ligeros y los datos de la LFP, logrados con la máxima precisión mediante el muestreo de ambos tipos de datos mediante el mismo Conversor AD. Fecha y hora sincronizado es particularmente necesario para otras aplicaciones potenciales con el objetivo de los estudios de descarga neuronal y LFP. Eficacia de arrastre puede variar entre y dentro de épocas de estimulación; Esto probablemente ocurre debido a interferencia de rhythmicity de estimulación optogenetic con señales conducidas intrínseco o sensoriales, debido a múltiples generadores de ritmo theta16,66,67, 68. cuantificación de la fidelidad instantánea de este dinámico optogenetic manipulación69 por lo tanto es de gran ayuda para la inferencia causal, es decir, para revelar la relación entre una magnitud de efecto (p. ej. , cambio en el comportamiento) y la eficacia momentánea del control optogenetic de aspectos seleccionados de la sincronización. Lo importante, los múltiples parámetros de oscilación pueden estar influenciados por el estímulo de la optogenetic, por ejemplo, media de arrastre no sólo bloqueo de frecuencia sino también una más regular amplitud de las oscilaciones theta11.

En quinto lugar, la estimulación optogenetic se asocia a menudo optoelectrical artefactos, evocados en electrodos de metal por el efecto fotoelectroquímicas. Su grado depende del material de electrodo, proximidad de la punta del electrodo a la fibra óptica y luz. En los experimentos descritos aquí, optoelectrical artefactos pueden evitarse aumentando la distancia entre la fibra y el electrodo de la grabación, cerrar posición de que no es esencial para el control de oscilación de theta. Artefactos de optoelectrical Mostrar la forma constante en el tiempo y entre los canales y, por lo tanto, durante la clasificación del punto típicamente se agrupan en un grupo distinto y no se superponen con las neuronas registradas70. Al mismo tiempo, una pequeña fracción de los potenciales de acción, formas de onda de que son alterados por los artefactos, no se agrupan por algoritmos de clasificación con otros picos disparados por una neurona. Perfiles laminares de LFP obtienen mediante distintas configuraciones de electrodo, incluyendo arreglos de discos de alambre (figura 2B) y sondas de silicona lineal, permiten una clara diferenciación de artefactos y ciertos patrones LFP, basados en la constante fase de la primera y desplazamientos de fase laminar fisiológica de este último. Grabaciones de la línea de base antes de la estimulación permiten la exploración de funciones theta características como perfiles de fase laminar típica.

Optogenetic control de las oscilaciones theta conduce a arrastre de theta en todas las capas de la capa CA1 hipocampal y hasta arrastre contralateral. Esto debería tenerse en cuenta si un experimento tiene como objetivo una estimulación local (si los efectos de una estimulación de una subregión confinada o una subpoblación se dirige a estudiar). Por otro lado, la estimulación espacial limitada de hippocampal proyecciones de células PV MS+ presentadas aquí permite una manipulación menos determinista de las oscilaciones theta, es decir, arrastre, que hace la estimulación somática optogenetic de Células MS PV+ aplicadas recientemente en ratones anestesiados71. La estimulación somática esta última consistentemente resultados en frecuencias de oscilación del hipocampo hasta 40 Hz y representa el caso de una estimulación rítmica altamente confiable. Por el contrario, la estimulación axonal presentada aquí es efectiva preferencial en la banda theta de frecuencia (figura 3) y por lo tanto es más similar al arrastre, posiblemente a través de la Kuramoto transición72, es decir, trabajar en frecuencias cerca de los presentes en las oscilaciones de estimulación inicio espontáneo de la theta.

Mientras que la preparación de optogenetic se describe aquí permite manipular funciones de oscilación de theta, somática optogenetic inhibición de neuronas inhibitorias de MS se han aplicado para la inhibición eficaz de las oscilaciones theta durante sueño del REM73. Integración de las dos técnicas con optogenetic actuadores para el control de la oposición de la excitabilidad neuronal (por ejemplo, 12) potencialmente puede permitir el control bidireccional del ritmo theta en el mismo animal para estudios posteriores de causal conexiones entre las oscilaciones de la red y diversos aspectos del comportamiento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Maria Gorbati experto ayuda con análisis de datos y Jennifer Kupferman para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; NeuroCure EXC 257, TK y AP; Programa prioritario 1665, 1799/1-1(2), programa de Heisenberg, 1799/2-1, AP), la Fundación israelo-alemana para la investigación científica y desarrollo (GIF; I-1326-421.13/2015, TK) y el programa de ciencia de frontera humana (HFSP; RGY0076/2012, TK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PV-Cre mice The Jackson Laboratory B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotaxis David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA Model 963 Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument
Drill bits, 0.8 mm Bijoutil, Allschwil, Switzerland 49080HM
0.01-1 ml syringe Braun, Melsungen, Germany 9161406V
Sterican cannulas Braun 26 G, 0.45x25 mm BL/LB
Fine and sharp scissors Fine Science Tools Inc., Vancouver, Canada 14060-09
Forceps Fine Science Tools Inc. 11210-10 Dumont AA - Epoxy Coated Forceps
Blunt stainless steel scissors Fine Science Tools Inc. 14018-14
Soldering station Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany WSD 81
Erythromycin Rotexmedica GmbH, Trittau, Germany PZN: 10823932 1g Powder for Solution for Infusion
Name Company Catalog Number Comments
Optogenetics
Hamilton pump PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA model 703008 PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism
Hamilton 5 µL Syringe, 26 gauge PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Hamilton 5 µL Plunger PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Tubing Fisher Scientific, Pittsburgh, USA PE 20 Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043")
Sterican cannulas Braun, Melsungen, Germany 27 G, 25x0.40 mm, blunt
Precision drill/grinder Proxxon, Wecker, Luxemburg fbs 240/e
Cutting disks Proxxon NO 28812
Cre dependent channelrhodopsin Penn Vector Core, Philadelphia, PA, USA AV-1-18917P Contruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42x1013 vg/ml
Cam kinase dependent halorhodopsin Penn Vector Core AV-1-26971P Construct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml
Multimode optic fiber ThorLabs, Dachau, Germany FG105LCA 0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 - 2400 nm
Ceramic stick ferrule Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA CFLC126 Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um
Polishing paper Thorlabs LF3D 6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet
Power meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD
Multimode fiber optic coupler Thorlabs FCMM50-50A-FC 1x2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC
Fiberoptic patch cord Thorlabs FG105LCA CUSTOM-MUC custom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule
Sleeve Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA ADAL1 Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules
473 nm DPSS laser Laserglow Technologies, Toronto, ON, Canada R471005FX LRS-0473 Series
593 nm DPSS laser Laserglow Technologies R591005FX LRS-0594 Series
MC_Stimulus II Multichannel Systems, Reutlingen, Germany STG 4004
Impedance conditioning module Neural microTargeting worldwide, Bowdoin, USA ICM
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology
Tungsten wires California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USA CFW0010954 40 µm, 99.95%
Capillary tubing Optronics 1068150020 ID: 100.4 µm
Omnetics nanoconnector Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, USA A79038-001
Screws Bilaney, Düsseldorf, Germany 00-96x1/16 stainless-steel
Silicone probe NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USA B32
Headstage Neuralynx, Bozeman, Montana USA HS-8 miniature headstage unity gain preamplifiers
Silver conductive paint Conrad electronics, Germany 530042
Liquid flux Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Germany Lötöl ST DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)
LED Neuralynx HS-LED-Red-omni-10V
Name Company Catalog Number Comments
Software
MATLAB Mathworks, Natick, MA, USA
MC_Stimulus software Multichannel, Systems
Neurophysiological Data Manager NDManager, http://neurosuite.sourceforge.net
Klusters http://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006
Software of the recording system Neuralynx Cheetah https://neuralynx.com/software/cheetah
Multi-channel data analysis software Cambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GB Spike2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salinas, E., Sejnowski, T. J. Correlated neuronal activity and the flow of neural information. Nat Rev Neurosci. 2 (8), 539-550 (2001).
  2. Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
  3. Cannon, J., et al. Neurosystems: brain rhythms and cognitive processing. Eur J Neurosci. 39 (5), 705-719 (2014).
  4. Fries, P. Neuronal gamma-band synchronization as a fundamental process in cortical computation. Annu Rev Neurosci. 32, 209-224 (2009).
  5. Cardin, J. A., et al. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459 (7247), 663-667 (2009).
  6. Colgin, L. L., et al. Frequency of gamma oscillations routes flow of information in the hippocampus. Nature. 462 (7271), 353-357 (2009).
  7. Csicsvari, J., Jamieson, B., Wise, K. D., Buzsaki, G. Mechanisms of gamma oscillations in the hippocampus of the behaving rat. Neuron. 37 (2), 311-322 (2003).
  8. Gray, C. M., Singer, W. Stimulus-specific neuronal oscillations in orientation columns of cat visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (5), 1698-1702 (1989).
  9. Lisman, J. E., Jensen, O. The theta-gamma neural code. Neuron. 77 (6), 1002-1016 (2013).
  10. Sirota, A., et al. Entrainment of neocortical neurons and gamma oscillations by the hippocampal theta rhythm. Neuron. 60 (4), 683-697 (2008).
  11. Bender, F., et al. Theta oscillations regulate the speed of locomotion via a hippocampus to lateral septum pathway. Nat Commun. 6, 8521 (2015).
  12. Carus-Cadavieco, M., et al. Gamma oscillations organize top-down signalling to hypothalamus and enable food seeking. Nature. 542 (7640), 232-236 (2017).
  13. Bragin, A., Engel, J., Wilson, C. L., Fried, I., Buzsaki, G. High-frequency oscillations in human brain. Hippocampus. 9 (2), 137-142 (1999).
  14. Wang, J., et al. High-frequency oscillations in Parkinson's disease: spatial distribution and clinical relevance. Mov Disord. 29 (10), 1265-1272 (2014).
  15. Hammond, C., Bergman, H., Brown, P. Pathological synchronization in Parkinson's disease: networks, models and treatments. Trends Neurosci. 30 (7), 357-364 (2007).
  16. Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron. 33 (3), 325-340 (2002).
  17. Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
  18. Buhl, E. H., et al. Physiological properties of anatomically identified axo-axonic cells in the rat hippocampus. J Neurophysiol. 71 (4), 1289-1307 (1994).
  19. Wulff, P., et al. Hippocampal theta rhythm and its coupling with gamma oscillations require fast inhibition onto parvalbumin-positive interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3561-3566 (2009).
  20. Korotkova, T., Fuchs, E. C., Ponomarenko, A., von Engelhardt, J., Monyer, H. NMDA receptor ablation on parvalbumin-positive interneurons impairs hippocampal synchrony, spatial representations, and working memory. Neuron. 68 (3), 557-569 (2010).
  21. Buhl, D. L., Harris, K. D., Hormuzdi, S. G., Monyer, H., Buzsaki, G. Selective impairment of hippocampal gamma oscillations in connexin-36 knock-out mouse in vivo. J Neurosci. 23 (3), 1013-1018 (2003).
  22. Racz, A., Ponomarenko, A. A., Fuchs, E. C., Monyer, H. Augmented hippocampal ripple oscillations in mice with reduced fast excitation onto parvalbumin-positive cells. J Neurosci. 29 (8), 2563-2568 (2009).
  23. Contreras, D., Steriade, M. Cellular basis of EEG slow rhythms: a study of dynamic corticothalamic relationships. J Neurosci. 15 (1 Pt 2), 604-622 (1995).
  24. Herrera, C. G., et al. Hypothalamic feedforward inhibition of thalamocortical network controls arousal and consciousness. Nat Neurosci. 19 (2), 290-298 (2016).
  25. Freund, T. F., Antal, M. GABA-containing neurons in the septum control inhibitory interneurons in the hippocampus. Nature. 336 (6195), 170-173 (1988).
  26. Unal, G., Joshi, A., Viney, T. J., Kis, V., Somogyi, P. Synaptic Targets of Medial Septal Projections in the Hippocampus and Extrahippocampal Cortices of the Mouse. J Neurosci. 35 (48), 15812-15826 (2015).
  27. Hangya, B., Borhegyi, Z., Szilagyi, N., Freund, T. F., Varga, V. GABAergic neurons of the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci. 29 (25), 8094-8102 (2009).
  28. Bartho, P., et al. Ongoing network state controls the length of sleep spindles via inhibitory activity. Neuron. 82 (6), 1367-1379 (2014).
  29. Giocomo, L. M., et al. Grid cells use HCN1 channels for spatial scaling. Cell. 147 (5), 1159-1170 (2011).
  30. Stark, E., et al. Inhibition-induced theta resonance in cortical circuits. Neuron. 80 (5), 1263-1276 (2013).
  31. Crandall, S. R., Cruikshank, S. J., Connors, B. W. A corticothalamic switch: controlling the thalamus with dynamic synapses. Neuron. 86 (3), 768-782 (2015).
  32. Steriade, M., McCormick, D. A., Sejnowski, T. J. Thalamocortical oscillations in the sleeping and aroused brain. Science. 262 (5134), 679-685 (1993).
  33. Joshi, A., Salib, M., Viney, T. J., Dupret, D., Somogyi, P. Behavior-Dependent Activity and Synaptic Organization of Septo-hippocampal GABAergic Neurons Selectively Targeting the Hippocampal CA3 Area. Neuron. , (2017).
  34. Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. J Neurosci. 34 (34), 11385-11398 (2014).
  35. Craig, M. T., McBain, C. J. Fast gamma oscillations are generated intrinsically in CA1 without the involvement of fast-spiking basket cells. J Neurosci. 35 (8), 3616-3624 (2015).
  36. Pastoll, H., Solanka, L., van Rossum, M. C., Nolan, M. F. Feedback inhibition enables theta-nested gamma oscillations and grid firing fields. Neuron. 77 (1), 141-154 (2013).
  37. Akam, T., Oren, I., Mantoan, L., Ferenczi, E., Kullmann, D. M. Oscillatory dynamics in the hippocampus support dentate gyrus-CA3 coupling. Nat Neurosci. 15 (5), 763-768 (2012).
  38. Mattis, J., et al. Frequency-dependent, cell type-divergent signaling in the hippocamposeptal projection. J Neurosci. 34 (35), 11769-11780 (2014).
  39. Vandecasteele, M., et al. Optogenetic activation of septal cholinergic neurons suppresses sharp wave ripples and enhances theta oscillations in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13535-13540 (2014).
  40. Stark, E., et al. Pyramidal cell-interneuron interactions underlie hippocampal ripple oscillations. Neuron. 83 (2), 467-480 (2014).
  41. Blumberg, B. J., et al. Efficacy of nonselective optogenetic control of the medial septum over hippocampal oscillations: the influence of speed and implications for cognitive enhancement. Physiol Rep. 4 (23), (2016).
  42. Courtin, J., et al. Prefrontal parvalbumin interneurons shape neuronal activity to drive fear expression. Nature. 505 (7481), 92-96 (2014).
  43. Nagode, D. A., Tang, A. H., Yang, K., Alger, B. E. Optogenetic identification of an intrinsic cholinergically driven inhibitory oscillator sensitive to cannabinoids and opioids in hippocampal CA1. J Physiol. 592 (1), 103-123 (2014).
  44. Bitzenhofer, S. H., et al. Layer-specific optogenetic activation of pyramidal neurons causes beta-gamma entrainment of neonatal networks. Nat Commun. 8, 14563 (2017).
  45. Kondabolu, K., et al. Striatal cholinergic interneurons generate beta and gamma oscillations in the corticostriatal circuit and produce motor deficits. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), E3159-E3168 (2016).
  46. Sohal, V. S., Zhang, F., Yizhar, O., Deisseroth, K. Parvalbumin neurons and gamma rhythms enhance cortical circuit performance. Nature. 459 (7247), 698-702 (2009).
  47. Pina-Crespo, J. C., et al. High-frequency hippocampal oscillations activated by optogenetic stimulation of transplanted human ESC-derived neurons. J Neurosci. 32 (45), 15837-15842 (2012).
  48. Iaccarino, H. F., et al. Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia. Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).
  49. Kim, H., Ahrlund-Richter, S., Wang, X., Deisseroth, K., Carlen, M. Prefrontal Parvalbumin Neurons in Control of Attention. Cell. 164 (1-2), 208-218 (2016).
  50. Lu, Y., et al. Optogenetically induced spatiotemporal gamma oscillations and neuronal spiking activity in primate motor cortex. J Neurophysiol. 113 (10), 3574-3587 (2015).
  51. Kim, T., et al. Cortically projecting basal forebrain parvalbumin neurons regulate cortical gamma band oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3535-3540 (2015).
  52. Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. Gamma-range synchronization of fast-spiking interneurons can enhance detection of tactile stimuli. Nat Neurosci. 17 (10), 1371-1379 (2014).
  53. Gan, J., Weng, S. M., Pernia-Andrade, A. J., Csicsvari, J., Jonas, P. Phase-Locked Inhibition, but Not Excitation, Underlies Hippocampal Ripple Oscillations in Awake Mice In. Neuron. 93 (2), 308-314 (2017).
  54. van de Ven, G. M., Trouche, S., McNamara, C. G., Allen, K., Dupret, D. Hippocampal Offline Reactivation Consolidates Recently Formed Cell Assembly Patterns during Sharp Wave-Ripples. Neuron. 92 (5), 968-974 (2016).
  55. Kim, A., et al. Optogenetically induced sleep spindle rhythms alter sleep architectures in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20673-20678 (2012).
  56. Latchoumane, C. V., Ngo, H. V., Born, J., Shin, H. S. Thalamic Spindles Promote Memory Formation during Sleep through Triple Phase-Locking of Cortical, Thalamic, and Hippocampal Rhythms. Neuron. 95 (2), 424-435 (2017).
  57. Robinson, J., et al. Optogenetic Activation of Septal Glutamatergic Neurons Drive Hippocampal Theta Rhythms. J Neurosci. 36 (10), 3016-3023 (2016).
  58. Fuhrmann, F., et al. Locomotion, Theta Oscillations, and the Speed-Correlated Firing of Hippocampal Neurons Are Controlled by a Medial Septal Glutamatergic Circuit. Neuron. 86 (5), 1253-1264 (2015).
  59. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159 (2005).
  60. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
  61. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  62. Buzsaki, G., et al. Multisite recording of brain field potentials and unit activity in freely moving rats. J Neurosci Methods. 28 (3), 209-217 (1989).
  63. Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
  64. Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
  65. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  66. Korotkova, T., et al. Reconciling the different faces of hippocampal theta: The role of theta oscillations in cognitive, emotional and innate behaviors. Neurosci Biobehav Rev. , (2017).
  67. Vertes, R. P., Hoover, W. B., Viana Di Prisco, G. Theta rhythm of the hippocampus: subcortical control and functional significance. Behav Cogn Neurosci Rev. 3 (3), 173-200 (2004).
  68. Hasselmo, M. E., Hay, J., Ilyn, M., Gorchetchnikov, A. Neuromodulation, theta rhythm and rat spatial navigation. Neural Netw. 15 (4-6), 689-707 (2002).
  69. Witt, A., et al. Controlling the oscillation phase through precisely timed closed-loop optogenetic stimulation: a computational study. Front Neural Circuits. 7, 49 (2013).
  70. Korotkova, T., Ponomarenko, A. In Vivo Neuropharmacology and Neurophysiology. , Springer Science. Series Neuromethods (2017).
  71. Dannenberg, H., et al. Synergy of direct and indirect cholinergic septo-hippocampal pathways coordinates firing in hippocampal networks. J Neurosci. 35 (22), 8394-8410 (2015).
  72. Pikovsky, A., Rosenblum, M., Kurths, J. Synchronization: A universal concept in nonlinear sciences. 70, American Journal of Physics. (2002).
  73. Boyce, R., Glasgow, S. D., Williams, S., Adamantidis, A. Causal evidence for the role of REM sleep theta rhythm in contextual memory consolidation. Science. 352 (6287), 812-816 (2016).

Tags

Neurociencia número 136 Optogenetics grabaciones electrofisiológicas en vivo comportamiento theta oscilación hipocampo las células piramidales interneuronas tabique locomoción farmacogenética
Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bender, F., Korotkova, T.,… More

Bender, F., Korotkova, T., Ponomarenko, A. Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice. J. Vis. Exp. (136), e57349, doi:10.3791/57349 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter