Summary
動作マウスにおける海馬シータ振動 (5-10 Hz) の選択を操作する光遺伝学、電気生理学的記録の使用について述べる。リズムの同調性は、ローカル フィールド ポテンシャルを使用して監視されます。光と薬理遺伝学的抑制の組み合わせは、海馬同期の遠心性の読み出しをアドレスします。
Abstract
ニューラル ネットワークの動作する振動の関係や脳領域間の神経放電の組織に関する広範なデータを求める脳リズムを選択的に操作するための新しいツール。ここで特定の投影光遺伝学を組み合わせて動作マウスにおける海馬シータ振動 (5-10 Hz) の忠実度の高いコントロールの細胞電気生理学のアプローチについて述べる。重要な海馬シータ振動の生成に関与する内側中隔細胞の gaba 作動性の人口にターゲット チャネルロドプシン 2 (ChR2) により光同調の特異性を実現し、ローカル同期活性化海馬の抑制性中隔求心性神経のサブセット。ラミナ CA1 野のや神経細胞の放電の間でローカル フィールド ポテンシャル (LFP) の同時観測による光遺伝学的リズム制御の有効性が検証されます。この容易に実装可能な製剤を用いた各種光刺激プロトコル シータの誘導とその頻度と規則性の操作の有効性を示す.最後に、投影法固有の抑制と θ リズム制御の組み合わせは遠心性の地域によって海馬の同期の特定の面の読み出しをアドレスします。
Introduction
哺乳類の神経細胞の活動は、内および脳領域1,2,3,4間の情報伝達を支援するネットワークの振動によって調整されます。脳のリズムには、非常に遅い (< 0.8 Hz) 超高速 (> 200 Hz) 周波数まで至る振動が含まれます。証拠の大きいボディは、認知5,6,7,8,9,10 を含む多様な脳機能でネットワーク振動の関与をサポートしています、パーキンソン病やてんかんの13,14,15などの神経疾患と同様に、生得的な行動11,12 。同期の生理学的にもっともらしいモデルの開発と動作の因果関係を確立するため、ネットワークの振動の実験的操作メソッドが選択的な一時的は欠かせないため。
ネットワーク同期は多様な生物学的基質とイオン チャネルの分子の id、その動力学から興奮性とネットワーク接続性の神経に至るまでのプロセスを介する。発電機16が明らかにされている多くの脳のリズムが (例えば周波数、振幅) の異なる面が多いリズムの生物学的デザインは、明確な細胞のタイプとネットワークのダイナミクスによってもたらされます。例えば、主細胞の突起をターゲットと抑制性介在ニューロンは、周波数帯、脳領域17,18, シータ19、20、ガンマ20を含む最も重要な選手をします。,21日とリップル (140-200 Hz)22振動。ターンでは、離れた場所の細胞の位相同期は、堅牢なフィード フォワード信号錐体細胞の介在神経の発火をリセットによって保証されます。振動、同期ニューロン集団のサイズの重要なパラメーター測定 LFP 振動の振幅は密接な関係し、少なくとも高速振動2介在ニューロンに興奮性ドライブに依存します。対照的に、シータ、デルタなどの遅い振動は皮質視床23,24と海馬-内側中隔予測25,によって形成される長距離のリエントラント ループによって生成される26,27、それぞれ。このような回路の振動が信号伝搬遅延、興奮性の応答と周波数嗜好参加細胞28,29,30,の相互作用によってもたらされる31,32gaba 作動性パルブアルブミン (太陽光発電) から抑制性の投射-海馬25,33、海馬傍地域内嗅皮質26で介在する内側中隔 (MS) の細胞が陽性。内側側頭葉シータ振動の生成に不可欠。したがって、光遺伝学を用いたリアルタイム高精度ネットワーク振動・同期の神経の生理学的メカニズムを操作できます。
34,35,36,37,38 培養海馬と大脳皮質の振動やの研究のセル型固有の光遺伝学的操作を適用されています。生体内で30,39,40,41,42,43,44,45, 機能を含むガンマ5,12,36,46,47,48,49,50,の調査51,52とリップル振動40,53,54と睡眠のスピンドル、55,56。最近 PV Cre マウスの MS、海馬 θ リズムの生成のための重要な地域で Cre 依存 ChR2 ウイルスを表明しました。この準備を使用して、海馬シータ振動 (周波数と時間的安定性) の特徴は、海馬11MS の抑制性投射の光刺激によって制御されました。さらに、海馬海馬の抑制性投射のシータ振動への光刺激は目がさめている不動の中にシータを誘発しました。生じる気流 LFP および神経細胞の活動レベルでマウスで自発的なシータの θ リズムの表示プロパティです。
このプロトコルの主な機能: 海馬興奮性; 非特異的効果を回避しながら自発的なシータの重要な生理学的である抑制性経路の (1) の利用(2) 軸索、すなわち、非海馬 MS efferents; の直接影響を最小限に抑えるために特定の投影刺激(海馬海馬 θ リズムのダイナミクスとシータ振動の二国間の引き込みと直接干渉を最小限を確保 3) ローカルの θ リズム光刺激(4) パラメトリックな制御のシータ振動頻度および規則性;同調忠実高時間分解能 (5) 数量 LFP を使用して動物の行動に因果関係の定量的分析を有効にします。以来、この準備は、シータ世代25,30の脱抑制が海馬海馬のよく知られている役割を本質的に大文字、それはシータ振動動作マウスのいくつかのパラメーターのロバスト制御をできます。他より少ない調査経路および海馬海馬の細胞の種類はどこにいた研究操作38,39,47,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58は θ リズムの機構をさらに明らかにします。
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Protocol
太陽光発電 Cre ノックアウトの雄マウス5910-25 週齢が使用されました。マウスが動物施設における標準的な条件の下で収容され、12 時間の明暗サイクルし続けました。すべてのプロシージャは国内および国際的ガイドラインに従って行われ、地元の保健当局 (Landesamt für Natur、環 und Verbraucherschutz、ノルトライン ・ ヴェストファーレン州) によって承認されました。
1. ウイルス注入
- 全体の手順中に60生物学的安全性ガイドラインに従ってください。白衣、マスク、ヘアネット、手袋の 2 つのペアを着用します。
- 滅菌メスやハサミでチューブを約 1 m の長さにカット、ポンプ、シリンジ ホルダー ・ ブロックに挿入して、それを修正します。
- 注射器を使用して完全にシリコン オイル チューブを入力します。
- チューブに空気の泡が表示されるかどうかを確認します。空気の泡が認められた場合、再度オイル チューブを補充します。
- プッシャー ブロックにプランジャーを修正します。
- プランジャーの先端が管に触れるまでゆっくりシリンジ ホルダー ・ ブロックに向かってプッシャーを進めます。
- プランジャーの先端をチューブに挿入し、自動的にシリンジ ホルダー ・ ブロックに到達するまで、コマンド ウィンドウと低注入率 (例えば、500 nL/min) で「インフューズ」を選択して遅い速度でプッシャー ブロック前方を移動します。
- 注射針 (34 G) を準備します。
- 精密ドリル/グラインダー切削ディスクに接続されているを使用して明確に針ハブを取り外します。必要な場合は、新鮮なカット面から金属の残基を削除する針を使用します。
- 針をキャピラリー チューブ (3-4 cm) をスレッドします。
- 瞬間接着剤を管に針を接着します。
- 注射針を, マイクロシリンジ ポンプに接続する管の端に接続します。
- 脳定位固定装置のホルダーに針を取り付けます。
- 針の上の透明なチューブで空気の泡が表示されるまで、空気を撤回します。
- 酸素の 1.5-3% イソフルランとマウスを麻酔します。約 2-3 分待ってし、マウスはつま先ピンチへの応答を評価することによって麻酔完全にことを確認します。手術中動物の呼吸を監視し、必要に応じてイソフルラン麻酔濃度を調整します。
- 非外傷性耳ホルダーを用いた定位脳手術フレームにマウスを配置します。
- 脂質ゲルとマウスの目を保護します。
- 0.01-1 を使用して頭の皮膚掻き未満 0.1 mL リドカインを注入 mL 注射器と 26 G 注入カニューレです。
- 剃るし、エタノールを使用してマウスの頭を消毒します。その後、手術部位の消毒にエタノールで 3 回 2% クロルヘキシジンを交互に。
- 目のレベルに耳の後ろの間を行く前とラムダが表示されます罰金と鋭いはさみを使用して正中切開を実行します。
- 注射器を使用して塩化ナトリウムの約 50 μ L を適用することによって頭蓋骨をきれいにし乾燥紙ティッシュと空気のパフ。
- 前とラムダの背腹と同じレベルになるよう鼻クランプの背腹レベルを調整することによってマウスの頭の位置 (± 0.3 mm)。
- MS (AP 0.98 と L 前参考 0.5 mm) の上の穴をドリルします。
- この時点で、約 5 分間室温 (RT) のウイルス ( AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40の少なくとも 2 μ L が含まれてする必要があります) の因数を解凍します。
- 1 分間常温約 4,000 x g で因数を遠心します。
- パラフィルム; の部分にウイルスの 2 μ L をピペットします。以前保護側を使用します。
- 液体の注入針の先端を沈めるし、約 500 nL/min 液体のレベルを観察しながら慎重に撤回します。空気の吸引を防ぐため、ウイルスは完全取られる前に撤退を停止します。溶液粘度; に従って撤退率を調整します。速い速度は、粘度が高いとウイルスの回収を促進できます。
- 紙ティッシュで針をクリーンアップします。
- ウイルスがチューブ内にウイルスと油は気泡で区切られますことを確認します。ウイルスは正常に注入中に注入されるかどうかを制御するために管のウイルスのレベルをマークします。
- 直上の上針を置き、ゆっくりと最初の注入ポイント (AP 0.98、L、0.5 V-5.2、5.5 ° 水平) で脳に挿入します。
- 450 を注入 100 150 nL/分 10 分待つの割合でウイルスの nL は慎重に 0.1 mm を針の移動し、別の 5 分を待ちます。
- 第 2 注入ポイント (AP 0.98、L、0.5 V-4.6) に針を移動して別の 450 を注入 100 150 nL/min の nL。
- 針を削除する前に別の 5 分針を 0.1 mm. 待機を移動する前に 10 分間待ちます。
- スクエア ノットを使用してシルク黒編み縫合糸で切開部を縫合します。回復をスピードアップする赤いランプと、動物を温めます。抗生物質 (0.3 mL Erycinum (滅菌食塩で 1:4)) やカルプロフェン i. p. 手術後毎日 2 〜 3 日を管理します。
- 上記のウイルスのレベルを示したマーク チューブをカットします。さらに注射用チューブを使用できます。各注入の前に新鮮な注射針を準備します。
注: この手術は、約 1 〜 1.5 時間かかります。動物は、手術後 5 分以内通常目覚めます。最低限を待って十分な軸索式の 6 週間の時間が発現ウイルス注入後約 6 ヶ月を減少し始めると定位した絵を実行する前に 5 ヶ月より長くないです。
2. 光ファイバー (図 1 a) の準備
- マルチモード光ファイバー (105 μ m コア、0.22 NA 石英コアとクラッド ガラス) を使用します。繊維が繊維のスプールにまだ接続されているマイクロのストリッパーを使用して光ファイバーのコアの 125 μ m クラッドを除去します。
- 繊維をダイヤモンド ナイフを使用して約 2-3 cm の長さにカットします。
- セラミック棒フェルールに光ファイバーを挿入 (ID: 126 μ m)。約 0.5-1 mm 光ファイバーのフェルールの凸側から突出する必要があります。
- 針を使用して、フェルールの側面にフェルールの両端にエポキシ接着剤を一滴を適用します。また、スーパー接着剤を使用します。
- 少なくとも 30 分乾燥して接着剤を許可します。
- フェルールの砥粒研磨フィルム (3 μ m グリッツ) 繊維の凸側を磨きます。
- 光パワーメータを使用して光の伝達の正確さをテストします。
- 電力計に使用されているレーザーと同じ波長の波長を設定します。
- センサーの中心を向き先端とパッチ コードを配置します。レーザーの電源、電源メーターから光出力を読み取る。値を記録します。
- 交尾スリーブを介してパッチ ケーブルに光ファイバーを接続し、センサーの中央に直面して繊維の先端でそれを配置します。レーザーの電源、電源メーターから光出力を読み取る。値を記録します。
- 伝送速度を計算する: 最初の値が 2 番目の値を分割します。伝送速度が 0.5 以下の場合ファイバーを捨てて、それ以外の場合、注入用します。
- 移植前に各ファイバーの伝送速度をテストします。
- 光ファイバーの伝送速度にレーザーの光出力を調整後の実験のため: 5 15 5 15 mW の光ファイバー先端から最終的な光出力を達成するために透過率で割った値にパッチコード先端から光出力を設定します。
注: はまた光ファイバーの準備のための参考文献61を参照してください。
3. タングステン ワイヤの準備配列 LFP の録音 (図 1 b)
- (例 6) のいくつかを接着テープの粘着面に平行に 100 μ m シリカ チューブ ガイド。約 4 〜 6 mm、1 本のワイヤー配列アセンブリの 1 つの作品をカットします。
- 鉗子を使用してガイド チューブを介してホルムバール被覆 45 μ m タングステン線を通します。
- ストリップ 6 エナメル絶縁高級銅ボンディング ワイヤ (約 5 mm 長い) とアース (約 2-3 cm 長い) 両端絶縁体を削り取るにメスを使用しています。Nanoconnector ピンを半田付けします。
- 各ボンディング ワイヤをそれぞれ銀導電性塗料の一滴を使用して 1 つのタングステン線に接続します。少なくとも 30 分乾燥させます。
- セメント線をカバーするための最小量を適用します。脳組織や、nanoconnector の上部に挿入されるタングステン ワイヤのセメントは適用されません。せ、少なくとも 30 分間乾燥セメント。
- 信頼性の高い注入線下以上どこ θ 振幅が小さすぎるの推定属地層三角骨に隣接する腹側のゾーンを有効にする鈍のステンレス製はさみを使用してタングステン ワイヤの角カット (5-20 °) を実行、同調忠実に再現。
- 絶縁体を削り取るにメスを使用して、アース線の先端 (約 2 mm) を deinsulate します。フラックス、presolder とそれを扱います。
- 潜在的なチェック間クロストーク電極デジタル デジタルマルチメータです。これを行うには、コネクタのピンを抵抗測定モードに設定する必要があります、マルチメータに接続します。チャネルのペアの組み合わせをチェックします。5 MΩ 以下マルチメータの読みは重要なクロストークを示します。
- 生理食塩水は、インピー ダンス計を使用して各ワイヤ電極のインピー ダンスを確認します。典型的なインピー ダンス値のとおり 100 kΩ です。
- 注入を容易にするには、光ファイバーの先端は、最短の線のレベル、光ファイバー先端に近接がタングステン ワイヤを触れていない細線アレイを 1 つの光ファイバーを接着します。繊維の角度を注入中に組織の損傷を防ぐために可能な限り小さくしてください。
注: は文献62タングステン細線アレイの作製も参照してください。
4. 定位同腹
- 1.6 1.13 の手順で説明するように、準備を実行します。
- 頭蓋骨の上から結合組織を削除し、記録中に筋の成果物を防ぐために約 2 mm、徹底的に首の筋肉を押し下げます。
- 綿の先端アプリケータと生理食塩水を使用して頭蓋骨をきれいにし、地面およびインプラント (図 1) の安定化用骨ステンレス鋼ねじ (00-96 × 1/16) を配置する (前に 2) と小脳、直径 0.8 mm 以上 2 4 穴をドリルします。小脳の上に 1 つ銅配線 (約 2-3 cm 長さ) に接続して接地ネジを配置します。
- 電気生理学的記録中に筋の成果物を防ぐためにセメントを完全に接地ネジをカバーしてください。すべてのネジ (図 1E) を接続するセメント リングを構築します。
- (海馬、AP-1.94、L 1.4、前参考 V 1.4) の注入側の上に開頭術を実行します。脳組織の表面に約 5 μ L の滅菌食塩を適用します。
- 藤枝を使用して、開頭手術でワイヤー配列をゆっくりと下ろします。単一の録音のためインプラント シリコン プローブ ワイヤー配列63; 代わりにアイソレイション軽いアーティファクトを防ぐためにインプラント海馬で個別に光ファイバーのファイバー先端プローブに直接直面している (図 1 -私)。半球同調の調整の調査、対側の海馬 CA1 野の追加の光ファイバーをインプラントします。
- 暖かい液体ワックス/パラフィン オイル、脳組織を保護するために注入サイト上記注射器で 70 ° C に予熱の約 5 μ L を適用します。
- 適用電線配列の周りのセメントとセメントと頭蓋骨をカバーします。
- Presoldered 接地/基準線、例えば、針を使用してください接地ネジに接続されている presoldered 線にフラックスの一滴を適用し、ヒューズ ワイヤをはんだ付け装置を使用してください。
- セメント系全体のアース線をカバーします。
- 0.3 mL Erycinum (1:4 で滅菌 NaCl) を管理、カルプロフェン (5 mg/mL) i. p. 手術後、少なくとも次の 2 日間。マウスは通常術後 15 分以内に目覚めます。回復をスピードアップする赤いランプと、動物を温めます。
- 術後最初の週または重量が安定するまで、マウスの重量を毎日監視します。減量手術の前に記録されたマウスの重量の 10% を超えてはなりません。体重の安定化を加速させ、術後最初の日の間にウェット フードとコンデンス ミルクを使って、マウスを供給します。
- Ref. 62で説明するようインプラント海馬 (AP-1.94、L 1.4 V 1、それに続く低下) シリコン プローブの引き込み時に海馬の細胞の活動を記録する (図 1 -私)。AP-3 L 1.4 V 1.6 39 ° 尾側吻側で海馬に光ファイバーをインプラントします。細胞突起の刺激が必要な場合は、MS (AP +0.98 L 1 V 3.9 横方向 15 °) で追加の光ファイバーをインプラントします。
5. 光刺激と電気生理学的データ集録
- レコーディングの設定 (例えば、15 分のセッション、3 日間の 1 日あたり 1-2 セッション) にマウスを慣らします。最初の実験から始まる前に動物の行動を調べます。環境、スニッフィング、鳥、等を実行する室で、マウスが移動する場合は、最初の実験的セッションを開始します。
- 同じ部屋で他の動物の不在でおなじみ商工会議所にマウスを配置します。
- 粘着テープを使用して動物の位置を追跡する頭段に LED を接続します。動物が実験を開始する前に録音室を探っている期間中カメラで LED の光が反映していることを確認します。暗闇の中で LED の光を追跡するために記録します。録音室の上カメラを配置します。
- パッチ コードから光出力を確認します。注入された光ファイバーの伝送速度に応じて接続後ファイバー先端から光出力を推定します。光ファイバーの先端から光出力を 5-15 mW の, 信頼性の高い同調できるように間を確認します。
- パッチアンプ用アダプター プリアンプを慢性埋込コネクタに接続します。光刺激実験のため慢性埋込海馬繊維に光ファイバー パッチ ケーブルを接続します。制御光の刺激実験でヘッドセットに接続してダミー フェルールに光ファイバーを接続します。
- 記録室にマウスを配置します。
- 刺激のプロトコルを生成する刺激発生器を制御するソフトウェアを開きます。
- 473 nm 固体レーザを制御するチャネルを選択します。最初の行に入力 3,000 mV (1 列)、速度 30 ms (2 列)、0 mV (3 列)、112 ms の時間 (4 列)、行の繰り返し 840 とグループ 2 分 30 ミリ秒長いパルス 7 Hz 刺激のためのプロトコルを生成する、繰り返しの 1。別の周波数または別の期間で刺激が必要な場合は、4 の列と行の繰り返しの数で時間を調整します。2 番目の行選択 0 mw (1 列) 時間 500 h (2 列)、行手順 1、およびグループは刺激プロトコルを終了した後、レーザーがオフされていることを確認する 1 を繰り返します。
- クリックして"ファイル > 名前を付けて"希望の名前でファイルを保存し、。
- 刺激 TTL 出力電気生理学的の集録を同期するデジタル大山猫のアナログ入力ボードに接続されているレーザーのトリガーであることを保証し、光遺伝学的データ。
- また、パラメトリック シータ発振周波数の変動を調整するため、ガウス分布に従う期間、パルス間間隔変動に伴う光パルスの列車を適用します。例えば、ステップ 15.1 に 3.2 ms2からさまざまなプロトコルのパルス間間隔の分散を変更します。シータ周波数 (図 6) の異なる変動とシータの新紀元を生成するこれらのプロトコルが適用されます。
- 記録システムのソフトウェアを開きます。「ACQ」を取得すると"REC"を記録するをクリックします。ベースラインの動作 (例えば、基準速度を取得するために 2 分またはベースラインの場所フィールドを抽出する 30 分) を記録する光刺激を開始する前に待機します。
- 刺激発生器を制御するソフトウェアを開きます。「ファイル > 開く」をクリックし、選択したプロトコル ファイルを選択します。「ダウンロードと開始」光の刺激を開始するをクリックします。
注: 実験を調査することができますと刺激がリモート コントロール経由で開始されました。これは、実験者の存在の動物の行動に及ぼす影響を除外します。研究の目標に応じて刺激を開始し、特定の動作中に終了できます。
6. 光同調と海馬の出力の投影固有阻害の組み合わせたアプローチ
- セクション 1 で説明したように PV Cre マウス MS gaba 作動性細胞における ChR2 を表現します。
- さらに、両背側海馬半球 (AP-1.7; の CamKIIα 依存ハロロドプシン (eNpHR3.0、 AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) の 2.4 μ L の合計を注入します。L ± 1.05;V-2.05 と 1.4 mm;AP-1.7;L ± 1.7;V-2.05 と 1.55 mm;AP-2.3;L ± 1.5;V-2.2 と 1.3 mm;AP-2.3;L ± 2.2;V-1.65 ・ 2.45 mm)。
- 式の時間の 6 週間かかります。
- セクション 4 で説明した海馬 ca1 で光ファイバーでタングステン細線アレイをインプラントします。さらに、インプラントの外側中隔で二国間光ファイバー (LS、AP 0.1、0.25 L、V-2.250 mm と AP 0.5 L-0.3、V-2.70 mm)。
- 光シータ同調実験手順 5.4 5.5 で説明したよう実行します。
- 海馬 LS 出力の同時抑制プロトコル刺激信号生成を生成する:例えば、トリガー出力チャネルの発症が合計 45 の持続的な連続的な脈拍と 593 nm DPSS レーザー 15 s に接続をトリガーする前に、s473 nm 固体レーザのパルス出力。
- 593 nm DPSS レーザーにマルチモード光ファイバーの光結合器を用いたパッチコードを介して LS で両方のファイバーを接続します。
- 録音を開始、ダウンロードし、トリガー刺激生成を制御するプロトコル。
7 データ処理
- 電気生理学的信号を変換し、.dat および .pos フォーマット、それぞれ64に神経生理学的データ (ND) マネージャーで追跡データを配置します。
- 低域通過フィルターと ND マネージャー661,250 Hz の広帯域信号のダウン サンプリングして LFP を取得します。
- 各録画のシータ振動 (Neuroscope を使用して)19の最大振幅とチャンネルを選択します。
- しきい値検出アルゴリズムとレーザー パルスの刺激新紀元のタイムスタンプを検出 (MATLAB 関数 findpeaks.m を使用してまたは類似)11。
- 多チャンネル データ分析ソフトウェアで .dat ファイルをインポートするには、「ファイル > インポート」をクリックして、データ型として「バイナリ ファイル」を選択し .dat ファイルを選択します。構成] ダイアログで、正しいチャンネル数と 1,250 Hz のサンプリング レートを入力し、"ok"をクリックして .smr ファイルとして保存します。パワー スペクトルをプロットするには、「分析 > 新しい結果表示 > パワー」を選択します。設定で最高の θ 振幅と FFT サイズを 16,384 チャンネルを選択、クリックして「新規」、「開始時刻」と「終了時間」として刺激新紀元の初めを定義刺激エポック社の「プロセス」をクリックして終了います。
- 光刺激の周波数範囲内で累積的なパワー スペクトル密度 (PSD) の比として引き込み忠実度を計算 (刺激周波数 ± 0.5 Hz)、multitaper メソッドでシータ (5-12 Hz) バンドで累積的な psd ファイル (NW = 3、ウィンドウ サイズ 8,192) 10 s 新紀元のため (例えば、ツールキット < http://chronux.org/>)。
- 支配的な PSD ピークが ≤ 記録新紀元を除外する (非シータ新紀元、MATLAB 関数 find.m を使用して) の分析から 5 Hz。
- (MATLAB 関数 sortrows.m および pcolor.m を使用して) 計算された同調忠実に従ってすべての記録された新紀元の LFP パワー スペクトルのラスターをプロットします。パワー スペクトルと同調を読み込み変数インチ型パワー格納され、「ファイル > 開く」をクリックして忠実に再現 = sortrows(In,1);pcolor(Power(:,2:end))。
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Representative Results
セクション 1 で説明した MS の gaba 作動性セルに chr2 ターゲットは、図 2 aで示されています。背側海馬 CA1 領域の上移植は光ファイバー経由で MS gaba 作動性細胞の軸索の光遺伝学的刺激だけでなく、対側同側 (図 2 b) の刺激の周波数でシータをヘアレスします。半球 (図 2)。シータは、これの有効性は相対的なシータ刺激周波数、すなわち、この辺りは LFP 電源として各記録の新紀元のため計算された光刺激 (図 3 a) にもっとまたはより少なく効率的に同伴されることができます。同調は (図 3 b) を忠実に再現。0.3、すなわち、自然の光を録音でより高い上同調忠実度は録音時代の約 80% に認められた.非シータ周波数で Optostimulation が少なく効果的な (図 3)。
明示的なすなわち、シータ振動周波数、シータ秩序の創発的変化を伴ってのパラメトリック操作: 振幅の時間的な規則性とシータ振動の周波数は高い新紀元の間に増加しました。同調忠実に再現。期間に従う (図 4) 分散の異なるガウス分布の光パルスの列車を適用することによって振動の安定性をパラメトリックに調節もできます。
振動周波数の光遺伝学的制御は、シータ周波数と (図 5 a) 移動中に求心性神経を昇順で MS 経由で周波数制御に一致しての走行速度との相関を排除しました。Optostimulation はまた、不動 (図 5 b) の中にシータを誘導しました。優遇焼成段階推定錐体細胞の CA1 野、介在ニューロンが自発的なシータ (図 6) と比較されたとき生じる気流シータ振動を基準にして変更されます。
移動、θ パミンで外側中隔経路に海馬の貢献を研究する我々 生じるこの経路を阻害しました。ハロロドプシン (eNpHR3.0) は、ChR2 は上記として MS gaba 作動性細胞に表現され、シータ振動が生じる気流 (図 7 b) に対し両側海馬錐体細胞 (図 7 a) に表現されました。シータ同調削減実行速度しますが、ない LS 経路に海馬が抑制されたときの変動 (図 7)。
図 1: 光ファイバー、電極、手術の図。(A) 光ファイバーのイラスト。海馬シータ振動の同調の中に海馬 LFP の記録用光ファイバーに接着された細線アレイの (B) のイラスト。(C)、海馬の細胞の活動の記録のためシリコン プローブ、マイクロ ドライブにマウントされています。(D) ミニチュアねじ、頭蓋骨に配置されます。Presoldered 銅線は、小脳の上にそれらを配置する前に地面とリファレンスのネジに。(E) セメントは、カバーし、ネジを接続に適用されます。上の青い円は、シリコン プローブの注入のため、開頭手術を行ったことを示します。下の青い円は、海馬で光ファイバーの注入のため、開頭手術を行ったことを示します。(F) 1 つの光ファイバーが海馬 CA1 領域を対象とする尾側吻側角に注入されます。第 2 繊維は細胞突起の刺激が (オプション) 必要な場合、内側中隔で埋め込むことができます。海馬 CA1 野の真上に (G) シリコン プローブを下げています。(H) マイクロ ドライブとコネクタの境界がインプラントと地面に超硬合金し、参照線をはんだ付けします。(私) 銅メッシュは、インプラントを囲むと、ファラデーケージとして構築されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 光海馬シータ引き込みのための準備。(A) ChR2 PV Cre マウス (上部方式) の PV+内側中隔細胞で発現していた。MS (1, 2) で明るい蛍光突起で成功した構造式を確認します。MS 繊維の円蓋 (f) と (3-6); の海馬采 (fi) を介してプロジェクトします。aca: 前交連;前部。斜めバンドの水平肢の HDB: 核または: 地層オリエンス。海馬 ca1 の錐体層 (低い方式) の上が青色光刺激の光ファイバーに注入されます。スケール バー: 500 μ m (イメージ 1、3、4) 50 μ m (画像 2、5、6)。(B) 自発的なシータ振動 (左) と 7 Hz (中央) または 10 Hz (右) 光同調中に海馬 LFP。ブルーのストライプは、光アプリケーションのタイム ・ ウィンドウを示します。リセット矢印によって示される光パルスによる位相に注意してください。自然と同調シータ、θ リズムの生理的指標の中にガンマ封筒に注意してください。地層オリエンスの間の反転を相 (str. か。) 地層結腸寄生虫 (str. ゲージ用) は引き込み時にも維持されます。(C) 同調、対側 (低プロット) と同様に、同側 (上プロット)、間に信頼性の高い光遺伝学的刺激。スキームは、電極の位置に点で線維の位置を示しています。例 LFP トレース シータと光パルスのアプリケーションの中には、中央に表示されます。右側に、歯髄と反対側刺激刺激周波数に応じて色分けの中に海馬 LFP のスペクトルを電源します。この図は、ref. 11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 光海馬シータ同調の忠実度。忠実度の低く、高い同調時 (A) 例海馬 LFP のトレース。(B) 10 秒エポックのスペクトル密度の電源をリード (左)、シータ周波数に従って並べ替えられた行との自発的なシータと 7 Hz (中央) と 10 Hz (右) 光刺激、引き込み忠実に従って並べ替えられた行。上記各例パワー スペクトル (矢印によって示されます) がプロットされます。新紀元の間で信頼性の高い同調忠実度に注意してください。右側に、シータ周波数の引き込みの正確性の累積的な確率が表示されます。(C) 引き込みシータのリズミカルな刺激が必要です。海馬神経回路網の活動は、6-12 Hz の間の周波数を使用して正常に同調することができます。低い周波数 (例えば、2 または 4 Hz) またはより高い (例えば、20 Hz) の周波数引き込みは信頼できません。この図は、ref. 11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: シータ振動規則のパラメーター操作します。(A) 刺激は、ガウス分布に従う 7.8 Hz の平均周波数とシータ範囲内の周波数を変えることで適用されました。パルス間間隔の標準偏差 σ からプロトコル増資 = σ に 3.19 15.09 を =。合計では、11 プロトコルが生成され、それぞれ 1 分刺激エポック社の合計時間に適用。、それらのプロトコルを 5 つの確率分布は図の左側に表示されます。それぞれのプロトコルの使用中に海馬の LFP の 1-14 Hz の範囲内のパワー スペクトル密度は図の中にプロットされます。それぞれのプロトコルの使用中にシータ期間の確率を右側に示しています。適用の分散 (B) パルス間間隔決定同時シータ期間の差異 (ピアソンの r = 0.94、 p = 0.0002)。Θ 振幅変動とパルス間の関係 (C) 間隔 (ピアソンの r = 0.61、 p = 0.08)。この図は、ref. 70から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 光 θ リズム同調動作中に海馬 LFP を判断します。(A) 光刺激の周波数は、運動中にシータ周波数を決定します。したがって、速度関連求心性神経に海馬シータ周波数は影響しません、結果として速度相関性がないシータ周波数 (青) と自発シータ (黒) の間にであります。静かな覚醒時 ± s.e.m. (B) を意味するようにデータが表示されます、海馬シータは、動きのない状態で誘発されることができます。海馬の LFP トレース前に、および成功した同調中は上記し、同調の中に記録された例速度トレースは以下 (赤のトレースの上に描かれた海馬 LFP トレースに相当)。ブルーのストライプは、光刺激パルスの時間窓をマークします。この図は、ref. 11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: シータ引き込み時に海馬の細胞の活動。(A) 細胞の活動は、シリコン プローブ (方式) を使用して記録されました。1 つの介在神経細胞と錐体細胞が分離・彼らのそれぞれの波形によると同定します。ここで示すように、平均波形 (中央) と例の分離錐体細胞の自動コレログラムです。(B) 優先放電段階 (Pyr) の錐体細胞の自発の間に差は認められなかった (黒、n = 29 ニューロン) と生じる気流 (青、n = 30) シータ (p = 0.79)。(C) 表示ここでは、(左) 自動コレログラムと自発的な中高速焼成介在ニューロンの優遇発火位相と生じる巻き込みシータ。自発 (左) と噴流 (右) シータの中に対応する海馬 LFP リズム下(D) 高速焼成介在ニューロンの優先放電段階の間に差は認められなかった (ブラック) で自然と生じる気流 (青、n = 28 ニューロン) シータ (p = 0.97)。平均自動コレログラムが左側に表示されます。(E) 平均自動コレログラム str. オリエンス セルです。(F) 優先放電段階 str. オリエンス介在ニューロンの自発 (黒) および生じる気流中に差は認められなかった (青、n = 10 ニューロン) シータ (p = 0.56)。最寄りの放電段階のヒストグラムは右に表示されます。(G) 平均発火率が錐体細胞のシータ同調の影響を受けなかった (p = 0.98)、高速焼成の介在神経 (p = 0.96) または str. オリエンス介在神経 (p = 0.85)。この図は、ref. 11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 海馬シータ同調と光の抑制、海馬皮質 LS 出力の組み合わせ。(A) eNpHR3.0 (ハロロドプシン) だった海馬錐体細胞 (上部方式) で表されます。成功した発現コンストラクトは、海馬 (上画像) に突起や軸索 ls (下画像) で明るい蛍光によって確認されました。光ファイバーは、LS (低い方式) 上記二国間に移植されました。スケール バー: 500 μ m (左の画像)、50 μ m (右の画像)。(B) 海馬シータは LS 経路に海馬の抑制時正常に引きずられます。出力抑制中 9 Hz 青色光刺激のパワー スペクトル密度は、ここで示されています。(C) 主要な海馬皮質出力経路阻害速度海馬シータ エントレインメントの効果。(バーと白青の枠線)、光遺伝学的同調時の速度変動の減少が存在しないは、ここで示されている LS 経路 (青い輪郭の黄色バー) に海馬の同時抑制に。それぞれの平均基準速度が左側に表示されます。この図は、ref. 11から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで私たちは同調行動中の動物の海馬シータを引き出す方法論が広くアクセスを発表しました。このアプローチは、情報処理や動作の θ の関数の研究に役立ちます。このメソッドの重要な側面が含まれます: (1) オプシンの選択と MS の軸索に chr2 ターゲット細胞海馬、継続的な刺激と LFP ように注入された光ファイバー線配列アセンブリの (2) 堅牢な光・電子機能マウス、シータ周波数で光の最適な量の (3) の適用、引き込み再現 (4)ホックを投稿定量化と optoelectrical アーティファクトの (5) のコントロールの動作の記録。
最初の点の主な注意点は、内側にある静脈叢を温存するセキュリティで保護されたウイルス注入です。このステップの最適な施術は、注射の成功率を低減でき、結果の取得が遅れる可能性があります。オプシンの動力学を考慮する、ChR2 (アクティブ化の時間: 2 ms、殺菌時間: 9 ms65)。2 番目の点は、光透過率の再現性の制御と注入電極のインピー ダンスを要求し、追加インプラントのタイムリーな作製から通常の利点します。
第 3 考察オプトジェネティクス大規模回路操作を目指すが一般的、光源や光インターコネクション、5-15 mW の脳内 100 μ m ファイバー光経由で提供しています。各マウスの各録音の前に、テストの記録は実験に最適な強度に光出力を設定する実行できます。光出力が十分に高く十分な熱誘発や組織の損傷を防止するために信頼性の高い同調シータ振動が高すぎないように投影数を有効にする必要があります。
前後側面に関して光パルスと同じ AD コンバーターを介して両方のデータ型をサンプリングすることによって高い精度で達成、LFP データの同期。神経の放電と LFP の研究を目指して他の潜在的なアプリケーションのために特に必要、同期のタイム ・ スタンプ。同調効果は間および刺激時代の内で変わることができます。これは最も可能性の高いリズム干渉 θ16,66,67,の複数の発電機のための組み込みおよび感覚の駆動信号光刺激による設定ために発生します68この非常にダイナミックな光操作69の瞬時の忠実度の定量化はつまり、因果推論、すなわち、影響の大きさとの関係を明らかにするために非常に役立つ (など。、挙動の変化)、選択した同期の側面の光遺伝学的制御の瞬間的な効果。重要なは、複数の振動パラメーターは、光刺激などにより影響が、同調周波数のロックだけでなくシータ振動11の定期的な振幅を仲介します。
第五に、光の刺激は、しばしば optoelectrical 人工物、金属電極の光電気化学的効果によって誘発関連付け。その程度は、電極材料、電極先端部の光ファイバーと光への近さによって異なります。ここで説明した実験で成果物を繊維と記録電極間の距離を増やすことによって避けることができる optoelectrical を閉じますの位置決めシータ振動監視のために不可欠ではないです。時間とチャンネル間一貫した形を表示する Optoelectrical アーティファクトと、したがって、スパイクの並べ替え中に彼らは通常異なるクラスターにグループ化され、記録されたニューロン70とは重複しません。同時に、アーティファクトである波形を変更すると、活動電位のごく一部はニューロンによって発生した他のスパイクとアルゴリズムを並べ替えてグループ化されません。層流の LFP プロファイル (図 2 b) ワイヤー配列を含むさまざまな電極構成を用いて、線形シリコン プローブ、アーティファクトと、前者の一定の位相に基づく真の LFP パターンの明確な差別化を有効にして後者の生理学的な層流位相オフセット。刺激前ベースライン録音は、典型的な層流相プロファイルなどの特性の theta 機能の探索を有効にします。
シータの光遺伝学的制御は海馬の CA1 レイヤーのすべてのレイヤーでシータ同調し、対側の同調にも繋がります実験は (存在する場合は、限られた地域や集団の刺激効果は、勉強する目的と) 向けローカル刺激である場合、これはアカウントに取られるべきです。海馬投射紹介 MS PV+細胞の空間的に限られた刺激が体光刺激よりもシータ振動、すなわち同調、確定性が低下操作を可能する一方で最近ハイパーカプニア マウス71で適用される MS PV+セル。後者の体刺激は一貫して海馬の振動の周波数の結果 40 Hz まで、このように信頼性の高いリズミカルなペーシングのケースを表します。対照的に、ここに示す軸索刺激シータ周波数帯域 (図 3) に優先的に有効である、したがってより同調、倉本遷移72、すなわち、おそらく経由と同様です勤務周波数刺激発症自発シータで現在のものに近い。
ここで説明した光遺伝学的準備のシータ振動機能の操作が可能、レム睡眠73中シータ振動効率を阻害する MS 抑制的なニューロンの体細胞の光阻害を適用されています。相手のコントロール (例えば、 12) 神経細胞の興奮のため光アクチュエータを用いた 2 つの手法の統合に因果のさらなる研究のための同じ動物の θ リズムの双方向制御できる可能性があります。ネットワークの振動と動作のさまざまな側面との間の接続。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
原稿のデータ分析による専門家の助けのためのマリア ・ Gorbati とコメントのジェニファー Kupferman に感謝したいと思います。この作品は、ドイツ研究振興協会 (DFG; によって支えられました。Exc 257 NeuroCure、TK と AP;優先順位プログラム 1665、1799/1-1(2)、ハイゼンベルグ プログラム、AP 1799/2-1)、ドイツ ・ イスラエル科学研究開発 (GIF; 財団私-1326-421.13/2015 年、TK) と人類のフロンティア ・ サイエンス ・ プログラム (HFSP;RGY0076/2012、TK)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PV-Cre mice | The Jackson Laboratory | B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgery | |||
| Stereotaxis | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | Model 963 | Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Drill bits, 0.8 mm | Bijoutil, Allschwil, Switzerland | 49080HM | |
| 0.01-1 ml syringe | Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | |
| Sterican cannulas | Braun | 26 G, 0.45x25 mm BL/LB | |
| Fine and sharp scissors | Fine Science Tools Inc., Vancouver, Canada | 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc. | 11210-10 | Dumont AA - Epoxy Coated Forceps |
| Blunt stainless steel scissors | Fine Science Tools Inc. | 14018-14 | |
| Soldering station | Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany | WSD 81 | |
| Erythromycin | Rotexmedica GmbH, Trittau, Germany | PZN: 10823932 | 1g Powder for Solution for Infusion |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optogenetics | |||
| Hamilton pump | PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | model 703008 | PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism |
| Hamilton 5 µL Syringe, 26 gauge | PHD Ultra, Harvard Apparatus | Model 75 RN SYR | |
| Hamilton 5 µL Plunger | PHD Ultra, Harvard Apparatus | Model 75 RN SYR | |
| Tubing | Fisher Scientific, Pittsburgh, USA | PE 20 | Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043") |
| Sterican cannulas | Braun, Melsungen, Germany | 27 G, 25x0.40 mm, blunt | |
| Precision drill/grinder | Proxxon, Wecker, Luxemburg | fbs 240/e | |
| Cutting disks | Proxxon | NO 28812 | |
| Cre dependent channelrhodopsin | Penn Vector Core, Philadelphia, PA, USA | AV-1-18917P | Contruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42x1013 vg/ml |
| Cam kinase dependent halorhodopsin | Penn Vector Core | AV-1-26971P | Construct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml |
| Multimode optic fiber | ThorLabs, Dachau, Germany | FG105LCA | 0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 - 2400 nm |
| Ceramic stick ferrule | Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA | CFLC126 | Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um |
| Polishing paper | Thorlabs | LF3D | 6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD |
| Multimode fiber optic coupler | Thorlabs | FCMM50-50A-FC | 1x2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC |
| Fiberoptic patch cord | Thorlabs | FG105LCA CUSTOM-MUC | custom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule |
| Sleeve | Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA | ADAL1 | Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules |
| 473 nm DPSS laser | Laserglow Technologies, Toronto, ON, Canada | R471005FX | LRS-0473 Series |
| 593 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | R591005FX | LRS-0594 Series |
| MC_Stimulus II | Multichannel Systems, Reutlingen, Germany | STG 4004 | |
| Impedance conditioning module | Neural microTargeting worldwide, Bowdoin, USA | ICM | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrophysiology | |||
| Tungsten wires | California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USA | CFW0010954 | 40 µm, 99.95% |
| Capillary tubing | Optronics | 1068150020 | ID: 100.4 µm |
| Omnetics nanoconnector | Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, USA | A79038-001 | |
| Screws | Bilaney, Düsseldorf, Germany | 00-96x1/16 | stainless-steel |
| Silicone probe | NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USA | B32 | |
| Headstage | Neuralynx, Bozeman, Montana USA | HS-8 | miniature headstage unity gain preamplifiers |
| Silver conductive paint | Conrad electronics, Germany | 530042 | |
| Liquid flux | Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Germany | Lötöl ST | DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11) |
| LED | Neuralynx | HS-LED-Red-omni-10V | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | ||
| MC_Stimulus software | Multichannel, Systems | ||
| Neurophysiological Data Manager | NDManager, http://neurosuite.sourceforge.net | ||
| Klusters | http://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006 | ||
| Software of the recording system | Neuralynx | Cheetah | https://neuralynx.com/software/cheetah |
| Multi-channel data analysis software | Cambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GB | Spike2 |
References
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