Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57349
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2
1Systems Neurophysiology Research Group, Institute of Clinical Neuroscience and Medical Psychology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Behavioural Neurodynamics Group, Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP)/ NeuroCure Cluster of Excellence, 3Neuronal Circuits and Behavior Research Group, Max Planck Institute for Metabolism Research

Summary

Nós descrevemos o uso de optogenetics e eletrofisiológicas gravações para manipulações seletivas das oscilações de theta hippocampal (5-10 Hz) no comportamento de ratos. A eficácia do arrastamento ritmo é monitorada utilizando o potencial do campo local. Uma combinação de opto - e inibição farmacogenética aborda a leitura eferente de sincronização hippocampal.

Abstract

Dados abrangentes sobre relacionamentos de oscilações de rede neural para comportamento e organização de descarga neuronal em todas as regiões do cérebro chamam para novas ferramentas para manipular seletivamente ritmos cerebrais. Aqui nós descrevemos uma abordagem combina optogenetics de projeção específico com eletrofisiologia extracelular para controle de alta-fidelidade de oscilações de theta hippocampal (5-10 Hz) no comportamento de ratos. A especificidade do arrastamento a optogenetic é conseguida pela segmentação channelrhodopsin-2 (ChR2) à população gabaérgica das células do septo medial, crucialmente envolvidas na geração das oscilações de theta hippocampal, e um local sincronizado ativação de um subconjunto de afferents septal inibitório no hipocampo. A eficácia do controle do ritmo de optogenetic é verificada por um monitoramento simultâneo do campo local potencial (LFP) entre lâmina da área CA1 e/ou de descarga neuronal. Usando esta preparação facilmente implementável mostramos a eficácia de diferentes protocolos de estimulação optogenetic para indução de oscilações de theta e para a manipulação de sua frequência e regularidade. Finalmente, uma combinação do ritmo theta controle com inibição de projeção específico aborda a leitura de aspectos particulares da sincronização hippocampal por regiões eferentes.

Introduction

Atividade neuronal em mamíferos é coordenada por oscilações de rede, que ajudam a transferência de informações dentro e entre regiões cerebrais1,2,3,de4. Ritmos do cérebro incluem oscilações variando de muito lento (< 0,8 Hz) até ultra rápidas frequências (> 200 Hz). Um corpo grande da evidência suporta envolvimento das oscilações de rede em funções cerebrais diversas, incluindo cognição5,6,7,8,9,10 , comportamentos inata11,12 , bem como distúrbios neuropsiquiátricos, tais como a doença de Parkinson e epilepsia de14,13,15. Seletivos e temporalmente precisos métodos para manipulação experimental de oscilações de rede são, portanto, essenciais para o desenvolvimento de modelos fisiologicamente plausíveis de sincronização e para estabelecer nexos de causalidade com o comportamento.

Sincronização de rede é mediada por diversos substratos biológicos e processos, variando de identidade molecular de canais iônicos e sua cinética de neuromodulação da excitabilidade e conectividade de rede. O projeto biológico do ritmo geradores16 foi revelado para muitos ritmos cerebrais, aspectos distintos do qual (por exemplo, frequência, amplitude) são muitas vezes provocada pela dinâmica de redes e tipos de células distintas. Por exemplo, interneurônios inibitórios visando o somata das células principais são os jogadores mais importantes em bandas de frequência e cérebro regiões17,18, incluindo theta19,20, gama20 , 21e ondulação (140-200 Hz)22 oscilações. Por sua vez, sincronização de fase de células distantes é assegurada pelo robusto feed-forward sinalização de células piramidais, que redefine o disparo dos interneurônios. Um parâmetro crucial das oscilações, o tamanho da população neuronal sincronizada, está intimamente relacionado com a amplitude da oscilação LFP medidos e, pelo menos para oscilações rápidas, depende a unidade excitatória sobre interneurônios2. Em contraste, oscilações mais lentas, como delta e theta ritmos, são geradas pelos laços reentrantes de longo alcance, formados por córtico-talâmica23,24 e hippocampal-medial septal projeções25, 26,27, respectivamente. Oscilações em tais circuitos são trazidas pelas interações de atrasos de propagação do sinal, respostas excitáveis e sua preferência de frequência em participantes células28,29,30, 31 , 32. projeções inibitórias gabaérgica parvalbumin (PV)-positivo são células do septo medial (MS) para interneurônios no hipocampo25,33, regiões hipocampal e de córtex entorhinal26 essencial para a geração de oscilações de theta no lóbulo temporal. Assim, os mecanismos fisiológicos de oscilações de rede e sincronização neuronal podem ser manipulados usando optogenetics com uma precisão em tempo real.

Célula tipo específico optogenetic manipulações foram aplicadas para estudos das oscilações hippocampal e cortical em vitro34,35,36,37,38 e vivo em30,39,40,41,42,,43,44,45, incluindo funcional investigações de gama5,12,36,46,47,,48,,49,50, 51,52 e ondulação oscilações40,53,54 e sono fusos55,56. Recentemente nós expressa um vírus ChR2 Cre-dependente no MS, uma região chave para a geração do ritmo theta hippocampal, dos ratos PV-Cre. Usando esta preparação, características das oscilações theta hippocampal (frequência e estabilidade temporal) eram controladas por estimulação optogenetic de projeções inibidoras do MS no hipocampo11. Além disso, a estimulação de optogenetic frequência theta de projeções de displasia septo-hippocampal inibitórias evocado ritmo theta durante imobilidade acordada. O optogenetically arrastado Propriedades do ritmo theta exibido das oscilações de theta espontânea no rato na LFP e níveis de atividade neuronal.

As principais características deste protocolo incluem: (1) utilização de uma via inibitória que é fisiologicamente essencial para oscilações de theta espontânea, evitando efeitos inespecíficos na excitabilidade hippocampal; (2) axonal, ou seja, estimulação de projeção específicas para minimizar uma influência directa na não-hippocampal MS eferentes; (3) local theta-rítmica estimulação de luz, garantindo uma mínima interferência direta com dinâmica de displasia septo-hippocampal theta-rítmica e um arrastamento bilateral global das oscilações de theta; (4) paramétrico controle de frequência de oscilações de theta e regularidade; e (5) quantificação de fidelidade de arrastamento com alta resolução temporal usando LFP para permitir a análise quantitativa de causalidade em comportamento de animais. Uma vez que esta preparação essencialmente capitaliza sobre um papel bem conhecido da displasia septo-hippocampal desinibição em theta geração25,30, permite controle robusto sobre vários parâmetros de oscilações de theta no comportamento de ratos. Estudos onde outros menos caminhos investigados e tipos de células, os circuitos de displasia septo-hippocampal foram manipularam38,39,,47,,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 mais revelar mecanismos do ritmo theta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

PV-Cre bater-nos ratos masculinos59, 10-25 semanas de idade, foram utilizados. Os ratos foram alojados em condições padrão na instalação de animais e mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h. Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes nacionais e internacionais e foram aprovados pelas autoridades sanitárias locais (turismo für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen).

1. viral injeção

  1. Durante todo o processo, siga as orientações de segurança biológica60. Vestir um jaleco, máscara cirúrgica, uma touca e dois pares de luvas.
  2. Cortar um tubo com um bisturi estéril ou tesouras para aproximadamente 1 m de comprimento, inseri-lo no bloco suporte da bomba de seringa e corrigi-lo.
    1. Encha o tubo inteiramente com óleo de silicone, usando a seringa.
    2. Verifique se as bolhas de ar aparecem na tubulação. Se observam-se bolhas de ar, encha novamente o tubo com óleo.
    3. Corrigi o êmbolo para o bloco do empurrador.
    4. Avance lentamente o empurrador para o bloco de titular de seringa até a ponta do êmbolo toca a tubulação.
    5. Insira a ponta do êmbolo no tubo e automaticamente mover o bloco de empurrador em frente a uma velocidade lenta, selecionando "Infuse" na janela de comando e uma taxa de infusão baixa (por exemplo, 500 nL/min) até que ele atinja o bloco de titular de seringa.
  3. Prepare a agulha de injeção (34G).
    1. Retire o eixo da agulha com um corte limpo, usando um broca de precisão/moedor conectado a um disco de corte. Se necessário, use uma agulha para remover resíduos de metal da superfície recém cortada.
    2. Passe o tubo capilar (3-4 cm de comprimento) através da agulha.
    3. Cola a agulha para a tubagem com super cola.
    4. Conecte a agulha de injeção para a extremidade do tubo, que se conecta à bomba micro-seringa.
  4. Anexe a agulha para o titular estereotáxica.
  5. Retire o ar até uma bolha de ar no tubo transparente acima da agulha é visível.
  6. Anestesia o mouse com isoflurano 1,5-3% de oxigênio. Espere aproximadamente 2-3 min, em seguida, confirme que o mouse é totalmente anestesiado, avaliando sua resposta a uma pitada de dedo do pé. Durante a cirurgia, monitorar a respiração do animal e ajustar a concentração de isoflurano, se necessário.
  7. Posicione o mouse no quadro estereotáxico usando suportes de orelha não-traumáticos.
  8. Protege os olhos do rato com um gel de lipídios.
  9. Injetar lidocaína 0,1 mL por via intradérmica sob a pele cabeça usando um 0,01-1 mL seringa e uma cânula de injeção de 26G.
  10. Depilar e desinfetar a cabeça do rato utilizando solução de etanol. Então alterne três vezes 2% clorexidina com etanol para desinfectar o local da cirurgia.
  11. Realize uma incisão com uma tesoura afiada e bem indo entre a parte de trás das orelhas ao nível dos olhos, para que o bregma e o lambda são visíveis.
  12. Limpe o crânio aplicando aproximadamente 50 µ l de NaCl, usando uma seringa e seque com um lenço de papel e um sopro de ar.
  13. Posicione a cabeça de rato, ajustando o nível do dorso-ventral do grampo do nariz para que o bregma e o lambda são no mesmo nível dorso-ventral (± 0,3 mm).
  14. Faça um furo acima do MS (AP 0,98 e L 0,5 mm em referência o bregma).
  15. Neste ponto, descongele uma alíquota do vírus (deve conter pelo menos 2 µ l de AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) por aproximadamente 5 min à temperatura ambiente (RT).
  16. Centrifugue a alíquota a aproximadamente 4.000 x g em RT por 1 min.
  17. Pipeta de 2 µ l do vírus em um pedaço de Parafilm; Use o lado anteriormente protegido.
  18. Mergulhe a ponta da agulha da injeção no líquido e Retire cuidadosamente a cerca de 500 nL/min, observando o nível do líquido. Para evitar a aspiração de ar, parar retirada antes que o vírus é totalmente tomado. Ajustar a taxa de retirada de acordo com a viscosidade da solução; uma taxa mais rápida pode facilitar a retirada de um vírus com viscosidade mais elevada.
  19. Limpe a agulha com um lenço de papel.
  20. Verifique se o vírus está contido no tubo e o vírus e o óleo são separados por uma bolha de ar. Marca o nível do vírus no tubo a fim de controlar se o vírus com sucesso é infundida durante a injeção.
  21. Posicione a agulha acima a craniotomia e inseri-lo lentamente no cérebro do primeiro ponto de injeção (AP 0,98, L 0,5, V-5.2, lateral 5,5 °).
  22. Injetar 450 nL do vírus a uma taxa de 100-150 nL/min. espere por 10 min. cuidadosamente mover a agulha até 0,1 mm e esperar mais 5 minutos.
    1. Mover a agulha para o segundo ponto de injeção (AP 0,98, L 0,5, V-4.6) e injetar outro 450 nL em 100-150 nL/min.
    2. Espere novamente por 10 min antes de mover a agulha até 0,1 mm... esperar mais 5 minutos antes de retirar a agulha.
  23. Sutura da incisão com sutura trançada de seda preto usando quadrado knots. Aquecer o animal com uma luz vermelha para acelerar a recuperação. Administre antibióticos (0,3 mL Erycinum (1:4 em NaCl estéril)) e carprofeno i.p. diariamente 2-3 dias após a cirurgia.
  24. Corte o tubo acima da marca que indica o nível do vírus. O tubo pode ser usado para mais injeções. Prepare uma agulha de injeção fresco antes de cada injeção.
    Nota: Esta cirurgia leva cerca de 1-1.5 h. O animal acorda normalmente dentro de 5 min após a cirurgia. Espere um mínimo tempo de 6 semanas para expressão axonal suficiente, mas não mais de 5 meses antes de realizar implantações estereotáxica, como níveis de expressão começam a diminuir cerca de 6 meses após a injeção do vírus.

2. preparação de fibras ópticas (figura 1A)

  1. Use a fibra óptica multimodo (núcleo de 105 µm, vidro revestido com núcleo de sílica, 0.22 at). Revestimento de tira 125 µm do núcleo da fibra usando uma micro-stripper, enquanto a fibra ainda estiver presa no carretel de fibra.
  2. Corte a fibra de um comprimento de aproximadamente 2-3 cm usando uma faca de diamante.
  3. Insira a fibra em uma virola de vara cerâmica zircônia (ID: 126 µm). Aproximadamente 0,5-1 mm da fibra óptica deve sobressair do lado convexo da virola.
  4. Usando uma agulha, aplica uma gota de cola epóxi para ambas as extremidades do ferrolho, mas não para os lados da virola. Como alternativa, use super-cola.
  5. Permitir que a cola secar durante pelo menos 30 min.
  6. Polir o lado convexo da virola usando diamante lapidação fibra polimento filme (grãos de 3 µm).
  7. Teste a fidelidade da transferência de luz usando um medidor de potência óptica.
    1. Defina o comprimento de onda sobre o medidor de energia para o mesmo comprimento de onda como o laser sendo usado.
    2. Posicione o cabo de patch com a ponta virada para o centro do sensor. Potência do laser e ler a saída de luz do medidor de energia. O valor de registro.
    3. Conectar o cabo de remendo através de uma luva de acoplamento da fibra óptica e posicioná-lo com a ponta da fibra virado para o centro do sensor. Potência do laser e ler a saída de luz do medidor de energia. O valor de registro.
    4. Calcular a taxa de transmissão: dividir o segundo valor pelo valor do primeiro. Se a taxa de transmissão for inferior a 0,5, descartar a fibra, caso contrário, usá-lo para implantação.
    5. Teste a taxa de transmissão para cada fibra antes da implantação.
    6. Para experiências posteriores, ajustar a saída de intensidade da luz do laser para a taxa de transmissão da fibra óptica: defina a saída de luz da ponta do cabo de remendo de 5-15, dividido pela taxa de transmissão para obter uma saída de luz final da ponta de fibra de 5-15 mW.
      Nota: Veja também ref. 61 para a preparação de fibras ópticas.

3. preparação do fio de tungstênio matrizes para LFP gravações (figura 1B)

  1. Cola-vários (por exemplo 6) 100 µm guias de tubo de sílica em paralelo ao lado de um pedaço de fita pegajoso. Corte um pedaço, aproximadamente de 4 a 6 mm, para montagem de matriz de um fio.
  2. Fio isolado formvar 45 µm tungstênio os fios através dos tubos de guia usando fórceps.
  3. Tira seis isolados de esmalte bem cobre fios (aproximadamente 5 mm de comprimento) e um fio de aterramento (aproximadamente 2-3 cm de comprimento) de ligação usando um bisturi para raspar o isolamento em ambas as extremidades. Solda-los aos pinos do nanoconnector.
  4. Conecte cada fio de ligação ao fio de um tungstênio usando uma gota de tinta condutiva prata, respectivamente. Deixe secar pelo menos 30 min.
  5. Aplique uma quantidade mínima de cimento para cobrir os fios. Não aplique o cimento sobre os fios de tungstênio, que serão inseridos no tecido cerebral ou na parte superior da nanoconnector. Deixe o cimento secar durante pelo menos 30 min.
  6. Executar um corte angular (5-20°) dos fios de tungstênio usando tesoura sem corte de aço inoxidável para permitir a implantação confiável de fios abaixo ou acima da zona adjacente ventralmente o estrato pyramidale, onde theta amplitude é demasiado baixa para a estimativa do fidelidade de arrastamento.
  7. Deinsulate da ponta (aproximadamente 2mm) do fio terra, usando um bisturi para raspar o isolamento. Trate com fluxo e presolder.
  8. Seleção de potenciais Cruz-conversações entre eletrodos usando uma digital multímetro. Para isso, conecte os pinos do conector para o multímetro, que deve ser definido como o modo de medição de resistência. Verifique emparelhadas combinações de canais; uma leitura no multímetro abaixo MΩ 5 indica significativa-conversas cruzadas.
  9. Verifique a impedância de cada eletrodo de arame em salina usando um medidor de impedância. Valores de impedância típica estão abaixo de 100 kΩ.
  10. Para facilitar a implantação, cola uma fibra óptica para a matriz do fio para que a ponta da fibra é a nível do fio mais curto e a ponteira de fibra está na proximidade, mas não tocar os fios de tungstênio. Mantenha o ângulo da fibra tão pequena quanto possível para evitar danos no tecido durante a implantação.
    Nota: Veja também ref. 62 para fabricação de matrizes de fio de tungstênio.

4. estereotáxicos implantações

  1. Realize preparações como descrito nos passos 1.6-1.13.
  2. Remover o tecido conjuntivo da parte superior do crânio e aperte os músculos do pescoço completamente por cerca de 2 mm para evitar artefatos musculares durante a gravação.
  3. Limpar o crânio usando um aplicador de ponta de algodão e soro fisiológico e faça 4 furos (2 na frente) e 2 acima do cerebelo, 0,8 mm de diâmetro para colocar parafusos de aço inoxidável de osso (00-96 x 1/16) para chão e estabilização do implante (Figura 1). Posicione o parafuso de terra, ligado a um fio de cobre (aproximadamente 2-3 cm de comprimento) acima do cerebelo.
  4. Cobrir o chão-parafuso completamente com cimento para evitar artefatos musculares durante as gravações eletrofisiológicas. Construa um anel de cimento conectando todos os parafusos (Figura 1E).
  5. Execute uma craniotomia acima do lado de implantação (hipocampo, AP-1.94, 1.4 L, V 1.4 em referência o bregma). Aplique cerca de 5 µ l de NaCl estéril na superfície do tecido cerebral.
  6. Abaixe lentamente a matriz de arame usando stereotaxis na craniotomia. Para gravações unitárias, implante uma sonda de silicone, em vez de uma matriz de fio63; a fim de evitar artefatos de luz optoelectric, a fibra óptica separadamente no hipocampo do implante com a ponta de fibra não directamente em frente da sonda (Figura 1 -eu). Para a investigação da coordenação do arrastamento entre hemisférios, implante uma fibra óptica adicional na área CA1 hippocampal contralateral.
  7. Aplica aproximadamente 5 µ l de óleo de cera/parafina líquida quente, pré-aquecido a 70 ° C, com uma seringa acima do local de implantação para proteger o tecido cerebral.
  8. Aplique o cimento em torno da matriz do fio e cobrir o crânio com cimento.
  9. Aplique uma gota de fluxo para o fio terra/referência presoldered e o presoldered fio conectado ao parafuso terra usando, por exemplo, uma agulha e fundir os fios usando uma máquina de solda.
  10. Cobrir o fio de terra inteira com cimento.
  11. Administrar 0,3 mL Erycinum (1:4 em estéril NaCl) e i.p. carprofeno (5mg/mL) após a cirurgia e pelo menos dois dias seguintes. O mouse normalmente acorda dentro de 15 min após a cirurgia. Aquecer o animal com uma luz vermelha para acelerar a recuperação.
  12. Monitore o peso do mouse diariamente para a primeira semana após a cirurgia, ou até que o peso está estável. Perda de peso não deve exceder 10% do peso do mouse gravado antes da cirurgia. Para acelerar a estabilização do peso, fornecer o mouse com comida úmida e leite condensado durante os primeiros dias após a cirurgia.
  13. Para gravar a atividade celular hippocampal durante o arrastamento, implante uma sonda de silicone no hipocampo (AP-1.94, 1.4 L, V. 1, com redução posterior) conforme descrito em ref. 62 (Figura 1 -eu). A fibra óptica no hipocampo na AP -3, 1.4 L, 1.6 V, 39 ° caudal-rostral do implante. Implante uma fibra óptica adicional no MS (AP. +0.98, L 1, 3.9 V, lateral de 15 °), se a estimulação do somata célula é desejada.

5. Optogenetic estimulação e aquisição de dados eletrofisiológicos

  1. Se habituar o mouse para a configuração de gravação (por exemplo, sessões de 15 min, 1-2 sessões por dia durante 3 dias). Examine o comportamento do animal antes de começar com as primeiras experiências. Se o mouse está se movendo na câmara, explorar o ambiente, cheirar, realizando criadouros, etc., inicie a primeira sessão experimental.
  2. Coloque o mouse em uma câmara familiar na ausência de outros animais no mesmo quarto.
  3. Anexe um LED para cabeça-palco usando fita adesiva para rastrear a posição do animal. Certifique-se que o diodo emissor de luz é capturada pela câmera durante todo o período que o animal está explorando a câmara de gravação antes de iniciar os experimentos. Registro no escuro a fim de controlar a luz de LED. Posicione uma câmera acima da câmara de gravação.
  4. Verifique a saída de luz do cabo de remendo. Estime a saída de luz da ponta da fibra depois da conexão, dependendo da taxa de transmissão da fibra implantada. Certifique-se de que a saída de luz da ponta da fibra é entre 5 a 15 mW, para habilitar o arrastamento confiável.
  5. Conecte o pré-amplificador headstage ao conector cronicamente implantado. Conecte o cabo de remendo de fibra óptica para a fibra hippocampal cronicamente implantada para experimentos de estimulação optogenetic. Em experimentos de estimulação luminosa de controle, conecte a fibra óptica para uma manequim virola conectada ao fone de ouvido.
  6. Posicione o mouse na câmara de gravação.
  7. Abra o software para controlar o gerador de estímulo para gerar o protocolo de estimulação.
  8. Selecione o canal que controla o 473 nm laser DPSS. Na primeira linha digite 3.000 mV (coluna 1), tempo 30 ms (2ª coluna), valor 0 mV (coluna 3), tempo ms 112 (coluna 4), row repetição 840 e grupo 1 repetição, para gerar um protocolo para 2 min de estimulação de 7 Hz com pulsos longos de 30 ms. Ajuste o tempo de duração na coluna o 4 e o número de repetições de linha se a estimulação em outra frequência ou uma duração diferente é necessária. No segunda linha Selecione 0 mW (coluna 1), tempo de 500 h (2ª coluna), linha repetir 1 e grupo repetem 1, para garantir que o laser está sendo desligado após o protocolo de estimulação é finalizado.
  9. Clique em "arquivo > salvar como" e salve o arquivo com um nome desejado.
  10. Assegurar que o estimulador TTL saída provocar o laser é ligado para a placa de entrada analógica Digital Lynx para sincronizar a aquisição de eletrofisiológicos e optogenetic dados.
  11. Como alternativa, para regular parametricamente a variabilidade da frequência de oscilação do theta, aplica trens de pulsos de luz em diferentes intervalos de pulso inter, com períodos seguindo uma distribuição gaussiana. Modifica a dispersão do pulso inter intervalos para protocolos diferentes, por exemplo, da etapa 3.2 para 15,1 ms2. Aplica esses protocolos para gerar épocas theta com variabilidade diferente da frequência theta (Figura 6).
  12. Abra o software do sistema de gravação. Clique em "ACQ" para adquirir e "REC" para gravar. Espera, antes do início da estimulação luminosa para registrar o comportamento de linha de base (por exemplo, 2 min para recuperar a velocidade de linha de base ou 30 min para extrair campos de lugar a linha de base).
  13. Abra o software para controlar o gerador de estímulo. Clique em "Arquivo > abrir" e selecione o arquivo de protocolo de escolha. Clique em "Download e Start" para iniciar a estimulação luminosa.
    Nota: O experimento pode ser pesquisado, e a estimulação começou através do controle remoto; Isto exclui a influência da presença do experimentador sobre o comportamento do animal. Dependendo do objetivo do estudo, estimulação pode ser iniciada e encerrada durante a comportamentos específicos.

6. uma abordagem combinada para Optogenetic arrastamento e inibição de projeção específico da saída do hipocampo

  1. Express ChR2 em MS gabaérgica células de camundongos PV-Cre, conforme descrito na seção 1.
  2. Além disso, injetar um total de 2,4 µ l de CamKIIα halorhodopsin dependente (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) em ambos os hemisférios hipocampo dorsais (AP-1.7; L ± 1,05; V-2.05 e - 1,4 mm; AP-1.7; L ± 1,7; V-2.05 e - 1,55 mm; AP-2.3; L ± 1,5; V-2.2 e - 1.3 mm; AP-2.3; L ± 2,2; V-1.65 e - 2.45 mm).
  3. Permitir que 6 semanas de tempo de expressão.
  4. Implante uma matriz de fio de tungstênio com fibra óptica na região CA1 hippocampal, conforme descrito na seção 4. Além disso, implante bilateral ópticas fibras do septo lateral (LS, AP 0.1, L 0,25 V-2,250 mm, AP e 0,5, L-0.3, V-2,70 mm).
  5. Realize experimentos de arrastamento de theta optogenetic conforme descrito nas etapas 5.4-5.5.
    1. Para inibição simultânea da saída do hipocampo para o LS, gerar uma geração de estímulo de protocolo: por exemplo, gatilho do início do canal de saída conectado ao 593 nm DPSS laser 15 s com um pulso contínuo duradoura no total 45 s, antes de acionar a saída de pulsos para o laser DPSS 473 nm.
    2. Conecte as duas fibras no LS através de cabos de remendo usando um acoplador óptico fibra multimodo para um laser DPSS 593 nm.
    3. Iniciar a gravação e download e acionar o protocolo para controlar a geração do estímulo.

7. processamento de dados

  1. Converter os sinais eletrofisiológicos e posicionar o controle de dados com dados neurofisiológicos (ND) gerente para formatos. dat e .pos, respectivamente,64.
  2. Obter a LFP filtragem passa-baixo e baixo-amostragem do sinal de banda larga a 1.250 Hz usando Gerenciador de ND66.
  3. Em cada gravação, selecione o canal com a máxima amplitude de theta oscilações (usando Neuroscope)19.
  4. Detectar os carimbos de hora dos pulsos de laser e das épocas estimulação com um limiar de detecção algoritmo (usando MATLAB função findpeaks.m ou similar)11.
  5. Para importar o arquivo. dat em um software de análise de dados de multi-canal, clique em "Arquivo > importar", selecione "arquivos binários" como o tipo de dados e selecione o arquivo. dat. Na caixa de diálogo de configuração, digite o número correto de canais e uma taxa de amostragem de 1.250 Hz, clique em "okey" e salvar como arquivo de .smr. Traça os espectros de potência selecionando "Análise > novo resultado View > PowerSpectrum". Nas configurações, selecione o canal com a maior amplitude de theta e 16.384 tamanho da FFT, clique em "Novo", define como "Start time", o início da época de estimulação e como "Tempo do fim" o fim da época de estimulação e clique em "Processo".
  6. Calcular a fidelidade de arrastamento como a relação entre a densidade espectral de potência cumulativa (PSD) dentro da faixa de frequência de estimulação optogenetic (estimulação frequência ± 0,5 Hz), para o PSD cumulativo na banda theta (5-12 Hz) com o método multitaper (NW = 3, tamanho da janela 8.192) para 10 épocas de s (por exemplo, toolkit < http://chronux.org/>).
  7. Excluir gravação épocas onde o pico dominante do PSD é ≤ 5 Hz de análise (épocas não-theta, usando MATLAB função find.m).
  8. Traça a varredura dos espectros de potência LFP para todas as épocas gravadas de acordo com a fidelidade de arrastamento computada (usando pcolor.m e sortrows.m de funções do MATLAB). Carregar os espectros de potência e arrastamento fidelidade clicando em "Arquivo > abrir", armazenado potência variável de tipo pol. = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:end)).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Direcionamento de ChR2 para células gabaérgica no MS conforme descrito na seção 1 é ilustrado na Figura 2A. Optogenetic estimulação de axônios das células de MS gabaérgica no hipocampo dorsal através de uma fibra óptica que é implantado acima da área CA1 entrains oscilações theta na frequência do estímulo em ipsilateral (Figura 2B) bem como contralateral Hemisfério (Figura 2). Oscilações de Theta podem ser mais ou menos eficientemente arrastadas pela estimulação optogenetic (Figura 3A), a eficácia do que foi calculada para cada época de gravação como um theta relativo poder LFP em torno da frequência de estimulação, ou seja, fidelidade de arrastamento (Figura 3B). Fidelidade de arrastamento acima de 0,3, ou seja, maior do que nas espontâneas luz-fora as gravações, foi observada em aproximadamente 80% das épocas a gravação. Optostimulation em frequências não-theta foi menos eficaz (Figura 3).

Explícita ou seja, manipulação paramétrica de oscilações de theta frequência é acompanhada por mudanças emergentes de regularidade theta: regularidade temporal da amplitude e frequência das oscilações theta foi aumentados durante épocas com alta fidelidade de arrastamento. A estabilidade das oscilações também pode ser regulada parametricamente aplicando trens de pulsos de luz, períodos, dos quais seguem distribuições Gaussian com dispersões diferentes (Figura 4).

Optogenetic controle sobre a frequência de oscilações eliminou a correlação entre a frequência theta e velocidade de corrida, de acordo com o controle de frequência através do MS por ascendente afferents durante o movimento (Figura 5A). Optostimulation induzido também oscilações de theta durante imobilidade (Figura 5B). As fases de fuzilamento preferenciais registrado na área CA1 nas células piramidais putativos e interneurônios foram alterados em relação a oscilação de theta optogenetically arrastado quando comparado ao theta espontânea (Figura 6).

Para estudar a contribuição do hipocampo ao pathway septo lateral no Regulamento mediada por theta de locomoção, nós optogenetically inibiu esta via. Halorhodopsin (eNpHR3.0) bilateral foi expressa em células piramidais hippocampal (Figura 7A), Considerando que ChR2 foi expressa em células de MS gabaérgica como acima e oscilações de theta foram optogenetically arrastado (Figura 7B). O arrastamento de theta reduzida variabilidade de velocidade, mas não quando o hipocampo ao pathway LS foi inibido em execução (Figura 7).

Figure 1
Figura 1: ilustração de fibras ópticas, eletrodos e cirurgia. (A) ilustração de uma fibra óptica. (B) ilustração de uma matriz de fio colado a uma fibra óptica para a gravação do LFP hippocampal durante o arrastamento das oscilações de theta hippocampal. (C) para a gravação da atividade celular hippocampal, uma sonda de silicone é montada sobre um microdrive. (D) os parafusos em miniatura são posicionados no crânio. Fios de cobre são presoldered para o chão e referência parafuso antes posicionando-as acima do cerebelo. (E) cimento é aplicado para cobrir e conectar os parafusos. O círculo azul superior indica onde a craniotomia foi realizada para a implantação da sonda do silicone. Círculo azul inferior indica onde a craniotomia foi realizada para a implantação da fibra óptica no hipocampo. (F), uma fibra óptica é implantada em um ângulo caudal-rostral para atingir a região CA1 hippocampal. Uma segunda fibra poderá ser implantada do septo medial se estimulação do somata célula é desejada (opcional). Sonda (G), o silicone é reduzida para apenas acima da área CA1 do hipocampo. (H) as fronteiras do microdrive e conector são cimentadas para o implante e o chão, e os fios de referência são soldados. (eu) cobre malha é construída para cercar o implante e servir como uma gaiola de Faraday. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: preparação para o arrastamento de theta hippocampal optogenetic. (A) ChR2 foi expressa em PV+ medial septais células em camundongos PV-Cre (regime superior). Fluorescência em MS (1, 2) confirma a construção bem sucedida expressão em somata. Fibras de MS project via fórnice (f) e fímbria (fi), o hipocampo (3-6); Aca: comissura anterior; parte anterior. HDB: núcleo do membro horizontal da banda diagonal; Ou: oriens estrato. A fibra óptica para a estimulação de optogenetic com a luz azul é implantada acima da camada piramidal de hippocampal área CA1 (regime inferior). Barras de escala: 500 µm (imagens 1, 3, 4) e 50 µm (imagens 2, 5, 6). (B) LFP Hippocampal durante oscilações theta espontânea (à esquerda) e 7 Hz (médio) ou arrastamento de 10 Hz optogenetic (à direita). Listras azuis indicam as janelas de tempo de aplicação de luz. Nota a fase redefinir pelo pulso de luz, indicado por uma seta. Nota gama envelopes durante theta espontânea e arrastado, de um indicador do ritmo fisiológico do theta. Fase de inversão entre o estrato oriens (Str. ou.) e estrato radiatum (Str. Ramos) também é mantido durante o arrastamento. (C) arrastamento é confiável durante ipsilaterais (parcelas superiores), bem como contralaterais (lotes menores) estimulação optogenetic. Esquemas de ilustram as posições das fibras em relação a posições de eletrodos. Vestígios LFP exemplo durante theta e a aplicação de pulsos de luz são mostrados no meio. À direita, poder espectros da LFP hippocampal durante ipsi - e estimulação contralateral, codificados por cores de acordo com a frequência de estimulação. Esta figura foi modificada da ref. 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: fidelidade de arrastamento de theta hippocampal optogenetic. (A) exemplo hippocampal LFP vestígios durante a fidelidade de arrastamento de baixa e alta. (B) potência espectrais densidades de 10 épocas de s durante o theta espontânea, com linhas ordenados de acordo com levando a frequência theta (à esquerda) e 7 Hz (médio) e estimulação de optogenetic (à direita) de 10 Hz, com linhas ordenados de acordo com a fidelidade de arrastamento. Espectros de potência exemplo respectivos (indicados por uma seta) são plotados acima. Observe a fidelidade de arrastamento confiável em épocas. À direita, é mostrada a probabilidade cumulativa de fidelidade de arrastamento para frequências theta. (C) arrastamento requer estimulação rítmica de theta. Atividade de rede hippocampal pode ser arrastada com êxito usando frequências entre 6-12 Hz. Em frequências mais baixas (por exemplo, 2 ou 4 Hz) ou maior arrastamento de frequências (por exemplo, 20 Hz) não é confiável. Esta figura foi modificada da ref. 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: manipulação paramétrica de regularidade de oscilações theta. (A) estimulação foi aplicada em diferentes frequências dentro da faixa theta com uma frequência média de 7,8 Hz seguindo uma distribuição gaussiana. O desvio-padrão dos intervalos inter pulso foi aumentado através de protocolos de σ = 3.19 a σ = 15,09. No total, 11 protocolos foram gerados e aplicados, cada um com uma duração total da época de estimulação de 1 min. Desses, a distribuição de probabilidade de 5 protocolos são mostrados à esquerda da figura. A densidade de potência espectral dentro de um intervalo de 1-14 Hz de LFP hippocampal durante a aplicação dos respectivos protocolos é plotada no meio da figura. As probabilidades dos períodos de theta durante a aplicação dos respectivos protocolos são ilustradas no lado direito. (B) a variação de mecânicas intervalos de pulso inter determinado a variação do período de theta simultâneas (r de Pearson = 0,94, p = 0,0002). (C) a relação entre a variabilidade de amplitude theta e o pulso inter intervalo (r de Pearson = 0,61, p = 0,08). Esta figura foi modificada de ref. 70. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Optogenetic arrastamento rítmico de theta determina LFP hippocampal durante comportamento. (A) frequência de estimulação Optogenetic determinado a frequência theta durante a locomoção. Daí, afferents velocidade-relacionados não impactam a frequência theta hippocampal, e como consequência, velocidade não está correlacionada com frequência theta (azul) encontra durante espontânea theta (preto). Os dados são apresentados como média ± no MEV mostrou (B) durante a vigília do silêncio, o theta hippocampal pode ser provocada na ausência de movimento. Vestígios LFP hippocampal antes e durante a bem sucedido arrastamento são mostrados acima, e traços de velocidade exemplo gravados durante o arrastamento são mostrados abaixo (o traço vermelho corresponde ao rastreamento LFP hippocampal retratado acima). Listras azuis marcam as janelas de tempo de pulsos de luz de estimulação. Esta figura foi modificada da ref. 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: atividade celular Hippocampal durante o arrastamento de theta. (A) atividade celular foi gravada usando sondas de silicone (esquema). Interneurônios único e células piramidais foram isoladas e identificadas de acordo com sua respectiva forma de onda. Mostrado aqui é a forma de onda média (média) e auto-correlogram de uma célula piramidal isolado de exemplo. (B) fase de descarga preferenciais de células piramidais (Pyr) não foi diferente durante espontânea (em preto, n = 29 neurônios) e optogenetically arrastado (em azul, n = 30) theta (p = 0,79). (C) mostrado aqui é o auto-correlogram (à esquerda) e fase de fuzilamento preferencial de um interneurônio rápido acionamento durante espontânea e optogenetically arrastado theta. Abaixo o ritmo correspondente LFP hippocampal durante espontânea (esquerda) e entranhado theta (à direita). (D) fase de descarga preferenciais dos interneurônios do rápido-fogo não foi diferente durante espontânea (em preto) e optogenetically arrastado (em azul, n = 28 neurônios) theta (p = 0,97). Auto-correlogram média é mostrado à esquerda. Células de oriens Str. auto-correlogram média (E). (F) fase de descarga preferenciais dos interneurônios de oriens Str. não foi diferente durante espontâneo (preto) e optogenetically arrastado (azul, n = 10 neurônios) theta (p = 0,56). Histogramas de descarga preferencial fases são mostradas à direita. Taxas de queima média (G) não foram afetadas pelo arrastamento de theta em células piramidais (p = 0,98), rápido-fogo interneurônios (p = 0,96) ou interneurônios de oriens Str. (p = 0,85). Esta figura foi modificada da ref. 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: combinação de theta hippocampal arrastamento e optogenetic inibição do hipocampo subcortical de saída através da LS. (A) eNpHR3.0 (halorhodopsin) foi expressa em células piramidais hippocampal (regime superior). Expressão de sucesso da construção foi confirmada por fluorescência em somata no hipocampo (imagens superiores) e axônios no LS (imagens inferiores). Fibras ópticas foram implantadas bilateralmente acima o LS (regime inferior). Barras de escala: 500 µm (imagens à esquerda), 50 µm (imagens à direita). (B) theta Hippocampal é arrastado com êxito durante a inibição do hipocampo a via de LS. Densidade espectral de poder para estimulação de luz azul 9 Hz durante a inibição de saída são aqui mostrados. (C) inibição da via de saída subcortical hippocampal principais impede os efeitos de arrastamento de theta hippocampal na velocidade. Aqui mostrado é a diminuição na variabilidade de velocidade em cima de arrastamento de optogenetic (branco barra com fronteiras azuis), com está ausente mediante inibição simultânea do hipocampo a via LS (barra amarela com bordas azuis). Velocidade de base média respectivos é mostrada à esquerda. Esta figura foi modificada da ref. 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aqui apresentamos uma metodologia amplamente acessível para arrastar e provocar oscilações theta hippocampal no comportamento animal. Essa abordagem pode ser útil para estudos de funções do ritmo theta no processamento de informações e comportamento. Aspectos críticos deste método incluem: (1) a escolha do opsin e direcionamento de ChR2 de axônios de MS em células do hipocampo, (2) robustas características ópticas e elétricas dos assemblies de matriz fios fibra óptica implantados para garantir estimulação contínua e LFP gravação em comportar-se ratos, (3) aplicação de uma quantidade ideal de luz em frequências theta, (4) post hoc quantificação de fidelidade o arrastamento e (5) controle de artefatos de optoelectrical.

A principal ressalva do primeiro ponto é uma injeção de vírus seguro poupando o plexo venoso localizado medialmente. Suboptimal execução cirúrgica desta etapa pode diminuir a taxa de sucesso de injeções e potencialmente adiar a aquisição dos resultados. Cinética de uma opsina deve ser considerada, ChR2 (tempo de ativação: 2 ms, o tempo de inativação: 9 ms65). O segundo ponto exige controle da fidelidade da transmissão de luz e uma impedância de eléctrodos antes da implantação de gravação e geralmente se beneficia oportuna fabricação de implantes adicionais.

A terceira consideração é comum para optogenetics visando manipulações de circuito em grande escala e envolve a fontes de luz e interconexões ópticas, que entregam via uma potência de luz de fibra 100 µm no cérebro de 5 a 15 mW. Para cada rato e antes de cada gravação, uma gravação de teste pode ser realizada para definir a saída de luz para a intensidade ideal para o experimento. A saída de luz deve ser alta o suficiente para ativar um número suficiente de projeções para permitir confiável arrastamento das oscilações de theta, mas não muito alto, para evitar respostas termicamente evocados e dano tecidual.

O adiante aspecto considera que a sincronização dos dados LFP, alcançados com a mais alta precisão, por amostragem, ambos os tipos de dados através do conversor AD mesmo e pulsos de luz. Selos de tempo sincronizado são particularmente necessários para outras aplicações potenciais visando estudos de descarga neuronal e LFP. Eficácia de arrastamento pode variar entre e dentro de épocas de estimulação; Isto provavelmente ocorre devido a interferência de ritmicidade definida pela estimulação optogenetic com sinais conduzidos intrínseca e / ou sensoriais, devido a vários geradores de ritmo theta16,,66,67, 68. quantificação da fidelidade instantânea deste de manipulação altamente dinâmico optogenetic69 , portanto, é extremamente útil para inferência causal, ou seja, para revelar a relação entre a magnitude do efeito (por exemplo, , mudança de comportamento) e a eficácia momentânea do optogenetic controle de aspectos de sincronização selecionada. Importante, os vários parâmetros de oscilação podem ser influenciados por estimulação optogenetic, por exemplo, arrastamento Medeia não só bloqueio de frequência, mas também uma amplitude mais regular de theta oscilações11.

Em quinto lugar, a estimulação optogenetic é frequentemente associada com optoelectrical artefatos, evocados em eletrodos de metal pelo efeito photoelectrochemical. Seu grau depende do material de eletrodo, proximidade da ponta do eletrodo para a fibra óptica e o poder de luz. Nos experimentos descritos aqui, optoelectrical artefatos podem ser evitados, aumentando a distância entre a fibra e o eléctrodo de gravação, feche posicionamento de que não é essencial para o monitoramento de oscilação de theta. Optoelectrical artefatos exibem de forma consistente no tempo e entre canais e, portanto, durante o pico de classificação eles normalmente são agrupados em um cluster distinto e não se sobrepõem com neurônios gravado70. Ao mesmo tempo, uma pequena fração dos potenciais de ação, formas de onda das quais são alteradas por artefatos, não são agrupados por algoritmos de classificação com outros picos ateado fogo em um neurônio. Laminares perfis LFP obtidos usando várias configurações do eléctrodo, incluindo matrizes de arame (Figura 2B) e sondas de silicone linear, permitem uma diferenciação clara de artefatos e verdadeiros padrões LFP, baseados em fase constante da antiga e deslocamentos de fase laminar fisiológicas deste último. Gravações de base antes da estimulação permitem a exploração dos recursos de theta característicos como perfis típica fase laminar.

Optogenetic controle de oscilações de theta leva arrastamento de theta em todas as camadas da camada de CA1 do hipocampo e até mesmo arrastamento contralateral. Isto deve ser tomado em conta se um experimento visa uma estimulação local (se os efeitos de uma estimulação de uma sub-região confinada ou uma subpopulação destinam-se a ser estudado). Por outro lado, a estimulação espacialmente limitada de hippocampal projeções das células PV MS+ apresentadas aqui permite uma manipulação menos determinista de oscilações de theta, ou seja, arrastamento, do que faz a estimulação somática optogenetic de Células de MS PV+ recentemente aplicadas em camundongos anestesiado71. A último estimulação somática consistentemente resulta em frequências de oscilação hippocampal até 40 Hz e, portanto, representa o caso de uma estimulação rítmica altamente confiável. Em contraste, a estimulação axonal apresentada aqui é eficaz preferencialmente na faixa de frequência theta (Figura 3) e, portanto, é mais parecida com o arrastamento, possivelmente através do Kuramoto transição72, ou seja, trabalhando em frequências de perto os presentes às oscilações de theta espontânea de início da estimulação.

Enquanto a preparação de optogenetic descrita aqui permite a manipulação de características de oscilação theta, optogenetic somática inibição dos neurônios inibitórios MS foram aplicadas para inibição eficiente das oscilações de theta durante o sono REM73. Integração das duas técnicas usando optogenetic atuadores para controle oposta da excitabilidade neuronal (e.g., 12) potencialmente pode habilitar o controle bidirecional do ritmo theta no mesmo animal para estudos adicionais de causal conexões entre oscilações de rede e vários aspectos do comportamento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Maria Gorbati para ajuda especializada com análise de dados e Jennifer Kupferman para comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; NeuroCure exc 257, TK e AP; Programa prioritário 1665, 1799/1-1(2), programa de Heisenberg, 1799/2-1, AP), a Fundação alemã-israelense de pesquisa científica e desenvolvimento (GIF; Eu-1326-421.13/2015, TK) e o programa de ciência de fronteira humana (HFSP; RGY0076/2012, TK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PV-Cre mice The Jackson Laboratory B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotaxis David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA Model 963 Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument
Drill bits, 0.8 mm Bijoutil, Allschwil, Switzerland 49080HM
0.01-1 ml syringe Braun, Melsungen, Germany 9161406V
Sterican cannulas Braun 26 G, 0.45x25 mm BL/LB
Fine and sharp scissors Fine Science Tools Inc., Vancouver, Canada 14060-09
Forceps Fine Science Tools Inc. 11210-10 Dumont AA - Epoxy Coated Forceps
Blunt stainless steel scissors Fine Science Tools Inc. 14018-14
Soldering station Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany WSD 81
Erythromycin Rotexmedica GmbH, Trittau, Germany PZN: 10823932 1g Powder for Solution for Infusion
Name Company Catalog Number Comments
Optogenetics
Hamilton pump PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA model 703008 PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism
Hamilton 5 µL Syringe, 26 gauge PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Hamilton 5 µL Plunger PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Tubing Fisher Scientific, Pittsburgh, USA PE 20 Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043")
Sterican cannulas Braun, Melsungen, Germany 27 G, 25x0.40 mm, blunt
Precision drill/grinder Proxxon, Wecker, Luxemburg fbs 240/e
Cutting disks Proxxon NO 28812
Cre dependent channelrhodopsin Penn Vector Core, Philadelphia, PA, USA AV-1-18917P Contruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42x1013 vg/ml
Cam kinase dependent halorhodopsin Penn Vector Core AV-1-26971P Construct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml
Multimode optic fiber ThorLabs, Dachau, Germany FG105LCA 0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 - 2400 nm
Ceramic stick ferrule Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA CFLC126 Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um
Polishing paper Thorlabs LF3D 6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet
Power meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD
Multimode fiber optic coupler Thorlabs FCMM50-50A-FC 1x2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC
Fiberoptic patch cord Thorlabs FG105LCA CUSTOM-MUC custom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule
Sleeve Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA ADAL1 Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules
473 nm DPSS laser Laserglow Technologies, Toronto, ON, Canada R471005FX LRS-0473 Series
593 nm DPSS laser Laserglow Technologies R591005FX LRS-0594 Series
MC_Stimulus II Multichannel Systems, Reutlingen, Germany STG 4004
Impedance conditioning module Neural microTargeting worldwide, Bowdoin, USA ICM
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology
Tungsten wires California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USA CFW0010954 40 µm, 99.95%
Capillary tubing Optronics 1068150020 ID: 100.4 µm
Omnetics nanoconnector Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, USA A79038-001
Screws Bilaney, Düsseldorf, Germany 00-96x1/16 stainless-steel
Silicone probe NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USA B32
Headstage Neuralynx, Bozeman, Montana USA HS-8 miniature headstage unity gain preamplifiers
Silver conductive paint Conrad electronics, Germany 530042
Liquid flux Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Germany Lötöl ST DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)
LED Neuralynx HS-LED-Red-omni-10V
Name Company Catalog Number Comments
Software
MATLAB Mathworks, Natick, MA, USA
MC_Stimulus software Multichannel, Systems
Neurophysiological Data Manager NDManager, http://neurosuite.sourceforge.net
Klusters http://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006
Software of the recording system Neuralynx Cheetah https://neuralynx.com/software/cheetah
Multi-channel data analysis software Cambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GB Spike2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salinas, E., Sejnowski, T. J. Correlated neuronal activity and the flow of neural information. Nat Rev Neurosci. 2 (8), 539-550 (2001).
  2. Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
  3. Cannon, J., et al. Neurosystems: brain rhythms and cognitive processing. Eur J Neurosci. 39 (5), 705-719 (2014).
  4. Fries, P. Neuronal gamma-band synchronization as a fundamental process in cortical computation. Annu Rev Neurosci. 32, 209-224 (2009).
  5. Cardin, J. A., et al. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459 (7247), 663-667 (2009).
  6. Colgin, L. L., et al. Frequency of gamma oscillations routes flow of information in the hippocampus. Nature. 462 (7271), 353-357 (2009).
  7. Csicsvari, J., Jamieson, B., Wise, K. D., Buzsaki, G. Mechanisms of gamma oscillations in the hippocampus of the behaving rat. Neuron. 37 (2), 311-322 (2003).
  8. Gray, C. M., Singer, W. Stimulus-specific neuronal oscillations in orientation columns of cat visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (5), 1698-1702 (1989).
  9. Lisman, J. E., Jensen, O. The theta-gamma neural code. Neuron. 77 (6), 1002-1016 (2013).
  10. Sirota, A., et al. Entrainment of neocortical neurons and gamma oscillations by the hippocampal theta rhythm. Neuron. 60 (4), 683-697 (2008).
  11. Bender, F., et al. Theta oscillations regulate the speed of locomotion via a hippocampus to lateral septum pathway. Nat Commun. 6, 8521 (2015).
  12. Carus-Cadavieco, M., et al. Gamma oscillations organize top-down signalling to hypothalamus and enable food seeking. Nature. 542 (7640), 232-236 (2017).
  13. Bragin, A., Engel, J., Wilson, C. L., Fried, I., Buzsaki, G. High-frequency oscillations in human brain. Hippocampus. 9 (2), 137-142 (1999).
  14. Wang, J., et al. High-frequency oscillations in Parkinson's disease: spatial distribution and clinical relevance. Mov Disord. 29 (10), 1265-1272 (2014).
  15. Hammond, C., Bergman, H., Brown, P. Pathological synchronization in Parkinson's disease: networks, models and treatments. Trends Neurosci. 30 (7), 357-364 (2007).
  16. Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron. 33 (3), 325-340 (2002).
  17. Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
  18. Buhl, E. H., et al. Physiological properties of anatomically identified axo-axonic cells in the rat hippocampus. J Neurophysiol. 71 (4), 1289-1307 (1994).
  19. Wulff, P., et al. Hippocampal theta rhythm and its coupling with gamma oscillations require fast inhibition onto parvalbumin-positive interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3561-3566 (2009).
  20. Korotkova, T., Fuchs, E. C., Ponomarenko, A., von Engelhardt, J., Monyer, H. NMDA receptor ablation on parvalbumin-positive interneurons impairs hippocampal synchrony, spatial representations, and working memory. Neuron. 68 (3), 557-569 (2010).
  21. Buhl, D. L., Harris, K. D., Hormuzdi, S. G., Monyer, H., Buzsaki, G. Selective impairment of hippocampal gamma oscillations in connexin-36 knock-out mouse in vivo. J Neurosci. 23 (3), 1013-1018 (2003).
  22. Racz, A., Ponomarenko, A. A., Fuchs, E. C., Monyer, H. Augmented hippocampal ripple oscillations in mice with reduced fast excitation onto parvalbumin-positive cells. J Neurosci. 29 (8), 2563-2568 (2009).
  23. Contreras, D., Steriade, M. Cellular basis of EEG slow rhythms: a study of dynamic corticothalamic relationships. J Neurosci. 15 (1 Pt 2), 604-622 (1995).
  24. Herrera, C. G., et al. Hypothalamic feedforward inhibition of thalamocortical network controls arousal and consciousness. Nat Neurosci. 19 (2), 290-298 (2016).
  25. Freund, T. F., Antal, M. GABA-containing neurons in the septum control inhibitory interneurons in the hippocampus. Nature. 336 (6195), 170-173 (1988).
  26. Unal, G., Joshi, A., Viney, T. J., Kis, V., Somogyi, P. Synaptic Targets of Medial Septal Projections in the Hippocampus and Extrahippocampal Cortices of the Mouse. J Neurosci. 35 (48), 15812-15826 (2015).
  27. Hangya, B., Borhegyi, Z., Szilagyi, N., Freund, T. F., Varga, V. GABAergic neurons of the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci. 29 (25), 8094-8102 (2009).
  28. Bartho, P., et al. Ongoing network state controls the length of sleep spindles via inhibitory activity. Neuron. 82 (6), 1367-1379 (2014).
  29. Giocomo, L. M., et al. Grid cells use HCN1 channels for spatial scaling. Cell. 147 (5), 1159-1170 (2011).
  30. Stark, E., et al. Inhibition-induced theta resonance in cortical circuits. Neuron. 80 (5), 1263-1276 (2013).
  31. Crandall, S. R., Cruikshank, S. J., Connors, B. W. A corticothalamic switch: controlling the thalamus with dynamic synapses. Neuron. 86 (3), 768-782 (2015).
  32. Steriade, M., McCormick, D. A., Sejnowski, T. J. Thalamocortical oscillations in the sleeping and aroused brain. Science. 262 (5134), 679-685 (1993).
  33. Joshi, A., Salib, M., Viney, T. J., Dupret, D., Somogyi, P. Behavior-Dependent Activity and Synaptic Organization of Septo-hippocampal GABAergic Neurons Selectively Targeting the Hippocampal CA3 Area. Neuron. , (2017).
  34. Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. J Neurosci. 34 (34), 11385-11398 (2014).
  35. Craig, M. T., McBain, C. J. Fast gamma oscillations are generated intrinsically in CA1 without the involvement of fast-spiking basket cells. J Neurosci. 35 (8), 3616-3624 (2015).
  36. Pastoll, H., Solanka, L., van Rossum, M. C., Nolan, M. F. Feedback inhibition enables theta-nested gamma oscillations and grid firing fields. Neuron. 77 (1), 141-154 (2013).
  37. Akam, T., Oren, I., Mantoan, L., Ferenczi, E., Kullmann, D. M. Oscillatory dynamics in the hippocampus support dentate gyrus-CA3 coupling. Nat Neurosci. 15 (5), 763-768 (2012).
  38. Mattis, J., et al. Frequency-dependent, cell type-divergent signaling in the hippocamposeptal projection. J Neurosci. 34 (35), 11769-11780 (2014).
  39. Vandecasteele, M., et al. Optogenetic activation of septal cholinergic neurons suppresses sharp wave ripples and enhances theta oscillations in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13535-13540 (2014).
  40. Stark, E., et al. Pyramidal cell-interneuron interactions underlie hippocampal ripple oscillations. Neuron. 83 (2), 467-480 (2014).
  41. Blumberg, B. J., et al. Efficacy of nonselective optogenetic control of the medial septum over hippocampal oscillations: the influence of speed and implications for cognitive enhancement. Physiol Rep. 4 (23), (2016).
  42. Courtin, J., et al. Prefrontal parvalbumin interneurons shape neuronal activity to drive fear expression. Nature. 505 (7481), 92-96 (2014).
  43. Nagode, D. A., Tang, A. H., Yang, K., Alger, B. E. Optogenetic identification of an intrinsic cholinergically driven inhibitory oscillator sensitive to cannabinoids and opioids in hippocampal CA1. J Physiol. 592 (1), 103-123 (2014).
  44. Bitzenhofer, S. H., et al. Layer-specific optogenetic activation of pyramidal neurons causes beta-gamma entrainment of neonatal networks. Nat Commun. 8, 14563 (2017).
  45. Kondabolu, K., et al. Striatal cholinergic interneurons generate beta and gamma oscillations in the corticostriatal circuit and produce motor deficits. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), E3159-E3168 (2016).
  46. Sohal, V. S., Zhang, F., Yizhar, O., Deisseroth, K. Parvalbumin neurons and gamma rhythms enhance cortical circuit performance. Nature. 459 (7247), 698-702 (2009).
  47. Pina-Crespo, J. C., et al. High-frequency hippocampal oscillations activated by optogenetic stimulation of transplanted human ESC-derived neurons. J Neurosci. 32 (45), 15837-15842 (2012).
  48. Iaccarino, H. F., et al. Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia. Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).
  49. Kim, H., Ahrlund-Richter, S., Wang, X., Deisseroth, K., Carlen, M. Prefrontal Parvalbumin Neurons in Control of Attention. Cell. 164 (1-2), 208-218 (2016).
  50. Lu, Y., et al. Optogenetically induced spatiotemporal gamma oscillations and neuronal spiking activity in primate motor cortex. J Neurophysiol. 113 (10), 3574-3587 (2015).
  51. Kim, T., et al. Cortically projecting basal forebrain parvalbumin neurons regulate cortical gamma band oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3535-3540 (2015).
  52. Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. Gamma-range synchronization of fast-spiking interneurons can enhance detection of tactile stimuli. Nat Neurosci. 17 (10), 1371-1379 (2014).
  53. Gan, J., Weng, S. M., Pernia-Andrade, A. J., Csicsvari, J., Jonas, P. Phase-Locked Inhibition, but Not Excitation, Underlies Hippocampal Ripple Oscillations in Awake Mice In. Neuron. 93 (2), 308-314 (2017).
  54. van de Ven, G. M., Trouche, S., McNamara, C. G., Allen, K., Dupret, D. Hippocampal Offline Reactivation Consolidates Recently Formed Cell Assembly Patterns during Sharp Wave-Ripples. Neuron. 92 (5), 968-974 (2016).
  55. Kim, A., et al. Optogenetically induced sleep spindle rhythms alter sleep architectures in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20673-20678 (2012).
  56. Latchoumane, C. V., Ngo, H. V., Born, J., Shin, H. S. Thalamic Spindles Promote Memory Formation during Sleep through Triple Phase-Locking of Cortical, Thalamic, and Hippocampal Rhythms. Neuron. 95 (2), 424-435 (2017).
  57. Robinson, J., et al. Optogenetic Activation of Septal Glutamatergic Neurons Drive Hippocampal Theta Rhythms. J Neurosci. 36 (10), 3016-3023 (2016).
  58. Fuhrmann, F., et al. Locomotion, Theta Oscillations, and the Speed-Correlated Firing of Hippocampal Neurons Are Controlled by a Medial Septal Glutamatergic Circuit. Neuron. 86 (5), 1253-1264 (2015).
  59. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159 (2005).
  60. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
  61. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  62. Buzsaki, G., et al. Multisite recording of brain field potentials and unit activity in freely moving rats. J Neurosci Methods. 28 (3), 209-217 (1989).
  63. Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
  64. Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
  65. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  66. Korotkova, T., et al. Reconciling the different faces of hippocampal theta: The role of theta oscillations in cognitive, emotional and innate behaviors. Neurosci Biobehav Rev. , (2017).
  67. Vertes, R. P., Hoover, W. B., Viana Di Prisco, G. Theta rhythm of the hippocampus: subcortical control and functional significance. Behav Cogn Neurosci Rev. 3 (3), 173-200 (2004).
  68. Hasselmo, M. E., Hay, J., Ilyn, M., Gorchetchnikov, A. Neuromodulation, theta rhythm and rat spatial navigation. Neural Netw. 15 (4-6), 689-707 (2002).
  69. Witt, A., et al. Controlling the oscillation phase through precisely timed closed-loop optogenetic stimulation: a computational study. Front Neural Circuits. 7, 49 (2013).
  70. Korotkova, T., Ponomarenko, A. In Vivo Neuropharmacology and Neurophysiology. , Springer Science. Series Neuromethods (2017).
  71. Dannenberg, H., et al. Synergy of direct and indirect cholinergic septo-hippocampal pathways coordinates firing in hippocampal networks. J Neurosci. 35 (22), 8394-8410 (2015).
  72. Pikovsky, A., Rosenblum, M., Kurths, J. Synchronization: A universal concept in nonlinear sciences. 70, American Journal of Physics. (2002).
  73. Boyce, R., Glasgow, S. D., Williams, S., Adamantidis, A. Causal evidence for the role of REM sleep theta rhythm in contextual memory consolidation. Science. 352 (6287), 812-816 (2016).

Tags

Neurociência edição 136 Optogenetics gravações eletrofisiológicas na vivo comportamento theta oscilação hipocampo células piramidais interneurônios septo locomoção farmacogenética
Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bender, F., Korotkova, T.,… More

Bender, F., Korotkova, T., Ponomarenko, A. Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice. J. Vis. Exp. (136), e57349, doi:10.3791/57349 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter