Summary
여기는 청각 및 vestibular 함수에 최소 손상 반원의 운하를 통해 성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 로컬 약물 전달 수 있는 canalostomy 절차에 설명 합니다. 이 메서드는 마우스 내가 바이러스 성 벡터, 제약, 그리고 작은 분자를 접종을 사용할 수 있습니다.
Abstract
내가 치료 약물의 로컬 배달 내가 질병에 대 한 유망한 요법입니다. 사출 반원의 운하 (canalostomy)를 통해 내가 지역 약물 전달에 대 한 유용한 접근 될 표시 되었습니다. 이 문서의 목표는 설명, 세부 사항, 성인 및 신생아 쥐에 있는 canalostomy에 관련 된 수술 기법입니다. 빠른 녹색 염료 및 adeno 관련 바이러스 serotype 8 녹색 형광 단백질 유전자에 의해 표시 된,는 canalostomy vestibular 끝-기관 청력에 최소한의 손상으로 달팽이 관에 삽입 된 시 약의 광범위 한 배포를 촉진 하 고 vestibular 기능입니다. 수술은 성인과 신생아 쥐;에서 성공적으로 구현 실제로, 다 수 수술 필요한 경우 수행할 수 수 있습니다. 끝으로, canalostomy 성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 약물 전달에 효과적이 고 안전한 방법 이며 미래에 인간의 내가 질병을 치료 하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
감각 청력 손실 및 영향을 vestibular 부전 환자와의 밀접 하 게 연관 된 내가 장애. 내가 치료 약물의 배달 내가 질환의 치료에 대 한 약속을 보여줍니다. 조직 또는 로컬 접근 내가 약물을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다. 일부 내가 질병 idiopathic 갑자기 청력 상실, 일반적으로 전신 스테로이드1처리 등 조직의 약국 성공적으로 처리 됩니다. 또한, Lentz 외. 센스 oligonucleotide의 체계적 관리는 난청을 개선 하 고 Ush1c 돌연변이 마우스 모델2에서 기능을 균형 있게 보여주었다. 그러나, 내가 질환의 많은 부분이 처리 되지 않습니다 효과적으로 조직의 의약품 안전 청에 의해 내가3,4에 마약 사용을 제한 하는 혈액-미로 장벽 때문에. 반면, 지역 마약 배달 전략 내가 장애를 보다 효율적으로 처리할 수 있습니다. 사실, 내가 잠재적으로 로컬 약물 전달;에 대 한 이상적인 목표 한 사이트 유포 또는 주입 후 약의 보급을 용이 하 게, 유체로 가득 그리고 인접 장기에서 상대적으로 고립 된 부작용5,6제한.
지역 마약 배달 전략 intratympanic 및 intralabyrinthine 메서드가 포함 됩니다. Intratympanic 루트의 효과 크게 둥근 창 막 (RWM)와 RWM3,4,,78에 약물의 체류 시간을 통해 마약 침투성에 의존합니다. 따라서, 약물 이나는 RWM 뚫을 수 없는 시 약의 납품에 대 한 적당 하다. Intralabyrinthine 메서드는 약물의 높은 복용량에 광범위 하 게 배포 결과 내가 직접 접종을 포함 한다. 그러나, intralabyrinthine 방법 섬세 한 수술을 요구 하 고 침략 적, 선도 내가 기능을 손상 하는. 현재, 인간9에 사용 하기 위해 충분히 안전한 것으로 증명 되지 않았습니다 intralabyrinthine 주입 약물의 동물 연구에만 사용 됩니다. 따라서, 수술 절차를 단순화 해야 합니다, 그리고 상해의 위험 감소 병원에 intralabyrinthine 접근을 번역 하.
몇몇 intralabyrinthine 접근 RWM5,,1011 와 스칼라 미디어12,,1314, scala tympani에 주입 하 여 동물에 부과 하 고 있다 15 , 16, 스칼라 현관17, 반원의 운하16,18,,1920그리고21endolymphatic sac. 방법 마다 장단점6. 납품은 RWM 통해 신생아 쥐5,22에 atraumatic입니다. 그러나, 가벼운 난청 RWM 주입23, 수술24후 중이 토로 인해 가능성이 후 성인 쥐에서 관찰 됩니다. 대상 최종 기관12,14, 에서 높은 시 약 농도 달성 하는 스칼라 미디어 주입, 직접 우주로 endolymphatic 감각 상피를 포함 하는 시 약의 주입을 포함 한다, 25 , 그러나 26.,이 이렇게 복잡 한 절차를 요구 한다 고 심리 임계값의 상당한 상승 산 후 날 5 (P5) 보다 수행 하는 경우25,27, 그것의 응용 프로그램을 제한.
위에서 언급 한 intralabyrinthine 방식에 비해, canalostomy 특히 성인 쥐16,18,,2829,30에서 내가 최소한의 손상을 일으키는합니다 보호 효과 및 변환 측면의 평가 대 한 중요 한. 또한, 설치류, 반원의 운하 넘어 물집, 수술 절차를 용이 하 게 하 고 수술 하는 동안 중이 장애를 피할 수 있습니다. 클리닉, 반원의 운하 수술 다루기 힘든 양성 발작의 자세 현기증31,,3233, canalostomy의 임상 타당성을 제안에 대 한 사용 됩니다. 이후 처음가 모토 외설명. 16 , 2001 년에 canalostomy murine 내가18,,1928,29로 바이러스 성 벡터, siRNA, 줄기 세포, aminoglycoside, 등 다양 한 시 약을 제공 하는 데 사용 되었습니다. ,,3435,,3637. Canalostomy에 의해 adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 접종 가능 감각 상피에 외 인 유전자의 overexpression 달팽이 관 및 vestibular 끝-장기18,28, 의 기본 신경 29,30. Canalostomy에 의해 유전자 치료를 whirlin 균형 기능을 복원 하 고 인간의 안내인 증후군19, 그 canalostomy 유전자 cochleovestibular 질병에 대 한 유전자 치료의 연구에 대 한 유용한 제안 마우스 모델에서 청력을 향상 시킵니다. Canalostomy에 의해 중간 엽 줄기 세포의 이식 결과 인공 fibrocytes와 급성 감각 청각 손실35의 쥐 모델에서 청력 회복의 개편. 또한, canalostomy aminoglycosides vestibular 병 변18,,3438, 확립 하 내가 사용할 수 있습니다. 그리고18 필요한 경우 여러 주사를 수행할 수 있습니다. , 34.
현재 문서에서 우리, 자세히 설명, 성인 및 신생아 쥐에 canalostomy 기술. 우리 canalostomy 후 즉각적이 고 장기 결과 평가 하기 위해 마우스 내가 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자 (AAV8-GFP)와 스, 빠른 녹색 염료 및 AAV serotype 8 (AAV8)를 포함 하 여 다양 한 시 약을 주사.
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Protocol
모든 절차와 동물 수술 동물 관리 및 사용 위원회 중국의 자본 의료 대학의의 지침에 따라 실시 했다.
1. 장치 준비
- 주입 정 (그림 1A)을 하려면 폴 리 이미 드 튜브를 연결 (내부 직경 114.3 µ m, 외경 139.7 µ m, 길이 3 cm) 폴 리 에틸렌 튜브를 (내부 직경 280 μ m, 외경 640 µ m, 길이 40 cm). Superglue를 사용 하 여 적어도 3 개의 응용 프로그램과 함께 연결 인감. 에틸렌 산화물과 주입 정 소독.
참고: 배관 밀봉 할 경우는 정 맥의 방해 귀 착될 수 있다 폴 리 이미 드 튜브에 들어가기에서 superglue를 방지 합니다. 가스 살 균 연결에서 누설 될 수 있습니다 때문에 적어도 세 번에 튜브를 봉인. - 30g 바늘을 사용 하 여, 정상적인 염 분을 포함 하는 1 cc 주사기를 폴 리 에틸렌 튜브의 끝을 연결 합니다. 어떤 누설 또는 폴 리 이미 드 튜브와 폴 리 에틸렌 튜브 사이의 연결에 막힘 확인 1 cc 주사기로 주입 하 여 일반적인 염 분으로는 정을 채우십시오.
참고: 지금까지 누설 또는 연결의 막힌 경우에은 정 다음 절차에서 사용할 수 없습니다. - 일반적인 염 분으로 10 µ L 마이크로 주사기를 철수 하 고 주입 정와 상기 30 G 바늘에 연결. Microinjection 펌프 (그림 1B)에 마이크로 주사기를 설치 합니다. 0.5 µ L/min를 주입 속도 빠른 녹색 염료 및 AAV8-GFP, 1 µ L 볼륨 또는 2 µ L 스에 대 한 설정 합니다.
참고: 사출 속도의 권장된 범위는 0.1−0.5 µ L/min, 그리고 주입 볼륨의 권장된 범위는 0.5−2 µ L. - 1 µ L를 마이크로 주사기를 철수 하 고 주입 시 약을 추출 합니다. 일반적인 염 분 및 주입된 시 약 (그림 1C) 사이에 어 갭 형성할 것 이다.
- 필요한 경우 마커 펜을 사용 하 여 폴 리 에틸렌 배관에 가스-액체 테두리의 위치를 레이블을 지정 합니다. 이 주입 중 시 약 흐름을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다.
2입니다. 성인 쥐에 Canalostomy
- 성인 마우스 anesthetize (여성, FVB/N, 5에 6 주 된) 케 타 민 HCl (120 mg/kg)의 복 주입 및 xylazine HCl (7 mg/kg). 동물 전시 고통 스러운 자극 (발가락 핀치 반사)에 대 한 응답이 될 때까지 5−10 분을 기다립니다. 마 취 후 따뜻한 전기 패드에 동물을 놓습니다. 진통제, Meloxicam (1 mg/kg), 수술 전에 피하 적용 되었습니다.
- 동물의 눈 눈 연 고와 커버. 전기 동물 깎기로 왼쪽된 후 귀의 영역을 면도 하 고 세 번 75% 에탄올과 피부를 소독.
- 데워 전기 패드에 동물을 놓습니다. ~ 37 ° c.에 전기 패드의 온도 설정 왼쪽된 귀에 수술을 용이 하 게 하는 오른쪽 측면 위치에 동물을 배치 합니다.
- 1-1.5 cm 후 귀의 절 개 ~ 3mm 왼쪽된 retroauricular 홈 (그림 2A)에서 확인 합니다.
- 후부 반원의 운하 (PSC)와 측면 반원형 운하 (LSC) 위치: pinna (굵게 도트 그림2b에서)의 루트 3 9 시로 기원과는 calvarium에 평행한 평면으로 정의 됩니다, PSC와는 LSC는 일반적으로 3 m m 2와 3 시 (그림 2B) 사이의 pinna의 루트에서에 위치 해 있습니다.
- 퉁 명 스럽게 근육 측 뼈 PSC 및 LSC, 누구의 여백은 측 뼈 (그림 2C)에 어두운 줄무늬도 명확 하 게 보이는 노출 마이크로 포 셉와 함께 취재를 해 부. LSC에는 한 약 30 °, calvarium에 평행한 평면에서 각도 PSC는 LSC (그림 2C)에 수직. 마이크로-집게와 근육의 작은 조각을 수집 하 고 말리 면. 다음 단계에서이 근육 구멍을 밀봉 하기 위하여 사용 됩니다.
참고: 과도 한 근육에 상해를 최소화 하기 위해 조직의 찢 어 하지 마십시오. PSC (그림 2D) 노출 때 인접 한 배를 손상 하지 마십시오. - 26 G 바늘 (그림 2D)를 사용 하 여 PSC의 중간 부분에 작은 구멍을 확인 합니다. 구멍을 통해 유체 누설 PSC의 뼈 벽의 성공적인 침투를 나타냅니다. 적절 한 크기로, 폴 리 이미 드 튜브의 직경 보다 약간 큰 구멍을 확대.
참고: 드릴 구멍을 부드럽게 하 고 점차적으로 확대 및 PSC의 파괴를 피하기 위해. - 코 튼 펠 렛을 사용 하 여 PSC의 구멍을 둘러싼 유출 청소.
- 1−2 m m (그림 2E)의 깊이에 cru 코뮌으로 PSC에 폴 리 이미 드 튜브의 끝을 부드럽게 삽입 합니다. 주입 펌프에 '실행' 버튼을 눌러 시작 합니다.
- 주입, 후 확산 시 있도록 ~ 2 분 기다립니다. 2.6 마이크로 위 단계에서 수집 된 근육의 작은 조각을 잘라. 다음, 주입 정 맥을 제거 하 고 즉시 PSC에 있는 구멍에 근육을 배치.
참고: 새는 구멍에서 구멍 완전히 밀폐 되도록 연결 후 모든 액체에 대 한 확인 하십시오. - 분리 된 근육과 피하 조직 반환. 5-0 봉합 사를 사용 하 여 절 개 봉합 절 개 지역 povidone 요오드 소독.
참고: 위의 모든 수술 절차는 약 25 분 소요. - 위치는 전기 패드에 동물 ~ 37 ° c.에 preheated 복구에 대 한 오른쪽 측면 위치에 동물을 배치 합니다.
- 청각 brainstem 응답 (ABR) 측정을 수행 하 고 테스트 1 주일 후 수술18수영.
- 필요한 경우, PSC 또는 LSC의 다른 영역에 반복된 주사를 수행 합니다.
3입니다. 신생아 쥐에 Canalostomy
- 저체온증을 사용 하 여 유도 하 고 출생 후 일 2 1 (P1-2) 신생아 쥐 (FVB/N)에 진정을 유지. ~ 4 분 동안 얼음의 플라스틱 랩 덮여 침대에 강아지를 두십시오. 다음, 얼음 가득 플랫폼에 강아지를 하다. 75% 에탄올과 세 번 수술 필드를 소독.
참고: 강아지의 머리는 얼음에서 인지 확인 합니다. 얼음 가득한 플랫폼에 강아지와 함께 전체 수술을 수행 합니다. - 다음 단계는 성인 쥐에 비해 신생아에서 다르다.
- ~ 2 m m에서 ~ 3mm-postauricular 절 개 부위 주름에 후부 확인 (그림 3A -B).
- 부드럽게 26 G 바늘을 사용 하 여 부드러운 PSC에 개방을 확인 합니다. 개방을 확대 하지 않고 PSC는 캐 뉼 러 삽입 (그림 3C -E).
- 주입 후 근육의 조각을 사용 하 여 보다는 커버, 플러그, 오프닝으로 후자는 부드러운 PSC (그림 3 층)의 골절으로 이어질 수 있습니다.
- 6-0 봉합 사를 사용 하 여 피부를 닫습니다.
- ABR 측정을 수행 하 고 테스트 P3030에서 수영.
- 부모의 인 육은 신생아 수술 후 일반적인 문제 이다. 다음 단계는 부모의 식인 풍습의 가능성을 줄일 수 있습니다.
- 혈액 알코올 잎사귀 절 개 수술 후 주변 정리.
- 확인을 반환 하기 전에 신생아가 자유롭게 이동할 수 있습니다.
- 어머니의 감 금 소, 장소 쓰레기 가운데 다시는 신생아에서 더럽혀진된 침구와 신생아를 얼룩.
- 수술 하지 않는 어떤 유사한 postauricular 절 개 및 봉합을 받아야 한다.
- 사육 장에서 남성을 구분 합니다.
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Representative Results
빠른 녹색 염료는 내가 있는 그것의 즉각적인 배포를 평가 하는 성인 및 신생아 쥐의 PSC에 주입 했다. 염료 (그림 4) 수술 후 바로 달팽이 관, 현관, 반원의 운하에 걸쳐 발견 되었다.
안전 및 내가 유전자 납품에 대 한 canalostomy의 효율성 평가, AAV8 GFP 성인 및 신생아 쥐의 내가 주입 했다. 모든 동물 전시 정상 ABR 임계값 및 AAV8 GFP 주입18,30후 시험 점수를 수영. Immunohistology 청각 감각 상피, 내부 세포 (IHCs)와 몇 가지 외부 머리 세포 (OHCs) 강력한 GFP 식30보였다 기저 회전의에서, 밝혔다. Vestibular 감각 상피에서 GFP 식 utricle, saccule, 및 ampullae30에서 발견 되었다. Vestibular 세포 (그림 5) 및 지원 세포 고효율18,30으로 불리고 있었다.
Canalostomy에 의해 스의 주입 utricle18,,3438에 심각한 머리 세포 손실을 유도합니다. Canalostomy 통해 여러 주사의 타당성을 테스트 하려면 마우스 PSC 통해 AAV8 GFP 정지 후 7 일 뒤 LSC 통해 스를 부여 했다. 이 실험도 HC 손실18후 손상 된 내가 유전자 치료 연구에 유용 했던 lesioned utricle에 AAV8 GFP의 변환 특성을 평가 하도록 설계 되었습니다. GFP는 lesioned utricle (그림 6)를 통해 배포 했다. 수많은 GFP-긍정적인 세포 myosin VIIA, 그들은 불리고 있었다 나타내는 대 한 부정 했다 SCs. 미 숙 헤어 번들으로 몇 HCs (myosin VIIa-긍정적인 세포)는 또한 GFP를 표현 했다.
그림 1: 장치 준비. ( A) (i) 폴 리 이미 드 튜브와 폴 리 에틸렌 튜브 (ii) 게는 주입 정 (iii) 밀봉 된다. (B)는 정 30g 바늘으로 10 µ L 마이크로 주사기에 연결 이며 다음 펌프에 설치. 화살표는 정 팁을 나타냅니다. (C) 주입 시 약 및 일반 식 염 수는에 어 갭으로 구분 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 성인 마우스에 Canalostomy. (A) 후 귀의 절 (화살표). (B) 측 뼈를 덮고 근육 노출 됩니다. 우리는 기원과 비행기로 pinna (굵은 점)의 루트를 정의에 평행선은 calvarium 3/9 시, 후부 반원의 운하 (PSC)와 측면 반원형 운하 (LSC)는 일반적으로 2와 3 시 (오각형) 사이 지역에 위치한 원점에서 ~ 3 m m. 방향의 인세트: 낮은-확대 이미지. 점선 라인 calvarium 평면을 나타냅니다. (C)는 PSC 및 LSC는 노출된 (점선). 삽입:는 LSC에는 한 약 30 °, calvarium에 평행한 평면에서 각도 PSC는 LSC에 수직 이다. (D) 작은 구멍 PSC에서 이루어집니다. (E)는 정 맥의 끝, PSC에 삽입 되 고 시 약 주입. (F)는 구멍 근육의 작은 조각으로 밀봉 된다. A에서 눈금 막대는 5 m m, 그 B 1 m m B-f (B), b 삽입에서 1 ㎝ 이며 그 c 삽입에 5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 신생아 마우스에서 Canalostomy. (A) 한 후 귀의 절 (화살표). (B) 측 뼈를 덮고 근육 노출 되 고 후부 반원의 운하 (PSC)는 pinna (굵은 점)에 2-3 시 (오각형)의 루트에서 ~ 2 m m. 방향을 그 성인 생쥐 (그림 2B). (C)는 PSC와 측면 반원형 운하 (LSC)는 노출된 (점선). (D) 작은 오프닝 PSC에서 이루어집니다. (E)는 정 PSC에 삽입 됩니다. (F) 근육의 작은 조각은 주입 후 개통을 커버 하는 데 사용 됩니다. A에 바와 B 삽입 그 b에서 1 m m, 5mm 이며 C는 1 mm (C f C) 규모. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 스테레오 현미경 이미지 성인 내 귀 (A-A') 및 신생아 쥐 (B-B') canalostomy 통해 빠른 녹색 염료 관리. 수술 후 즉시 샘플 수집 했다. (A와 B) Extracranial 표면입니다. (A'와 B') Intracranial 표면입니다. 빠른 녹색 염료는 달팽이 관, 현관, 반원의 운하에 걸쳐 배포합니다. 스케일 바는 1 m m (A'에 대 한 A A '와 B' B B'). PSC, 후부 반원의 운하 LSC, 측면 반원형 운하 SSC, 우량한 반원형 운하 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 달팽이 (A-A ")와 성인 쥐의 utricle (B-B")의 전체 산의 대표적인 confocal 이미지 준비 canalostomy 통해 AAV8 GFP 주입 후에 30 일. 샘플은 스테인드 항 체와 GFP (녹색) 및 myosin VIIa (빨간색). (A-A ") GFP는 가장 내부 세포 (IHC)에 표시 됩니다. (B-B ") Cuticular는 utricle 접시의 초점면에 수많은 세포 GFP (화살표)를 표현 한다. GFP, 녹색 형광 단백질 OHC, 외부 머리 세포 스케일 바는 25 µ m (A"에 대 한 A A", B "B-B"에 대 한). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 충격된 utricle의 대표적인 confocal 이미지 얻은 canalostomy 통해 AAV8 GFP 주입 후에 30 일. 성인 마우스 측면 반원형 운하 및 7 일 후 후부 반원의 운하를 통해 AAV8 GFP 주사를 통해 스와 함께 주입 했다. GFP (녹색), myosin VIIa (빨간색), 그리고 말라 (파란색). 화살촉 표시 AAV8 GFP로 불리고 대표 지원 세포 (GFP + myosin VIIa-셀), 화살표 표시 AAV8 GFP로 불리고 대표 세포 (GFP + myosin VIIa + 셀) 미 숙 헤어 번들으로. 눈금 막대 20 µ m (D A d)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구에서 우리는 canalostomy에 의해 약물 전달 달팽이 관 vestibular 끝-장기에 걸쳐 시 약의 광범위 한 배포 결과 다는 것을 보였다. 내가 유전자 전달 방법으로 canalostomy는 청각 및 vestibular 함수에 최소한의 피해와 성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 GFP 식에서 결과. 또한, 여러 주사 같은 동물에서 쉽게 수행할 수 있습니다.
그것은 특히 성인 쥐16,18,28,29,30에서 대 한 뜻깊은 내가 기능, 최소한의 손상을 일으키는 canalostomy의 가장 큰 강점 중 하나는 보호 효과 및 변환 측면에 대 한 평가입니다. 여러 그룹 사용 canalostomy를 murine 내가18,19,,2829로 바이러스 성 벡터, siRNA, 줄기 세포, aminoglycoside, 등 다양 한 시 약을 전달 34,35,,3637. 현재 연구에서 우리는 성인 및 신생아 쥐에 있는 canalostomy의 단계별, 자세한 수술 기법을 설명. 이전 연구에 비해, 우리의 연구에 제공 한다 추가 정보를 반원의 운하의 위치는 성공적인 수술에 대 한 주요 절차. C, 그림 2B 에서 같이 PSC 및 LSC에서 2-3 시 pinna의 루트에서 일반적으로 있는 ~ 3 m m 이었다. LSC에는 한 약 30 °, calvarium에 평행한 평면에서 각도 PSC는 LSC에 수직 이었다. 또한, 우리는 수술 절차를 간소화 하 고 비교 결과29로 약 25 분을 수술 시간 단축.
Canalostomy, 중 고 주사 부는 정 맥의 막힘에 누설을 방지 하는 것이 필수적입니다. 펌프에 전환 하기 전에 정 맥의 끝은 반원의 운하에 삽입 하 고는 정 구부러졌거나 차단 하지 중요 하다. 마른 근육 때문에, 반원의 운하 액체의 존재 그것 확장 하 고 플러그 구멍 성인 쥐의 반원의 운하에 있는 구멍을 밀봉 할 경우 사용 될 것이 좋습니다 (2.6 및 2.10 단계 참조). 신생아 쥐의 반원의 운하 벽은 부드럽고 연약한, 때문에 여 자생 근육 또는 의학 접착제30덮 음에 의해 밀봉 한다. 우리 또한 근육; 개통을 취재 하지 않고는 정 맥을 제거 결과 밝혀 비교 AAV 변환 효율 (데이터 표시 되지 않음), 내가 나타내는 신생아 쥐의 PSC에서 오프닝 만족 스럽게 닫혔습니다.
Canalostomy의 또 다른 장점은 (그림 6) 동일한 또는 다른 시 약의 반복 응용 프로그램을 수 있는 여러 절차의 타당성. 때문에 거리 및 알갱이 만듦 조직 이전 수술 사이트에서 자주 발견 되 고 반원의 운하 수술34후 방해 될 수 있습니다는 측면의 다른 영역에 반복된 수술 동안 주사를 수행 하는 것이 좋습니다 또는 후부 반원의 운하18.
Canalostomy의 주요 제한은 주입 정 perilymphatic 또는 endolymphatic 공간에 삽입 여부 결정에 어려움입니다. Canalostomy를 통해 내가16 으로 adenoviral 벡터의 관리, 후 가장 불리고 세포 주사는 가능성이 그 지역에서 수행 하는 것을 건의 하는 perilymphatic 공간에 위치 했다. 저 분자 무게 화합물 (예를 들어, AAV, 스, 및 siRNA) perilymph와 endolymph 사이의 장벽을 통과할 수 및 perilymphatic 또는 endolymphatic 공간18,19에 주입 후 감각 상피에 도달 ,34. 그러나, 주입은 perilymph로, 후 시 약 수 있습니다 남아 perilymphatic 공간에서 그들은 perilymph와 endolymph16,,3940사이의 장벽을 뚫을 수 없는 경우. 따라서, 삽입 된 시 약의 침투성 canalostomy를 사용 하기 전에 고려해 야 합니다.
끝으로, canalostomy는 청각 및 vestibular 기능의 최소한의 소란으로 달팽이 관 및 현관에서 시 약의 광범위 한 배포에 결과. 수술은 성인과 신생아 쥐에 쉽게 구현 하 고 필요한 경우 여러 절차를 수행할 수 있습니다. Canalostomy 따라서 설치류의 내가 약물 전달에 대 한 효과적이 고 안전한 방법 이며, 미래에 인간 cochleovestibular 질병 치료에 임상적으로 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언 됩니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 81570912, 81771016, 81100717)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
References
- Stachler, R. J., et al. Clinical practice guideline: sudden hearing loss. Otolaryngol Head Neck Surg. 146 (3 Suppl), S1-S35 (2012).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19 (3), 345-350 (2013).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), e52187 (2015).
- Ahmed, H., Shubina-Oleinik, O., Holt, J. R. Emerging Gene Therapies for Genetic Hearing Loss. J Assoc Res Otolaryngol. 18 (5), 649-670 (2017).
- Murillo-Cuesta, S., et al. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J Vis Exp. (121), e54951 (2017).
- Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J Vis Exp. (105), e53131 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Principles of local drug delivery to the inner ear. Audiol Neurootol. 14 (6), 350-360 (2009).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35 (3), 264-272 (2017).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Mol Med. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. J Neurosci Methods. 150 (1), 67-73 (2006).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Bowers, W. J., et al. Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea. Mol Ther. 6 (1), 12-18 (2002).
- Wang, G. P., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer targeting normal and traumatized mouse utricle. Gene Ther. 21 (11), 958-966 (2014).
- Isgrig, K., et al. Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25 (3), 780-791 (2017).
- Gassner, D., Durham, D., Pfannenstiel, S. C., Brough, D. E., Staecker, H. Canalostomy as a surgical approach for cochlear gene therapy in the rat. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1830-1836 (2012).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene transfection in neonatal mice using adeno-associated viral vector: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Chien, W. W., McDougald, D. S., Roy, S., Fitzgerald, T. S., Cunningham, L. L. Cochlear gene transfer mediated by adeno-associated virus: Comparison of two surgical approaches. Laryngoscope. 125 (11), 2557-2564 (2015).
- Zhu, B. Z., Saleh, J., Isgrig, K. T., Cunningham, L. L., Chien, W. W. Hearing Loss after Round Window Surgery in Mice Is due to Middle Ear Effusion. Audiol Neurootol. 21 (6), 356-364 (2017).
- Wang, Y., et al. Early postnatal virus inoculation into the scala media achieved extensive expression of exogenous green fluorescent protein in the inner ear and preserved auditory brainstem response thresholds. J Gene Med. 15 (3-4), 123-133 (2013).
- Lee, M. Y., et al. Survival of human embryonic stem cells implanted in the guinea pig auditory epithelium. Sci Rep. 7, 46058 (2017).
- Ishimoto, S., Kawamoto, K., Kanzaki, S., Raphael, Y. Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti. Hear Res. 173 (1-2), 187-197 (2002).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33 (4), 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
- Guo, J. Y., et al. Cochleovestibular gene transfer in neonatal mice by canalostomy. Neuroreport. 28 (11), 682-688 (2017).
- Beyea, J. A., Agrawal, S. K., Parnes, L. S. Transmastoid semicircular canal occlusion: a safe and highly effective treatment for benign paroxysmal positional vertigo and superior canal dehiscence. Laryngoscope. 122 (8), 1862-1866 (2012).
- Naples, J. G., Eisen, M. D. The History and Evolution of Surgery on the Vestibular Labyrinth. Otolaryngol Head Neck Surg. 155 (5), 816-819 (2016).
- Hamilton, L., Keh, S., Spielmann, P. M., Hussain, S. S. How we do it: locating the posterior semicircular canal in occlusion surgery for refractory benign paroxysmal positional vertigo: a cadaveric temporal bone study. Clinical Otolaryngology. 41 (2), 190-193 (2016).
- Jung, J. Y., et al. siRNA targeting Hes5 augments hair cell regeneration in aminoglycoside-damaged mouse utricle. Mol Ther. 21 (4), 834-841 (2013).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. Am J Pathol. 171 (1), 214-226 (2007).
- Pfannenstiel, S. C., Praetorius, M., Plinkert, P. K., Brough, D. E., Staecker, H. Bcl-2 gene therapy prevents aminoglycoside-induced degeneration of auditory and vestibular hair cells. Audiol Neurootol. 14 (4), 254-266 (2009).
- Kawamoto, K., Izumikawa, M., Beyer, L. A., Atkin, G. M., Raphael, Y. Spontaneous hair cell regeneration in the mouse utricle following gentamicin ototoxicity. Hear Res. 247 (1), 17-26 (2009).
- Wang, G. P., et al. Notch signaling and Atoh1 expression during hair cell regeneration in the mouse utricle. Hear Res. 267 (1-2), 61-70 (2010).
- Pietola, L., et al. HOX-GFP and WOX-GFP lentivirus vectors for inner ear gene transfer. Acta Otolaryngol. 128 (6), 613-620 (2008).
- Han, J. J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
