Summary
Her beskriver vi canalostomy procedure, som tillader lokale medicinafgivelse indre ører af voksne og neonatal mus gennem halvrunde kanalen med minimal skade til høring og vestibulære funktion. Denne metode kan bruges til podes virale vektorer, farmaceutiske produkter og små molekyler i mus indre øre.
Abstract
Lokal levering af terapeutiske lægemidler i det indre øre er en lovende behandling for indre øre sygdomme. Injektion gennem halvrunde kanaler (canalostomy) har vist sig at være en nyttig tilgang til lokale medicinafgivelse ind i det indre øre. Målet med denne artikel er at beskrive i detaljer, de kirurgiske teknikker, der er involveret i canalostomy i både voksen og neonatal mus. Som anført af fast-grønne farvestof og adeno-associeret virus serotype 8 med grøn fluorescerende proteiner-gen, canalostomy lettes bred fordeling af injicerede reagenser i cochlea og vestibulære slutningen-organer med minimal skade til høring og vestibulære funktion. Operationen blev succesfuldt implementeret i både voksen og neonatal mus; faktisk, flere operationer kan udføres hvis det kræves. Afslutningsvis, canalostomy er en effektiv og sikker tilgang til medicinafgivelse indre ører af voksne og neonatal mus og kan bruges til at behandle menneskelige indre øre sygdomme i fremtiden.
Introduction
Sensorineural høre tab og vestibulær dysfunktion påvirker et betydeligt antal patienter og er tæt forbundet med indre øre lidelser. Levering af terapeutiske lægemidler i det indre øre viser løfte til behandling af indre øre lidelser. En systemiske eller lokale tilgang kan bruges til at levere narkotika ind i det indre øre. Nogle indre øre sygdomme behandles med held med systemisk drug administration, såsom idiopatisk pludselige høretab, som er almindeligt behandles med systemisk steroid1. Derudover viste Lentz et al. , at systemisk administration af antisense oligonukleotid var i stand til at forbedre hørelse og balance funktioner i Ush1c mutant musen model2. Men en stor del af indre øre sygdomme er ikke effektivt behandles systemisk drug administration på grund af blod-labyrint barriere, som begrænser narkotika adgang til det indre øre3,4. Derimod kan lokale drug delivery strategier behandle indre øre lidelser mere effektivt. Ja, det indre øre er potentielt et ideelt mål for lokale medicinafgivelse; Det er fyldt med væske, som fremmer formidling af stoffet efter one-site diffusion eller injektion, og det er relativt isoleret fra nærliggende organer, som begrænser bivirkninger5,6.
Lokale drug delivery strategier omfatter intratympanic og intralabyrinthine metoder. Effektiviteten af den intratympanic rute bygger i vid udstrækning på narkotikamisbrug permeabilitet gennem det runde vindue membran (RWM) og opholdstid af lægemidlet på RWM3,4,7,8. Det er således ikke egnet til leveringen af narkotika eller reagenser, der ikke kan trænge igennem RWM. Intralabyrinthine metoder indebærer podning af medicin direkte ind i det indre øre, resulterer i en høj dosis og udbredt distribution. Men intralabyrinthine metoder kræver delikat operationer og er invasiv, fører til skader på indre øre funktion. I øjeblikket, bruges intralabyrinthine injektion af narkotika kun i dyreforsøg, som det ikke er påvist for at være tilstrækkeligt sikker til brug i mennesker9. Derfor, kirurgiske procedurer bør forenkles, og nedsættes risikoen for skade for at oversætte intralabyrinthine tilgange til klinikken.
Flere intralabyrinthine metoder er blevet vurderet i dyr ved injektion gennem RWM5,10,11 og ind i scala media12,13,14, scala tympani 15 , 16, scala forhallen17, halvrunde kanaler16,18,19,20og endolymphatic sac21. Hver af disse metoder har fordele og ulemper6. Levering gennem RWM er atraumatisk i neonatal mus5,22. Dog er milde høretab observeret hos voksne mus efter RWM injektion23, muligvis på grund af mellemøret effusion efter kirurgi24. Scala media injektion, der indebærer injektion af reagenset direkte i af endolymphatic rum sensoriske epitel, opnår en høj reagens koncentration i målet ende-organer12,14, 25 , 26. men denne tilgang kræver en kompliceret procedure og resulterer i betydelig udvidelse af høringen tærskel, hvis udført senere end postnatal dag 5 (P5)25,27, hvilket begrænser dets anvendelse.
I forhold til de ovennævnte intralabyrinthine tilgange, forårsager canalostomy minimal skade det indre øre, især i voksen mus16,18,28,29,30, som er vigtig for vurderingen af beskyttende effekter og translationel aspekter. Derudover i gnavere, er halvrunde kanaler placeret ud over bulla, som letter kirurgiske procedurer og forebygger forstyrrelser af mellemøret under kirurgi. I klinikken bruges halvrunde kanalen operationer for genstridig benign paroxysmal positional vertigo31,32,33, tyder på den kliniske feasibility af canalostomy. Da det først blev beskrevet af Kawamoto mfl. 16 i 2001, canalostomy har været brugt til at levere forskellige reagenser, såsom virale vektorer, siRNA, stamceller og aminoglycosid, i den murine indre øre18,19,28,29 ,34,35,36,37. Podning af adeno-associeret virus (AAV) vektorer af canalostomy aktiverer overekspression af udefrakommende gener i sensoriske epitel og primære neuroner i cochlea og vestibulære slutningen-organer18,28, 29,30. Whirlin genterapi af canalostomy genskaber balancen funktion og forbedrer hørelse i en musemodel af menneskelige Usher syndrom19, tyder på, at canalostomy er nyttigt for studier af genterapi for genetiske cochleovestibular sygdomme. Transplantation af mesenkymale stamceller af canalostomy resulterer i reorganiseringen af cochlear fibrocytes og hørelse opsving i en rotte model af akut sensorineural hearing tab35. Derudover canalostomy kan bruges til at indføre aminoglycosider i det indre øre at etablere vestibulære læsioner18,34,38, og flere injektioner kan udføres, hvis det kræves18 , 34.
I denne artikel beskriver vi i detaljer, canalostomy teknikker i voksen og neonatal mus. Vi inokuleres forskellige reagenser, herunder hurtig-grønne farvestof og AAV serotype 8 (AAV8), sammen med de grønne fluorescerende proteiner (NGL) genet (AAV8-NGL) og streptomycin, i mus indre øre til at vurdere de umiddelbare og langsigtede resultater efter canalostomy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer og animalske operationer blev gennemført efter retningslinjerne i Animal Care og brug Udvalget af Capital medicinske universitet i Kina.
1. enhed præparater
- For at gøre injektion kanyle (figur 1A), Tilslut polyimid slanger (indre diameter 114.3 µm, ydre diameter 139.7 µm, længde ~ 3 cm) for polyethylen slanger (indre diameter 280 µm, ydre diameter 640 µm, længde ~ 40 cm). Bruger superlim, forsegle forbindelsen med mindst tre programmer. Sterilisere injektion kanyle med ethylenoxid.
Bemærk: Når forsegling slangen, forhindre superlim fra indtastning af polyimid slangen, hvilket kan resultere i en blokering af kanylen. Forsegle slangen på mindst tre gange, fordi gas sterilisation kan forårsage lækage på forbindelsen. - Ved hjælp af en 30 G nål, Tilslut enden af polyethylen slanger til en 1 cc sprøjte indeholdende normale saltvand. Fyld kanylen med normal saltvand ved injektion med 1-cc sprøjten til at kontrollere for lækage eller blokering på forbindelsen mellem polyimid slanger og polyethylen slanger.
Bemærk: Hvis der er en lækage eller en blokering af forbindelsen, kanylen kan ikke bruges i følgende procedurer. - Evakuere en 10 µL mikro-sprøjte med normal saltvand og sammenknytte sig hen til den førnævnte 30 G kanyle med indsprøjtning kanyle. Installere micro-sprøjte på en mikroinjektion pumpe (figur 1B). Indstille injektion hastighed til 0,5 µL/min og volumen til 1 µL til fast-grøn farve og AAV8-normal god landbrugspraksis, eller 2 µL for streptomycin.
Bemærk: Den anbefalede række injektion hastighed er 0.1−0.5 µL/min, og den anbefalede række Injektionsvolumen er 0.5−2 µL. - Trække sig tilbage på mikro-sprøjten til 1 µL og udtrække injektion reagens. En luftspalte vil danne mellem normal saltvand og den injicerede reagens (figur 1 c).
- Valgfrit mærke placeringen af gas-væske grænsen på polyethylen slanger med en tusch. Dette kan bruges til at overvåge reagens flow under injektion.
2. Canalostomy i voksne mus
- Bedøver en voksen mus (kvindelige, FVB/N, 5 til 6 uger gamle) ved intraperitoneal injektion af ketamin HCl (120 mg/kg) og xylazin HCl (7 mg/kg). Afvente 5−10 min, indtil dyret udviser ingen svar til smertefulde stimuli (tå-knivspids refleks). Placere dyret på en forvarmet elektrisk pad efter anæstesi. En smertestillende, Meloxicam (1 mg/kg), blev anvendt subkutant før operationen.
- Dække dyrets øjne med øjet salve. Barbere venstre post auricular regionen med en elektrisk animalske clipper og desinficere huden tre gange med 75% ethanol.
- Placere dyret på en forvarmet elektrisk pad. Indstil temperaturen af den elektriske pad til ~ 37° C. Placere dyret højre laterale i stand til at lette kirurgi på det venstre øre.
- Gøre en 1-1,5-cm post auricular snit ~ 3 mm fra venstre retroauricular groove (figur 2A).
- Positionering bageste halvrunde kanalen (PSC) og laterale halvrunde kanalen (LSC): når roden af pinna (Fed prik i figur 2B) er defineret som oprindelse og et plan parallelt med calvarium 3 til 9 klokken, PSC og Løsningscenter er typisk beliggende ~ 3 mm fra roden af toppunkt mellem 2 og 3 klokken (figur 2B).
- Ligeud dissekere den muskel, der dækker den tidsmæssige knoglen med mikro-pincet til at afsløre PSC og LSC, hvis margener kan ses som mørke striber i den tidsmæssige knoglen (figur 2 c). Løsningscenter er på en ca. 30° vinkel fra et plan parallelt med calvarium, og PSC er lodret til LSC (figur 2 c). Saml et lille stykke af muskel med mikro-pincet og lad det tørre. I de følgende trin, vil denne muskel blive brugt til at forsegle hul.
Bemærk: Undgå overdreven rivning af væv til at minimere skader på muskler. Undgå at beskadige den tilstødende fartøj, når udsætter PSC (figur 2D). - Lav et lille hul i den midterste del af PSC ved hjælp af en 26 G kanyle (figur 2D). Væske lækage gennem hullet angiver vellykkede gennemtrængning af den benede mur af PSC. Forstørre hul til en passende størrelse, lidt større end diameteren af polyimid slangen.
Bemærk: Bore og udvide hullet forsigtigt og gradvist at undgå fraktur af PSC. - Ren at effusion omkring hullet i PSC ved hjælp af en bomuld pellet.
- Indsæt spidsen af polyimid slanger forsigtigt i PSC mod crus kommunen til en dybde af 1−2 mm (figur 2E). Start injektion ved at trykke på knappen "run" på pumpen.
- Efter injektionen, vente ~ 2 min til at tillade reagens til at sprede. Trimme det lille stykke af muskel indsamlede i trin 2.6 med mikro-saks. Dernæst fjerne injektion kanyle og umiddelbart sted musklen i hullet i PSC.
Bemærk: Tjek for enhver væske, der siver ud fra hullet efter plugging for at sikre, at hullet er helt lukket. - Returnere adskilt muskler og subkutane væv. Sutur indsnit ved hjælp af en 5-0 sutur. Desinficere området snit med povidon-jod.
Bemærk: Alle de ovenfor kirurgiske procedurer tager ca. 25 min. - Placer dyret på en elektrisk pad forvarmes til ~ 37 ° C. Placere dyret i den højre laterale holdning til nyttiggørelse.
- Udføre auditive hjernestammen svar (ABR) målinger og svømning test en uge efter operationen18.
- Hvis det er nødvendigt, udføre gentagne injektioner i et andet område af PSC eller Lexmark Løsningscenter.
3. Canalostomy i Neonatal mus
- Bruge hypotermi at fremkalde og vedligeholde sedation i neonatal mus (FVB/N) på postnatal dage 1 til 2 (P1-2). Placer pup på en plastik-wrap-dækket seng af knust is i ~ 4 min. Næste, lå pup på en is-fyldt platform. Desinficere kirurgiske inden tre gange med 75% ethanol.
Bemærk: Sikre, at lederen af pup er ud af isen. Udføre hele operationen med hvalpen på en is-fyldt platform. - Følgende trin er forskellige i den nyfødte i forhold til de voksne mus.
- Gøre en ~ 3-mm postauricular snit fra ~ 2 mm posteriort for den auricular krølle (figur 3A -B).
- Forsigtigt gøre en åbning i den bløde PSC ved hjælp af en 26 G kanyle. Indsætte kanylen i PSC uden at udvide åbningen (figur 3 c -E).
- Efter injektion, skal du bruge et stykke af muskel til at dække, snarere end stik, åbningen som sidstnævnte kan føre til et brud på den bløde PSC (figur 3F).
- Lukke huden ved hjælp af en 6-0 sutur.
- Udføre ABR målinger og svømning tests på P3030.
- Forældrenes kannibalisme er et fælles problem efter neonatal kirurgi. Følgende trin reducerer sandsynligheden for forældrenes kannibalisme.
- Rense blodet omkring indsnittet med alkohol klude efter operationen.
- Sikre, at nyfødte kan bevæge sig frit før den returneres til dæmningen.
- Smøre nyfødte med snavset strøelse fra moderens bur og sted nyfødte tilbage midt i kuldet.
- Nogen, der ikke undergår kirurgi bør modtage en lignende postauricular snit og sutur.
- Adskille mand fra avl bur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hurtig-grønne farvestof var tilført PSC af voksne og neonatal mus at evaluere dens umiddelbare distribution i det indre øre. Farvestoffet blev opdaget i hele cochlea, forhallen og halvcirkelformede kanaler umiddelbart efter operationen (figur 4).
For at vurdere sikkerheden og effektiviteten af canalostomy for indre øre gen levering, blev AAV8-NGL sprøjtet ind i det indre øre for voksne og neonatal mus. Alle dyr udstillet normale ABR tærskler og svømning test scores efter AAV8-NGL injektion18,30. Immunohistology afslørede, at i den auditive sensoriske epitel, indre hårceller (IHCs) og et par ydre hårceller (OHCs) af basal turn viste robust normal god landbrugspraksis udtryk30. I det vestibulære sensoriske epitel, blev normal god landbrugspraksis udtryk opdaget i utricle og saccule ampullae30. Både vestibulære hårceller (figur 5) og støtte celler blev transduced med høj effektivitet18,30.
Infusion af streptomycin af canalostomy inducerer svær hår celletab i utricle18,34,38. For at teste muligheden for flere injektioner via canalostomy, fik mus streptomycin via Løsningscenter efterfulgt AAV8-NGL suspensioner gennem PSC 7 dage senere. Dette eksperiment var også designet til at evaluere transduktion Karakteristik af AAV8-normal god landbrugspraksis i den lesioned utricle, der var nyttigt for gen terapi undersøgelser i det beskadigede indre øre efter HC tab18. Normal god landbrugspraksis var fordelt over hele den lesioned utricle (figur 6). Talrige normal god landbrugspraksis-positive celler var negativ for myosin VIIA, der angiver, at de var transduced SCs. Et par HCs (myosin VIIa-positive celler) med umodne hår bundter også udtryk for normal god landbrugspraksis.
Figur 1: enhed forberedelse. (A) polyimid slangen, (i) og polyethylen slanger (ii) er forseglet for at gøre en injektion kanyle (iii). (B) kanylen er tilsluttet en 10 µL mikro-sprøjte med en 30 G kanyle og derefter installeret på en pumpe. Pilen angiver kanyle tip. (C) injektion reagens og normal saltvand er adskilt af en luftspalte. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Canalostomy i en voksen mus. (A) en post auricular indsnit (pil). (B) muskler der dækker den tidsmæssige knoglen udsættes. Hvis vi definerer roden af pinna (Fed prik) som oprindelse og et plan parallelt med calvarium som 3/9 klokken, den bageste halvrunde kanalen (PSC) og laterale halvrunde kanalen (LSC) er normalt placeret i området mellem 2 og 3 klokken (pentagram) , ~ 3 mm fra oprindelse. Indsatser: lavere forstørrelse billede af retningen. Den stiplede linje angiver calvarium fly. (C) The PSC og LSC er udsatte (stiplede linjer). Indsatser: Løsningscenter er på en ca. 30° vinkel fra et plan parallelt med calvarium, og PSC er lodret til Løsningscenter. (D) et lille hul er lavet i PSC. (E) spidsen af kanylen indsættes i PSC, og reagenset indsprøjtes. (F) hullet er lukket med et lille stykke af muskel. Skalalinjen i A er 5 mm, der i B er 1 mm (B til B-F), der i indsatser til B er 1 cm, og det i indsatser til C er 5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Canalostomy i en neonatal mus. (A) en post auricular indsnit (pil). (B) muskler der dækker den tidsmæssige knoglen udsættes, og den bageste halvrunde kanalen (PSC) er ~ 2 mm fra roden af pinna (Fed prik) på 2-3 klokken (pentagram). Orienteringen er identiske i voksne mus (figur 2B). (C) The PSC og laterale halvrunde kanalen (LSC) er udsat (stiplede linjer). (D) en lille åbning er lavet i PSC. (E) kanylen indsættes i PSC. (F) et lille stykke af muskel der bruges til at dække åbningen efter injektion. Skalere barer i A og B indsatser er 5 mm, der i B er 1 mm, og at C er 1 mm (C til C-F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Stereo mikroskopiske billeder af indre ørerne af voksen (A-A') og neonatal mus (B-B') administreret fast-grønne farvestof via canalostomy. Prøverne blev indsamlet umiddelbart efter operationen. (A og B) Den extracranial overflade. (A' og B') Intrakraniel overfladen. Hurtig-grønne farvestof distribuerer hele cochlea, forhallen og halvcirkelformede kanaler. Skala barer er 1 mm (A' for A-A 'og B' for B-B'). PSC, bageste halvrunde kanalen. LSC, lateral halvrunde kanalen. VSK, overlegne halvrunde kanalen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative Konfokal billeder af hele mounts cochlea (A-A") og utricle (B-B") af voksen mus, forberedt 30 dage efter AAV8-NGL injektion via canalostomy. Prøverne er farvet med antistoffer for normal god landbrugspraksis (grøn) og myosin VIIa (rød). (A-A ") Normal god landbrugspraksis er udtrykt i de fleste indre hårceller (IHC). (B-B ") På brændplanet af den cuticular plade af utricle express talrige hårceller normal god landbrugspraksis (pile). Normal god landbrugspraksis, grøn fluorescerende proteiner. OHC, ydre hårceller. Skala barer er 25 µm (A"for A-A", B "for B-B"). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: repræsentative Konfokal billeder af en traumatiseret utricle opnået 30 dage efter AAV8-NGL injektion via canalostomy. En voksen mus blev sprøjtet med streptomycin via de laterale halvrunde kanalen og 7 dage senere sprøjtes med AAV8-NGL via den bageste halvrunde kanalen. Normal god landbrugspraksis (grøn), myosin VIIa (rød) og actin (blå). Pilespidser angive repræsentative støtte celler transduced med AAV8-normal god landbrugspraksis (NGL +/ myosin VIIa-celler), og pilene angiver repræsentative hårceller transduced med AAV8-normal god landbrugspraksis (normal god landbrugspraksis +/ myosin VIIa + celler) med umodne hår bundter. Skalalinjen er 20 µm (D til A-D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse viste vi, at narkotika levering af canalostomy resulterede i omfattende udbredelse af reagens i hele cochlea og vestibulære slutningen-organer. Som en indre øre gen leveringsmetode resulterede canalostomy i normal god landbrugspraksis udtryk for indre ørerne af voksne og neonatal mus med minimal skade til høring og vestibulære funktion. Desuden kan flere injektioner let udføres i samme dyr.
En af de største styrker i canalostomy er, at det forårsager minimal skade til indre øre funktion, især i voksen mus16,18,28,29,30, som er væsentlig for den vurdering af beskyttende effekter og for Translationel aspekter. Flere grupper har brugt canalostomy til at levere forskellige reagenser, såsom virale vektorer, siRNA, stamceller og aminoglycosid, i den murine indre øre18,19,28,29, 34,35,36,37. I den aktuelle undersøgelse beskrevet vi trin for trin, detaljerede kirurgiske teknikker til canalostomy i voksen og neonatal mus. Sammenlignet med tidligere undersøgelser, giver vores undersøgelse yderligere oplysninger om placering af den halvrunde kanaler, som er en vigtig procedure for vellykket kirurgi. Som vist i figur 2B og C, var PSC og LSC generelt placeret ~ 3 mm fra roden af toppunkt på 2-3 kl. Løsningscenter var på en ca. 30° vinkel fra et plan parallelt med calvarium, og PSC var lodret til Løsningscenter. Desuden vi forenklet de kirurgiske procedurer og afkortet den kirurgiske tid til ca 25 min med sammenlignelige resultater29.
Under canalostomy er det bydende nødvendigt at undgå udsivning på injektionsstedet og blokering af kanylen. Før du skifter på pumpen, er det vigtigt at sikre, at spidsen af kanylen er indsat i den halvcirkelformede kanalen og at kanylen ikke er bøjet eller blokeret. Tør muskel anbefales at blive brugt, når forsegling hul i halvrunde kanalen af voksen mus, fordi, i overværelse af halvcirkelformede kanalen væske, det udvider sig og stik hullet (Se trin 2.6 og 2.10). Fordi mur af halvcirkelformede kanalen af neonatal mus er bløde og skrøbelige, skal åbning være forseglet af dækker med autogen muskel eller medicinsk lim30. Vi har også fjernet kanylen uden at dække åbningen med muskel; resultater afslørede sammenlignelige AAV transduktion effektivitet i det indre øre (data ikke vist), der angiver, at åbningen i PSC af neonatal mus blev lukket tilfredsstillende.
En anden fordel ved canalostomy er muligheden for flere procedurer, som gør det muligt for gentagne applikationer af de samme eller forskellige reagenser (figur 6). Fordi fibrotisk og granulering væv er ofte fundet tidligere kirurgisk steder, og halvrunde Kanalen kan være blokeret efter kirurgi34, anbefales det at udføre injektioner under gentagne operationer i et andet område af lateralt og/eller posterior halvrunde kanaler18.
Den største begrænsning af canalostomy er vanskeligheden ved bestemmelse af, om injektion kanylen indsættes i det perilymphatic eller endolymphatic rum. Efter administration af adenoviral vektorer til indre øre16 via canalostomy, blev mest transduced celler placeret i det perilymphatic rum, tyder på, at injektion var sandsynligvis udført i det pågældende område. Lavmolekylære forbindelser (fx AAV, streptomycin og siRNA) kan passere gennem barrieren mellem perilymph og endolymph og nå den sensoriske epitel efter injektion i perilymphatic eller endolymphatic rum18,19 ,34. Men efter indsprøjtning af perilymph, reagenser kan forblive i det perilymphatic rum hvis de ikke kan trænge ind i barrieren mellem perilymph og endolymph16,39,40. Derfor bør permeabilitet af de injicerede reagenser overvejes før ved hjælp af canalostomy.
Afslutningsvis resulterer canalostomy i en bred distribution af reagenser i cochlea og forhal med minimal forstyrrelse af høre- og vestibulære funktion. Operationen er nemt at implementere i voksen og neonatal mus, og flere procedurer kan udføres, hvis det kræves. Canalostomy er således en effektiv og sikker tilgang til medicinafgivelse ind i det indre øre af gnavere og kan i fremtiden bruges klinisk til at behandle menneskelige cochleovestibular sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter er erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den National Natural Science Foundation of China (grant numre 81570912, af 81771016, 81100717).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
References
- Stachler, R. J., et al. Clinical practice guideline: sudden hearing loss. Otolaryngol Head Neck Surg. 146 (3 Suppl), S1-S35 (2012).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19 (3), 345-350 (2013).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), e52187 (2015).
- Ahmed, H., Shubina-Oleinik, O., Holt, J. R. Emerging Gene Therapies for Genetic Hearing Loss. J Assoc Res Otolaryngol. 18 (5), 649-670 (2017).
- Murillo-Cuesta, S., et al. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J Vis Exp. (121), e54951 (2017).
- Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J Vis Exp. (105), e53131 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Principles of local drug delivery to the inner ear. Audiol Neurootol. 14 (6), 350-360 (2009).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35 (3), 264-272 (2017).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Mol Med. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. J Neurosci Methods. 150 (1), 67-73 (2006).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Bowers, W. J., et al. Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea. Mol Ther. 6 (1), 12-18 (2002).
- Wang, G. P., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer targeting normal and traumatized mouse utricle. Gene Ther. 21 (11), 958-966 (2014).
- Isgrig, K., et al. Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25 (3), 780-791 (2017).
- Gassner, D., Durham, D., Pfannenstiel, S. C., Brough, D. E., Staecker, H. Canalostomy as a surgical approach for cochlear gene therapy in the rat. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1830-1836 (2012).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene transfection in neonatal mice using adeno-associated viral vector: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Chien, W. W., McDougald, D. S., Roy, S., Fitzgerald, T. S., Cunningham, L. L. Cochlear gene transfer mediated by adeno-associated virus: Comparison of two surgical approaches. Laryngoscope. 125 (11), 2557-2564 (2015).
- Zhu, B. Z., Saleh, J., Isgrig, K. T., Cunningham, L. L., Chien, W. W. Hearing Loss after Round Window Surgery in Mice Is due to Middle Ear Effusion. Audiol Neurootol. 21 (6), 356-364 (2017).
- Wang, Y., et al. Early postnatal virus inoculation into the scala media achieved extensive expression of exogenous green fluorescent protein in the inner ear and preserved auditory brainstem response thresholds. J Gene Med. 15 (3-4), 123-133 (2013).
- Lee, M. Y., et al. Survival of human embryonic stem cells implanted in the guinea pig auditory epithelium. Sci Rep. 7, 46058 (2017).
- Ishimoto, S., Kawamoto, K., Kanzaki, S., Raphael, Y. Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti. Hear Res. 173 (1-2), 187-197 (2002).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33 (4), 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
- Guo, J. Y., et al. Cochleovestibular gene transfer in neonatal mice by canalostomy. Neuroreport. 28 (11), 682-688 (2017).
- Beyea, J. A., Agrawal, S. K., Parnes, L. S. Transmastoid semicircular canal occlusion: a safe and highly effective treatment for benign paroxysmal positional vertigo and superior canal dehiscence. Laryngoscope. 122 (8), 1862-1866 (2012).
- Naples, J. G., Eisen, M. D. The History and Evolution of Surgery on the Vestibular Labyrinth. Otolaryngol Head Neck Surg. 155 (5), 816-819 (2016).
- Hamilton, L., Keh, S., Spielmann, P. M., Hussain, S. S. How we do it: locating the posterior semicircular canal in occlusion surgery for refractory benign paroxysmal positional vertigo: a cadaveric temporal bone study. Clinical Otolaryngology. 41 (2), 190-193 (2016).
- Jung, J. Y., et al. siRNA targeting Hes5 augments hair cell regeneration in aminoglycoside-damaged mouse utricle. Mol Ther. 21 (4), 834-841 (2013).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. Am J Pathol. 171 (1), 214-226 (2007).
- Pfannenstiel, S. C., Praetorius, M., Plinkert, P. K., Brough, D. E., Staecker, H. Bcl-2 gene therapy prevents aminoglycoside-induced degeneration of auditory and vestibular hair cells. Audiol Neurootol. 14 (4), 254-266 (2009).
- Kawamoto, K., Izumikawa, M., Beyer, L. A., Atkin, G. M., Raphael, Y. Spontaneous hair cell regeneration in the mouse utricle following gentamicin ototoxicity. Hear Res. 247 (1), 17-26 (2009).
- Wang, G. P., et al. Notch signaling and Atoh1 expression during hair cell regeneration in the mouse utricle. Hear Res. 267 (1-2), 61-70 (2010).
- Pietola, L., et al. HOX-GFP and WOX-GFP lentivirus vectors for inner ear gene transfer. Acta Otolaryngol. 128 (6), 613-620 (2008).
- Han, J. J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
