Summary
Hier beschreiben wir Canalostomy Verfahren die lokale Medikamentenabgabe in das innere Ohr von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen durch den Semicircular Kanal mit minimalschaden Hör- und vestibulären Funktion ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, virale Vektoren, Pharma und kleine Moleküle in das Innenohr Maus impfen.
Abstract
Lokale Übermittlung Medikamente in das Innenohr ist eine vielversprechende Therapie für Innenohr-Erkrankungen. Injektion durch Bogengängen (Canalostomy) hat sich gezeigt, zu lokalen Wirkstoffapplikation ins Innenohr ein sinnvoller Ansatz sein. Das Ziel dieses Artikels ist es, im Detail, die Operationstechniken beteiligt Canalostomy bei Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen zu beschreiben. Wie angedeutet durch schnell-grüne Farbstoff und Adeno-assoziierten Virus Serotyp 8 mit dem grün fluoreszierenden Protein-gen, erleichtert die Canalostomy breite Verteilung des injizierten Reagenzien in der Cochlea und vestibulären Ende-Orgeln mit minimaler Beschädigung zu hören und vestibuläre Funktion. Die Operation war erfolgreich bei Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen durchgeführt; in der Tat konnte mehrere Operationen durchgeführt werden, falls erforderlich. Zusammenfassend, Canalostomy ist eine wirksame und sichere Annäherung an Drug-Delivery in das innere Ohr von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen und kann verwendet werden, um menschliche Innenohr-Erkrankungen in der Zukunft zu behandeln.
Introduction
Sensorineurale hören Verlust und vestibulären Dysfunktion Affekt eine beträchtliche Anzahl von Patienten und sind eng verbunden mit Innenohrerkrankungen. Lieferung von therapeutischen Medikamenten ins Innenohr zeigt Versprechen für die Behandlung von Innenohrerkrankungen. Ein systemische oder lokaler Ansatz kann verwendet werden, um Drogen in das Innenohr zu liefern. Einige Innenohr-Erkrankungen sind erfolgreich mit systemischen Medikamentengabe wie idiopathischer Hörsturz behandelt, die häufig mit systemischen Steroiden1behandelt wird. Darüber hinaus zeigten Lentz Et Al. , dass systemische Verabreichung von antisense-Oligonukleotid konnte verbessern hören und Gleichgewicht Funktionen in die Ush1c mutierten Maus Modell2. Aber ein Großteil der Innenohr-Erkrankungen sind nicht effektiv behandelt durch systemische Medikamentengabe aufgrund der Blut-Labyrinth-Barriere, die Zugang zu Medikamenten zum Innenohr3,4begrenzt. Im Gegensatz dazu können lokale Medikament Bereitstellungsstrategien Innenohrerkrankungen effizienter behandeln. In der Tat ist das Innenohr potenziell ein ideales Ziel für lokale Medikamentenapplikation; Es ist gefüllt mit Flüssigkeit, die Verbreitung der Droge nach einer Website Diffusion oder Injektion erleichtert, und es ist relativ isoliert von benachbarten Organen, die Nebenwirkungen5,6begrenzt.
Lokalen Medikament Bereitstellungsstrategien gehören intratympanale und intralabyrinthine Methoden. Die Wirksamkeit der intratympanale Route stützt sich weitgehend auf Droge Durchlässigkeit durch Rundfenster Membran (RWM) und die Verweilzeit des Medikaments auf die RWM3,4,7,8. Somit eignet sie sich nicht für die Lieferung von Medikamenten oder Reagenzien, die der RWM nicht durchdringen können. Intralabyrinthine Methoden beinhalten Inokulation von Medikamenten direkt in das Innenohr, was zu einem hohen Dosis und weite Verbreitung. Jedoch intralabyrinthine Methoden erfordern heikle Operationen und sind invasive, führt zur Beschädigung der Innenohr-Funktion. Derzeit ist die intralabyrinthine Injektion von Medikamenten nur in Tierversuchen verwendet, da es nicht ausreichend sicher für den Einsatz in Menschen9nachgewiesen. Daher Operationsverfahren müssen vereinfacht werden, und das Verletzungsrisiko reduziert, um intralabyrinthine Ansätze in die Klinik zu übersetzen.
Mehrere intralabyrinthine Ansätze wurden bei Tieren durch Injektion durch die RWM5,10,11 und in der Scala Media12,13,14, Scala Pauke bewertet 15 , 16, die Scala Vestibül17Bogengängen16,18,19,20und endolymphatic Sac-21. Jeder dieser Ansätze hat vor- und Nachteile6. Lieferung durch den RWM ist atraumatisch Neugeborenen Mäusen5,22. Jedoch ist eine leichte Schwerhörigkeit nach RWM Injektion23, möglicherweise aufgrund von Mittelohr Erguss nach der Operation24bei Erwachsenen Mäusen beobachtet. Scala Media Einspritzung, die die Injektion des Reagens direkt in den endolymphatic Raum mit den sensorischen Epithel beteiligt sind, erzielt eine hohe Reagenz-Konzentration im Ziel Ende-Organe12,14, 25 , 26. jedoch dieser Ansatz erfordert ein komplexes Verfahren und ergibt deutliche Erhöhung der Hörschwelle erfolgt spätestens postnatale Tag 5 (P5)25,27, die seine Anwendung beschränkt.
Im Vergleich zu den oben genannten intralabyrinthine Ansätzen, bewirkt, dass Canalostomy minimalen Beschädigung des Innenohrs, insbesondere bei Erwachsenen Mäusen16,18,28,29,30, die wichtig für die Beurteilung der Schutzwirkung und Translationale Aspekte. Darüber hinaus bei Nagern, den Bogengängen jenseits der Bulla befinden sich erleichtert chirurgische Eingriffe und Störungen des mittleren Ohrs während der Operation vermeidet. In der Klinik werden Semicircular Canal Operationen für unlösbar gutartiger paroxysmal positionsvertigo31,32,33, schlägt die klinischen Durchführbarkeit des Canalostomy verwendet. Da es zum ersten Mal beschrieben von Kawamoto Et al.. 16 im Jahr 2001 Canalostomy wurde verwendet, um verschiedene Reagenzien, wie virale Vektoren, SiRNA, Stammzellen und aminoglykosid, liefern in der murinen Innenohr18,19,28,29 ,34,35,36,37. Inokulation von Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren von Canalostomy zu ermöglichen, Überexpression von exogenen Gene in das sensorische Epithel und primären Neuronen der Cochlea und vestibulären Ende-Organe18,28, 29,30. Whirlin Gen-Therapie von Canalostomy stellt Balance-Funktion und verbessert die Anhörung in einem Mausmodell der menschliche Usher-Syndrom19, was darauf hindeutet, dass Canalostomy nützlich für die Studien der Gentherapie für genetische Cochleovestibular Krankheiten ist. Transplantation von mesenchymalen Stammzellen durch Canalostomy führt zu Reorganisation der Cochlea-Fibrocytes und Anhörung Erholung in einem Rattenmodell der akuten Anhörung sensorineuralem Verlust35. Darüber hinaus Canalostomy kann verwendet werden, um die Aminoglykoside ins Innenohr herstellen vestibuläre Läsionen18,34,38einführen und mehrere Injektionen durchgeführt werden können, wenn erforderlich,18 , 34.
In diesem Artikel beschreiben wir ausführlich, Canalostomy Techniken bei Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen. Wir geimpft verschiedene Reagenzien, darunter Fast-grüne Farbstoff und AAV Serotyp 8 (AAV8), zusammen mit dem grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Gen (AAV8-GFP) und Streptomycin, ins Innenohr Maus, die unmittelbaren und langfristigen Ergebnisse nach Canalostomy zu bewerten.
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Protocol
Alle Verfahren und tierischen Operationen wurden nach den Richtlinien des Animal Care und Verwendung der medizinischen Universität Chinas Hauptstadt durchgeführt.
1. Gerät Vorbereitungen
- Um die Injektionskanüle (Abbildung 1A) zu machen, verbinden Polyimid-Schlauch (Innendurchmesser 114,3 µm, Außendurchmesser 139,7 µm, Länge ~ 3 cm), Polyethylen-Rohre (Innendurchmesser 280 µm, Außendurchmesser 640 µm, Länge ~ 40 cm). Verwendung von Sekundenkleber versiegeln Sie die Verbindung mit mindestens drei Anwendungen. Die Injektionskanüle mit Ethylenoxid sterilisiert.
Hinweis: Wenn Sie den Schlauch zu versiegeln, hindern Sie den Sekundenkleber Polyimid-Schlauch, der zu einer Verstopfung der Kanüle führen kann. Versiegeln Sie die Schläuche an mindestens dreimal da Gassterilisation Leckage an der Verbindung führen kann. - Mit einer 30 G-Nadel, verbinden Sie das Ende der Polyethylen-Schläuche eine 1 cc-Spritze mit normalen Kochsalzlösung. Füllen Sie die Kanüle mit normalen Kochsalzlösung durch Injektion mit der 1-cc Spritze für Leckage oder Blockade an der Verbindung zwischen Polyimid-Schläuche und Rohre aus Polyethylen zu überprüfen.
Hinweis: Wenn ein Leck oder eine Blockade der Verbindung vorhanden ist, kann die Kanüle in den folgenden Verfahren verwendet werden. - Evakuieren Sie 10 µL Mikro-Spritze mit normalen Kochsalzlösung zu und verbinden Sie es mit der oben genannten 30 G-Nadel mit der Injektionskanüle. Installieren Sie die Mikro-Spritze auf einer Mikroinjektion Pumpe (Abbildung 1 b). Legen Sie die Einspritzgeschwindigkeit auf 0,5 µL/min und die Lautstärke auf 1 µL für schnell-grüne Farbstoff und AAV8-GFP oder 2 µL für Streptomycin.
Hinweis: Der empfohlene Bereich der Einspritzgeschwindigkeit ist 0.1−0.5 µL/min, und des empfohlenen Bereichs von Injektionsvolumen ist 0.5−2 µL. - Die Mikro-Spritze, 1 µL zurückziehen und die Injektion-Reagenz zu extrahieren. Ein Luftspalt bilden zwischen den normalen Kochsalzlösung und das eingespritzte Reagenz (Abbildung 1).
- Gegebenenfalls beschriften Sie die Position des Gas-Flüssigkeit-Rahmens an den Polyethylen-Schlauch mit einem Filzstift. Dies kann zur Reagenz Informationsfluss während der Injektion zu überwachen.
2. Canalostomy bei Erwachsenen Mäusen
- Erwachsenen Mäuse zu betäuben (weiblich, FVB/N, 5 bis 6 Wochen alten) durch intraperitoneale Injektion von Ketamin HCl (120 mg/kg) und Xylazin HCl (7 mg/kg). 5−10 min. warten Sie, bis das Tier keine Reaktion auf schmerzhafte Reize (die Zehe-Prise Reflex zeigt). Legen Sie das Tier auf einem vorgeheizten Elektro Pad nach der Narkose. Analgetikum, Meloxicam (1 mg/kg), wurde vor der Operation subkutan angewendet.
- Das Tier Augen mit Augensalbe zu decken. Die linken Post-auricular Region mit einer elektrischen Tier Haarschneidemaschine rasieren und Desinfizieren der Haut dreimal mit 75 % Ethanol.
- Legen Sie das Tier auf einem vorgeheizten Elektro Pad. Stellen Sie die Temperatur des elektrischen Pads ~ 37° c. Legen Sie das Tier in der rechten Seitenlage, Operation am linken Ohr zu erleichtern.
- Einen 1-1,5 cm Post-auricular Einschnitt ~ 3 mm von der linken retroaurikulärer Nut (Abbildung 2A) machen.
- Positionierung der hinteren Semicircular (PSC) und seitlichen Semicircular Kanal (LSC): Wenn die Wurzel der Pinna (Fett Punkt in Abb. 2 b) als der Ursprung und die Ebene, die parallel zu den Calvarium wie 3 bis 09:00 definiert ist, die PSC und der LSC sind in der Regel Das Hotel liegt ca. 3 mm aus der Wurzel der Pinna 2 bis 03:00 (Abb. 2 b).
- Unverblümt sezieren des Muskels über das Felsenbein mit Mikro-Pinzetten, die PSC und LSC, deren Ränder deutlich sichtbar als dunkle Streifen im Felsenbein (Abbildung 2 sind). Der LSC ist eine ca. 30° Winkel von der Ebene, die parallel zu den Calvarium und die PSC ist senkrecht zur LSC (Abbildung 2). Ein kleines Stück des Muskels mit Mikro-Pinzetten zu sammeln und trocknen lassen. Im folgenden Schritt wird dieser Muskel verwendet werden, um das Loch zu versiegeln.
Hinweis: Vermeiden Sie übermäßige reißen des Gewebes zu Verletzungen an Muskeln zu minimieren. Beschädigung der angrenzenden Schiffs beim PSC (Abb. 2D) offenlegen zu vermeiden. - Machen Sie ein kleines Loch im mittleren Teil des PSC mit einer 26 G-Nadel (Abb. 2D). Flüssiges durchsickern durch das Loch zeigt erfolgreiche Marktdurchdringung der knöchernen Wand des PSC. Vergrößern Sie das Loch auf eine geeignete Größe, etwas größer als der Durchmesser des Schlauches Polyimid.
Hinweis: Bohren und das Loch zu vergrößern, sanft und allmählich, Fraktur des PSK zu vermeiden. - Reinigen Sie den Erguss rund um das Loch mit einem wattepellet PSC.
- Legen Sie die Spitze der Polyimid-Schlauch sanft in das PSK in Richtung der Crus Commune bis zu einer Tiefe von 1−2 mm (Abb. 2E). Starten Sie die Injektion durch Drücken der Schaltfläche "ausführen" an der Pumpe.
- Warten Sie nach der Injektion ~ 2 min um das Reagenz zu verbreiten zu ermöglichen. Schneiden Sie das kleine Stück des Muskels in Schritt 2.6 mit Mikro-Schere gesammelt. Als Nächstes entfernen Sie die Injektionskanüle und sofort den Muskel in das Loch in der PSK.
Hinweis: Überprüfen Sie jede Flüssigkeit Austritt aus dem Loch nach dem Einstecken um sicherzustellen, dass das Loch vollständig abgedichtet ist. - Die getrennten Muskeln und subkutane Gewebe zurück. Naht der Schnitt mit einer 5-0-Naht. Die Schnitt-Region mit Povidon-Jod zu desinfizieren.
Hinweis: Alle oben genannten chirurgischen Eingriffe dauern ca. 25 Minuten. - Positionieren Sie das Tier auf einer elektrischen Pad auf ~ 37 ° c vorgewärmt Legen Sie das Tier in der rechten Seitenlage für Erholung.
- Auditory Brainstem Response (ABR) Messungen und Tests eine Woche nach der Operation18schwimmen.
- Bei Bedarf führen Sie wiederholte Injektionen in einen anderen Bereich des PSC oder LSC.
3. Canalostomy bei Neugeborenen Mäusen
- Verwenden Sie Unterkühlung zu induzieren und Sedierung bei Neugeborenen Mäusen (FVB/N) an postnatalen Tagen 1 bis 2 (P1-2) zu erhalten. Ort der Welpe auf einem Wrap-Kunststoffummantelter crushed Ice für ~ 4 min. Als nächstes legen Sie die Welpen auf einer Plattform mit Eis gefüllt. Desinfizieren Sie das OP-Feld dreimal mit 75 % Ethanol.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Welpen aus dem Eis ist. Durchführen Sie die gesamte Operation mit den Welpen auf eine eisgefüllten Plattform. - Die folgenden Schritte unterscheiden sich in der Neugeborene im Vergleich zu den Erwachsenen Mäusen.
- Machen einen ~ 3 mm postauricular Schnitt von ~ 2 mm an der Ohrmuschel Falte posterior (Abbildung 3A -B).
- Eine Öffnung in das weiche PSC mit einer 26 G-Nadel sanft zu machen. Stecken Sie die Kanüle in das PSK ohne Vergrößerung der Öffnung (Abb. 3 -E).
- Verwenden Sie nach der Injektion ein Stück des Muskels zu decken, anstatt anschließen, die Öffnung, da letztere zu einer Fraktur des weichen PSC (Abbildung 3F) führen kann.
- Schließen Sie die Haut mit einer Naht 6-0.
- ABR Messungen und Tests um P3030schwimmen.
- Elterliche Kannibalismus ist ein häufiges Problem nach neonatale Chirurgie. Die folgenden Schritte verringern die Wahrscheinlichkeit des elterlichen Kannibalismus.
- Bereinigen Sie das Blut rund um die Inzision mit Alkoholtupfer nach der Operation.
- Stellen Sie sicher, dass das Neugeborene frei bewegen kann, bevor sie an den Damm zurückgegeben.
- Schmieren Sie Neugeborene mit verschmutzte Bettwäsche von der Mutter Käfig und Ort, wo die Neugeborenen in der Mitte der Wurf zurück.
- Alle, die nicht operiert werden sollte eine ähnliche postauricular Schnitt und Naht erhalten.
- Das Männchen aus dem Zucht-Käfig zu trennen.
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Representative Results
Schnell-grüne Farbstoff wurde in der PSC von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen zu seiner unmittelbaren Quantil im Innenohr injiziert. Der Farbstoff wurde in die Cochlea, Vestibül und Bogengängen unmittelbar nach der Operation (Abbildung 4) erkannt.
Um die Sicherheit und Effizienz der Canalostomy für Innenohr-gen Lieferung zu bewerten, wurde AAV8-GFP in das Innenohr von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen injiziert. Alle Tiere ausgestellt normal ABR Schwellen und Schwimmen Testergebnisse nach AAV8-GFP Injektion18,30. Immunhistologie offenbart, dass in der auditiven sensorischen Epithel, innere Haarzellen (IHC) und ein paar äußeren Haarzellen (OHCs) der basalen Runde zeigte robuste GFP Ausdruck30. In der vestibulären sensorischen Epithel wurde GFP Ausdruck in der Utricle, Gleichgewichtsorgan und Glasphiolen30festgestellt. Vestibulären Haarzellen (Abbildung 5) und Stützzellen waren mit hohem Wirkungsgrad18,30ausgestrahlt.
Infusion von Streptomycin durch Canalostomy induziert schwere Haarzelle Verlust in der Utricle18,34,38. Um die Machbarkeit der Mehrfacheinspritzung über Canalostomy zu testen, bekamen Mäuse Streptomycin durch die LSC 7 Tage später folgten AAV8-GFP Suspensionen über die einheitlichen Ansprechpartner. Dieses Experiment wurde auch entwickelt, um die Transduktion Merkmale der AAV8-GLP in der lesioned Utricle, zu bewerten, was nach HC Verlust18nützlich für gentherapiestudien im Innenohr beschädigt war. GFP wurde die lesioned Utricle (Abbildung 6) verteilt. Zahlreiche GFP-positiven Zellen waren negativ für Myosin VIIA, darauf hinweist, dass sie ausgestrahlt wurden SCs. Ein paar HCs (Myosin VIIa-positiven Zellen) mit unreifen Haar Bundles ausgedrückt auch GFP.
Abbildung 1: Gerät Vorbereitung. (A) der Polyimid-Schlauch (i) und Polyethylen-Rohre (Ii) sind abgedichtet, um eine Injektion Kanüle (Iii) zu machen. (B) ist die Kanüle mit einer 10 µL Mikro-Spritze mit einer 30 G-Nadel verbunden und dann auf eine Pumpe installiert. Pfeil zeigt die Kanülenspitze. (C) Injektion Reagenz und normale Kochsalzlösung sind durch einen Luftspalt getrennt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Canalostomy in einer Erwachsenen Maus. (A) einen Post-auricular Schnitt (Pfeil). (B) Muskeln für das Felsenbein ausgesetzt sind. Wenn wir die Wurzel der Pinna (Fett Punkt) als der Ursprung und das Flugzeug definieren parallel zu den Calvarium als 3/9 Uhr, den hinteren Semicircular Kanal (PSC) und Semicircular Seitenkanal (LSC) befinden sich in der Regel im Bereich zwischen 2 und 03:00 (Pentagramm) , ~ 3 mm vom Ursprung. Einschub: niedriger Vergrößerung Bild der Orientierung. Die gepunktete Linie zeigt die Calvarium Ebene. (C) die PSC und LSC sind ausgesetzt (gestrichelte Linien). Einschub: Der LSC ist eine ca. 30° Winkel von der Ebene, die parallel zu den Calvarium und die PSC ist senkrecht zu der LSC. (D) ein kleines Loch ist das PSK ernannt. (E) die Spitze der Kanüle in das PSK eingefügt wird, und das Reagenz wird eingespritzt. (F) das Loch wird mit einem kleinen Stück des Muskels versiegelt. Maßstabsleiste a beträgt 5 mm, die in B 1 mm (B für B-F), ist das im Einschub b ist 1 cm, und zwar im Einschub bis C 5 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Canalostomy in einer Neugeborenen Maus. (A) einen Post-auricular Schnitt (Pfeil). (B) Muskeln für das Felsenbein ausgesetzt sind und der hinteren Semicircular Kanal (PSK) ist ~ 2 mm aus der Wurzel der Ohrmuschel (Fett Punkt) an 2-03:00 (Pentagramm). Die Ausrichtung ist identisch mit dem bei Erwachsenen Mäusen (Abb. 2 b). (C) die PSC und Semicircular Seitenkanal (LSC) sind ausgesetzt (gestrichelte Linien). (D) eine kleine Öffnung erfolgt in der PSK. (E) die Kanüle wird in die PSC eingefügt. (F) ein kleines Stück des Muskels wird verwendet, um die Öffnung nach der Injektion zu decken. Bars in A und B Einschub sind 5 mm, das in B 1 mm, und ist in C 1 mm (C für C-F) zu skalieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: mikroskopische Stereobilder der inneren Ohren von Erwachsenen (A-A') und Neugeborenen Mäusen (B-B') verwaltet Fast-grüne Farbstoff über Canalostomy. Proben wurden unmittelbar nach der Operation entnommen. (A und B) Die extrakraniellen Oberfläche. (A' und B') Die intrakranielle Oberfläche. Schnell-grüne Farbstoff verteilt in die Cochlea, Vestibül und Bogengängen. Maßstabsleisten sind 1 mm (A' für A-A 'und B' B-b'). PSC, posterior Semicircular Kanal. LSC, Semicircular Seitenkanal. SSC, überlegene Semicircular Kanal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Repräsentative konfokale Bilder von ganzen Halterungen der Cochlea (A-A") und Utricle (B-B") von Erwachsenen Mäusen vorbereitet 30 Tage nach der Injektion der AAV8-GFP über Canalostomy. Proben werden mit Antikörpern für GFP (grün) und Myosin VIIa (rot) gefärbt. (A-A ") GFP drückt sich in die inneren Haarzellen (IHC). (B-B ") Die Fokalebene der kutikulären Platte von der Utricle zum Ausdruck bringen zahlreiche Haarzellen GFP (Pfeile). GFP, grün fluoreszierende Protein. OHC, äußeren Haarzellen. Maßstabsleisten sind 25 µm (A"für A-A", B "für B-B"). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Repräsentative konfokale Bilder von traumatisierten Utricle erhalten 30 Tage nach der Injektion der AAV8-GFP über Canalostomy. Erwachsener Mäuse injiziert wurde mit Streptomycin über den Seitenkanal Semicircular und 7 Tage später über den hinteren Semicircular Kanal mit AAV8-GFP injiziert. GFP (grün), VIIa (rot) Myosin und Aktin (blau). Pfeilspitzen zeigen repräsentative Stützzellen ausgestrahlt mit AAV8-GFP (GLP + / Myosin VIIa-Zellen), und Pfeile zeigen repräsentative Haarzellen mit AAV8-GFP ausgestrahlt (GLP + / Myosin VIIa +-Zellen) mit unreifen Haar Bundles. Maßstabsleiste beträgt 20 µm (D für A-D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In dieser Studie haben wir gezeigt, dass Medikamentenabgabe durch Canalostomy weite Verbreitung des Reagens in der Cochlea und vestibulären Ende-Organe geführt. Als ein Innenohr gen Versandart führte Canalostomy GFP Ausdruck in den inneren Ohren von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen mit minimalschaden Hör- und vestibulären Funktion. Darüber hinaus können mehrere Injektionen im gleichen Tier einfach durchgeführt werden.
Eine der größten Stärken des Canalostomy ist, dass es minimal Innenohr Funktion, vor allem bei Erwachsenen Mäusen16,18,28,29,30, schädigt die für bedeutsam ist die Beurteilung der Schutzwirkung und für translationale Aspekte. Mehrere Gruppen haben Canalostomy verwendet, um verschiedene Reagenzien, wie virale Vektoren, SiRNA, Stammzellen und aminoglykosid, in der murinen Innenohr18,19,28,29zu liefern, 34,35,36,37. In der aktuellen Studie beschrieben wir Schritt für Schritt, detaillierte chirurgische Techniken der Canalostomy bei Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen. Im Vergleich zu früheren Studien, enthält unsere Studie weitere Details über die Positionierung von Bogengängen, das ist eine wichtige Verfahren für eine erfolgreiche Operation. Wie in Abbildung 2 b und C, waren PSC und LSC in der Regel befindet sich ca. 3 mm aus der Wurzel der Ohrmuschel bei 2-03:00. Der LSC war ein ca. 30° Winkel von der Ebene, die parallel zu den Calvarium und das PSC war senkrecht zu der LSC. Darüber hinaus wir der chirurgischen Verfahren vereinfacht und verkürzt die OP-Dauer ca. 25 min mit vergleichbaren Ergebnissen29.
Während der Canalostomy ist es unerlässlich, die Leckage an der Injektionsstelle und Verstopfung der Kanüle zu vermeiden. Vor dem Einschalten der Pumpe, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Spitze der Kanüle in den Semicircular Kanal eingelegt ist und dass die Kanüle nicht verbogen oder blockiert ist. Trockene Muskelmasse wird empfohlen, die verwendet werden, wenn das Loch im Semicircular Kanal Erwachsener Mäuse zu versiegeln, weil im Beisein von Semicircular Kanal Flüssigkeit, es erweitert und das Loch stopfen (siehe Schritte 2,6 und 2.10). Da die Wand des Kanals von Neugeborenen Mäusen Semicircular weich und zerbrechlich ist, sollte die Öffnung durch das Decken mit autogenen Muskel- oder medizinische Kleber30versiegelt werden. Wir entfernt auch die Kanüle ohne Abdeckung der Öffnung mit Muskel; die Ergebnisse ergab vergleichbare AAV Transduktion Effizienz im Innenohr (Daten nicht gezeigt), darauf hinweist, dass die Öffnung in der PSC von Neugeborenen Mäusen zufriedenstellend geschlossen wurde.
Ein weiterer Vorteil des Canalostomy ist die Machbarkeit von mehreren Verfahren, wodurch sich wiederholende Anwendungen der gleichen oder unterschiedlichen Reagenzien (Abbildung 6). Da fibrotische und Granulation Geweben findet man häufig auf Websites mit früheren chirurgischen und Semicircular Kanal kann nach der Operation34behindert werden, es empfiehlt sich, während wiederholte Operationen in einem anderen Bereich der seitlichen Injektionen durchführen und/oder hinteren Bogengängen18.
Die wichtigste Einschränkung der Canalostomy ist die Schwierigkeit bei der Feststellung, ob die Injektionskanüle in den perilymphatic oder endolymphatic Raum eingefügt wird. Nach der Verabreichung von adenovirale Vektoren in das Innenohr16 über Canalostomy befanden sich die meisten ausgestrahlt Zellen im perilymphatic Raum, was darauf hindeutet, daß die Injektion in diesem Bereich durchgeführt dürfte. Niedermolekulare Verbindungen (z. B. AAV, Streptomycin und SiRNA) können die Barriere zwischen der Perilymphe und Endolymphe durchlaufen und erreichen das sensorische Epithel nach Injektion in die perilymphatic oder endolymphatic Raum18,19 ,34. Jedoch können nach Injektion in die Perilymphe, Reagenzien im perilymphatic Raum bleiben, wenn sie nicht die Barriere zwischen der Perilymphe und Endolymphe16,39,40durchdringen können. Daher sollte die Durchlässigkeit der injizierten Reagenzien vor mit Canalostomy berücksichtigt werden.
Zusammenfassend ergibt sich Canalostomy in eine breite Verteilung der Reagenzien in der Cochlea und Vorraum mit minimaler Störung des Hörvermögens und vestibulären Funktion. Die Operation wird bei Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen leicht implementiert, und mehrere Verfahren können bei Bedarf durchgeführt werden. Canalostomy ist somit ein effektives und sicheres Ansatz für Drug-Delivery in das Innenohr von Nagetieren und, in der Zukunft verwendet werden klinisch zur Behandlung von Krankheiten des menschlichen Cochleovestibular.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte werden erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummern 81570912, 81771016, 81100717) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
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