Summary
Aqui descrevemos o procedimento canalostomy, que permite a entrega de drogas local para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatais através do canal semicircular com danos mínimos para a função auditiva e vestibular. Esse método pode ser usado para inocular vetores virais, fármacos e moléculas pequenas para o ouvido interno do rato.
Abstract
Entrega local de drogas terapêuticas para o ouvido interno é uma terapia promissora para as doenças do ouvido interno. Injeção por meio de canais semicirculares (canalostomy) tem demonstrada ser uma abordagem útil para entrega de drogas para o ouvido interno. O objetivo deste artigo é descrever, detalhadamente, as técnicas cirúrgicas envolvidas no canalostomy em camundongos adultos e Neonatais. Como indicado pelo corante verde-rápido e vírus adeno-associado serótipo 8 com o gene da proteína verde fluorescente, o canalostomy facilitou a ampla distribuição dos reagentes injetados na cóclea e vestibulares final-órgãos com o mínimo de danos à audição e função vestibular. A cirurgia foi implementada com sucesso em camundongos adultos e Neonatais; na verdade, múltiplas cirurgias podem ser feitas se necessário. Em conclusão, a canalostomy é uma abordagem eficaz e segura para a entrega da droga para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatais e pode ser usado para tratar doenças da orelha interna humana no futuro.
Introduction
Neurossensorial de audição, perda e afetam disfunção vestibular um número substancial de pacientes e estão intimamente associados com transtornos do ouvido interno. Entrega de drogas terapêuticas para o ouvido interno mostra a promessa para o tratamento de distúrbios do ouvido interno. Uma abordagem sistêmica ou local pode ser usada para entregar drogas para o ouvido interno. Algumas doenças do ouvido interno são tratadas com sucesso com administração de drogas sistêmicas, tais como perda de audição súbita idiopática, que é geralmente tratada com esteroides sistêmicos1. Além disso, Lentz et al mostrou que a administração sistémica do oligonucleotide antisentido foi capaz de melhorar a audição e equilibrar as funções no modelo do rato mutante Ush1c2. No entanto, grande parte das doenças do ouvido interno não são efetivamente tratados pela administração de drogas sistêmicas por causa da barreira sangue-labirinto, o que limita o acesso de drogas para o ouvido interno3,4. Em contraste, estratégias de entrega de droga local podem tratar distúrbios de ouvido interno com mais eficiência. Com efeito, o ouvido interno é potencialmente um alvo ideal para a entrega da droga local; está cheio de líquido, que facilita a disseminação da droga após a difusão de um site ou injeção, e é relativamente isolado de órgãos vizinhos, que limita os efeitos colaterais de5,6.
Estratégias de entrega de droga local incluem intratimpânica e intralabyrinthine métodos. A eficácia da via intratimpânica baseia-se em grande parte na permeabilidade da droga através da membrana da janela redonda (RWM) e o tempo de permanência da droga no RWM3,4,7,8. Assim, não é apropriado para a entrega de drogas ou reagentes que não podem penetrar a RWM. Intralabyrinthine métodos envolvem a inoculação de drogas diretamente para o ouvido interno, resultando em uma dose alta e ampla distribuição. No entanto, intralabyrinthine métodos requerem cirurgias delicadas e são invasivos, levando a danos à função do ouvido interno. Atualmente, a injeção intralabyrinthine de drogas é usada apenas em estudos com animais, como não tem sido demonstrado ser suficientemente seguro para uso em seres humanos9. Portanto, os procedimentos cirúrgicos devem ser simplificados e reduzir o risco de lesão para traduzir intralabyrinthine abordagens para a clínica.
Várias abordagens intralabyrinthine foram avaliadas em animais por injeção através a RWM5,10,11 e no scala mídia12,13,14, a scala tympani 15 , 16, o scala vestíbulo17, os canais semicirculares16,18,19,20e o saco endolinfático21. Cada uma destas abordagens tem vantagens e desvantagens6. Entrega através do RWM é atraumática em ratos neonatal5,22. No entanto, uma perda auditiva leve é observada em ratos adultos após injeção RWM23, possivelmente devido à efusão do ouvido médio após a cirurgia,24. Injeção de mídia Scala, que envolve a injeção do reagente diretamente para o espaço endolinfático que contém o epitélio sensorial, alcança uma concentração alta de reagente no destino final-órgãos12,14, 25 , 26. no entanto, essa abordagem requer um procedimento complexo e resulta em significativa elevação do limiar da audição, se realizada, o mais tardar dia pós-natal 5 (P5)25,27, que limita a sua aplicação.
Em comparação com as abordagens intralabyrinthine acima mencionadas, canalostomy provoca danos mínimos para o ouvido interno, especialmente em ratos adultos16,18,28,29,,30, que é importante para a avaliação dos efeitos protetores e aspectos translacionais. Além disso, em roedores, os canais semicirculares estão localizados além o bulla, que facilita os procedimentos cirúrgicos e evita perturbações do ouvido médio durante a cirurgia. Na clínica, canal semicircular cirurgias são utilizadas para vertigem posicional paroxística benigna intratável31,32,33, sugerindo a viabilidade clínica de canalostomy. Desde que foi primeiramente descrito por Kawamoto et al. 16 em 2001, canalostomy tem sido usado para entregar vários reagentes, tais como vetores virais, siRNA, células-tronco e aminoglicosídeos, em murino ouvido interno18,19,28,29 ,34,35,36,37. Inoculação de vetores de vírus adeno-associado (AAV) por canalostomy habilitar a superexpressão de genes exógenos no epitélio sensorial e neurônios primários da cóclea e extremidade-órgãos vestibular18,28, 29,30. Whirlin terapia genética pelo canalostomy função de equilíbrio e melhora a audição em um modelo do rato do humano Usher síndrome19, sugerindo que canalostomy é útil para estudos de terapia gênica para doenças genéticas cochleovestibular. Transplante de células-tronco mesenquimais por canalostomy resulta na reorganização de fi coclear e recuperação de audiência em um modelo do rato de perda de audição neurossensorial aguda35. Além disso, canalostomy pode ser usado para introduzir os aminoglicosídeos no ouvido interno estabelecer lesões vestibulares18,34,38, e múltiplas injeções podem ser realizadas se necessário18 , 34.
No presente artigo, descrevemos, em detalhe, as técnicas de canalostomy em camundongos adultos e Neonatais. Nós inoculado vários reagentes, incluindo tintura verde-rápido e sorotipo AAV 8 (AAV8), juntamente com o gene da proteína verde fluorescente (GFP) (AAV8-GFP) e estreptomicina, no ouvido interno para avaliar os resultados imediatos e a longo prazo após a canalostomy do mouse.
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Protocol
Todos os procedimentos e cirurgias de animais foram conduzidas de acordo com as orientações do Comité de uso da universidade médica da China Capital e cuidado Animal.
1. dispositivo preparações
- Para tornar a cânula de injeção (figura 1A), conecte o tubo de poliimida (µm de diâmetro 114.3, µm de diâmetro externo 139,7, comprimento ~ 3cm) para tubos de polietileno (µm de diâmetro interno, 280, µm de diâmetro externo 640, comprimento ~ 40 cm). Usando cola, feche a conexão pelo menos três aplicações. Esterilize a cânula de injeção com óxido de etileno.
Nota: Quando a vedação da tubulação, impedir que a supercola entre a tubagem de poliimida, que pode resultar em um bloqueio da cânula. Sele a tubulação pelo menos três vezes, porque a esterilização por gás pode causar vazamento a conexão. - Usando uma agulha 30G, ligue a extremidade do tubo de polietileno para uma 1 cc seringa contendo soro fisiológico normal. Encha a cânula com solução salina normal por injeção com seringa 1-cc para verificar se há qualquer vazamento ou obstrução na conexão entre os tubos de polietileno e tubos de poliimida.
Nota: Se houver um vazamento ou uma obstrução da conexão, a cânula não pode ser usada nos procedimentos a seguir. - Evacuar uma microseringa de 10 µ l com solução salina normal e conectá-lo na agulha 30G acima mencionados com a cânula de injeção. Instale a microseringa em uma bomba de microinjeção (figura 1B). Defina a velocidade de injeção para 0,5 µ l/min e o volume a 1 µ l de corante verde-rápido e AAV8-GFP, ou 2 µ l de estreptomicina.
Nota: O intervalo recomendado de velocidade de injeção é 0.1−0.5 µ l/min, sendo o intervalo recomendado de volume de injeção 0.5−2 µ l. - Recuar a microseringa de 1 µ l e extrair o reagente de injeção. Forma a um espaço de ar entre o soro e o reagente injetado (Figura 1).
- Opcionalmente, rotule a posição da borda de gás-líquido do tubo de polietileno, usando uma caneta marcador. Isso pode ser usado para monitorar o fluxo de reagente durante a injeção.
2. Canalostomy em ratos adultos
- Anestesiar um rato adulto (feminino, FVB/N, 5 a 6 semana de idade) por injeção intraperitoneal de ketamina HCl (120 mg/kg) e xilazina HCl (7 mg/kg). Espere por 5−10 min até o animal exibe sem resposta a estímulos dolorosos (o reflexo do dedo do pé-pitada). Coloque o animal em uma almofada elétrica pré-aquecido após a anestesia. Um analgésico, Meloxicam (1 mg/kg), foi aplicado por via subcutânea, antes da cirurgia.
- Cubra os olhos do animal com pomada. Raspar a região pós-auricular esquerda com uma tosquiadeira elétrica animal e desinfectar a pele três vezes com 75% de etanol.
- Coloque o animal em uma almofada elétrica pré-aquecido. Regule a temperatura da almofada elétrica ~ 37° c. Coloque o animal na posição lateral direita para facilitar a cirurgia na orelha esquerda.
- Faça uma incisão de 1-1,5 cm pós-auricular ~ 3 mm do sulco retroauricular esquerda (Figura 2A).
- Posicionamento do canal semicircular posterior (PSC) e o canal semicircular lateral (LSC): quando a raiz do pinna (ponto em negrito na Figura 2B) é definida como a origem e o plano paralelo a calvária como 3 09:00, o PSC e o LSC são tipicamente localizado ~ 3 mm da raiz o pavilhão auricular entre 2 e 03:00 (Figura 2B).
- Sem rodeios, disse o músculo cobrindo o osso temporal com micropinça para expor o PSC e LSC, cujas margens são claramente visíveis como listras escuras no osso temporal (Figura 2). A LSC está em um ângulo de aproximadamente 30° desde o plano paralelo a calvária e o CPS é vertical para a LSC (Figura 2). Coletar um pequeno pedaço de músculo com microfórceps e deixe secar. Na etapa seguinte, esse músculo será usado para selar o buraco.
Nota: Evite excessiva arrancamento de tecidos para minimizar danos aos músculos. Evite danificar o navio adjacente ao expor o PSC (Figura 2D). - Faça um pequeno furo na porção média do PSC usando uma agulha 26G (Figura 2D). Vazamento de fluido através do orifício indica penetração bem sucedida da parede óssea do PSC. Alargar o buraco de um tamanho adequado, ligeiramente maior que o diâmetro do tubo de poliimida.
Nota: Perfurar e alargar o buraco suavemente e gradualmente para evitar a fratura do PSC. - Limpe o derrame que cercam o buraco do PSC usando uma bola de algodão.
- Insira a ponta do tubo de poliimida suavemente no CPS em direção a uma profundidade de 1−2 mm (Figura 2E), comuna francesa da crus. Inicie a injeção pressionando o botão 'run' na bomba.
- Após a injeção, espere ~ 2 min para permitir que o reagente espalhar. Apare o pequeno pedaço de músculo coletado na etapa 2.6 com microtesoura. Em seguida, remover a cânula injeção e colocar imediatamente o músculo no furo do PSC.
Nota: Verifique qualquer líquido vazando do buraco depois de ligar para garantir que o buraco está completamente selado. - Retorne a separado os músculos e tecidos subcutâneos. Sutura da incisão utilizando uma sutura de 5-0. Desinfete a região da incisão com iodopovidona.
Nota: Todos os procedimentos cirúrgicos acima leva cerca de 25 min. - Posicionar o animal em uma almofada elétrica pré-aquecida ~ 37 ° c. Coloque o animal na posição lateral direita para recuperação.
- Executar medidas de resposta (ABR) auditivo no tronco cerebral e natação testes uma semana após a cirurgia de18.
- Se necessário, execute injeções repetidas em uma área diferente do PSC ou LSC.
3. Canalostomy em ratos Neonatal
- Use a hipotermia para induzir e manter sedação em camundongos neonatais (FVB/N) no pós-natal dias 1 e 2 (P1-2). Coloque o filhote em uma cama de plástico envoltório-coberto de gelo triturado para ~ 4 min. Em seguida, coloque o filhote em uma plataforma cheia de gelo. Desinfecte o campo cirúrgico três vezes com 75% de etanol.
Nota: Certifique-se que a cabeça do filhote está fora do gelo. Realizar a cirurgia inteira com o filhote em uma plataforma cheia de gelo. - Os passos seguintes diferem em recém-nascido em comparação com os ratos adultos.
- Fazer uma incisão postauricular ~ 3 mm de ~ 2 mm posterior para o vinco auricular (Figura 3A -B).
- Suavemente, fazer uma abertura no CPS macio usando uma agulha 26G. Inserir a cânula do PSC sem ampliar a abertura (Figura 3 -E).
- Após a injeção, use um pedaço de músculo para cobrir, ao invés de ligar, a abertura como o último pode levar a uma fratura do PSC macio (Figura 3F).
- Feche a pele usando uma sutura de 6-0.
- Realizar medições de ABR e natação P3030testes.
- Canibalismo dos pais é um problema comum após cirurgia neonatal. As etapas a seguir reduzem a probabilidade de canibalismo parental.
- Limpe o sangue ao redor da incisão com toalhetes com álcool após a cirurgia.
- Certifique-se de que o recém-nascido pode mover-se livremente antes de retorná-lo para a represa.
- Smear neonatos com roupa de cama suja da gaiola da mãe e coloque de volta os recêm-nascidos no meio da ninhada.
- Qualquer um que não se submeter à cirurgia devem receber uma semelhante postauricular incisão e sutura.
- Separe o macho da gaiola reprodução.
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Representative Results
Corante verde-rápido foi injetado o PSC de ratos adultos e Neonatais para avaliar sua distribuição imediata no ouvido interno. O corante foi detectado ao longo da cóclea, vestíbulo e canais semicirculares imediatamente após a cirurgia (Figura 4).
Para avaliar a segurança e a eficiência de canalostomy para a entrega do gene de orelha interna, AAV8-GFP foi injetado no ouvido interno de ratos adultos e Neonatais. Todos os animais exibiram limiares ABR normal e os resultados dos testes de natação após AAV8-GFP injeção18,30. Immunohistology revelou que, no epitélio sensorial auditivo, células ciliadas interiores (IHCs) e alguns exteriores cabelo células (OHCs) da curva basal mostrou robusto GFP expressão30. No epitélio sensorial vestibular, expressão de GFP foi detectado no utrículo, saccule e Ampollas30. Ambas as células ciliadas vestibulares (Figura 5) e células apoio foram transfectadas com alta eficiência18,30.
Infusão de estreptomicina por canalostomy induz a perda de células de cabelo severa no utrículo18,34,38. Para testar a viabilidade de múltiplas injecções através de canalostomy, ratos receberam estreptomicina através da LSC seguida mais tarde 7 dias suspensões AAV8-GFP através do PSC. Esta experiência também foi projetada para avaliar as características de transdução da AAV8-GFP no lesado utrículo, que foi útil para estudos de terapia de gene na orelha interna danificada após perda HC18. GFP foi distribuído o utrículo lesado (Figura 6). Numerosas células GFP-positivos foram negativas para miosina VIIA, indicando que eles foram transformados SCs. Alguns HCs (células de miosina VIIa-positivo) com pacotes de cabelo imaturos também expressaram GFP.
Figura 1: preparação do dispositivo. (A) o tubo de poliimida (i) e os tubos de polietileno (ii) são selados para tornar-se uma cânula de injeção (iii). (B) a cânula é conectada a uma microseringa de 10 µ l com uma agulha de 30g e em seguida, instalada em uma bomba. A seta indica a ponta da cânula. (C) o reagente de injeção e soro fisiológico normal são separados por um espaço de ar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Canalostomy em um rato adulto. (A) uma incisão pós-auricular (seta). (B) os músculos que cobrem o osso temporal são expostos. Se nós definimos a raiz do pinna (ponto negrito) como a origem e o plano paralelo a calvária como 3/9 horas, o canal semicircular posterior (PSC) e canal semicircular lateral (LSC) geralmente estão localizadas na região entre 2 e 03:00 (pentagram) , ~ 3 mm na origem. Baixo-relevo: inferior-ampliação imagem da orientação. A linha pontilhada indica o avião de calvária. (C) o PSC e LSC são expostas (linhas pontilhadas). Baixo-relevo: A LSC está em um ângulo de aproximadamente 30° desde o plano paralelo a calvária e o CPS é vertical para a LSC. (D) um pequeno buraco é feito no CPS. E a ponta da cânula é inserida o PSC e o reagente é injetado. (F) o buraco é selado com um pequeno pedaço de músculo. Barra de escala em lá é 5 mm, que em B é de 1 mm (B para B-F), na inserção de B é de 1 cm, e no baixo-relevo de C é 5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Canalostomy em um rato neonatal. (A) uma incisão pós-auricular (seta). (B) são expostos os músculos que cobrem o osso temporal, e o canal semicircular posterior (PSC) é ~ 2 mm da raiz o pavilhão auricular (ponto em negrito) em 2-03:00 (pentagrama). A orientação é idêntica em ratos adultos (Figura 2B). (C) o PSC e canal semicircular lateral (LSC) são expostas (linhas pontilhadas). (D) uma pequena abertura feita em CPS. E a cânula é inserida o PSC. (F) um pequeno pedaço de músculo é usado para cobrir a abertura após a injeção. Escala de barras na e B inserir são 5 mm, que em B é de 1 mm, e que em C é 1 mm (C para C-F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagens microscópicas estéreo das orelhas interna de adulto (um ') e ratos neonatais (B-B') administrado corante verde-rápido através de canalostomy. As amostras foram coletadas imediatamente após a cirurgia. (A e B) A superfície extracranianas. (A' e B') A superfície intracraniana. Corante verde rápido-distribui ao longo da cóclea, vestíbulo e canais semicirculares. Barras de escala são 1 mm (A' para um 'e 'B para B-B'). PSC, canal semicircular posterior. LSC, lateral canal semicircular. CCD, canal semicircular superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: imagens confocal representativas de toda monta da cóclea (A-A") e utrículo (B-B") de ratos adultos, preparado 30 dias após a injeção de AAV8-GFP através de canalostomy. Amostras são coradas com anticorpos de GFP (verde) e miosina VIIa (vermelhas). (Um) " GFP é expressa em células ciliadas mais internas (IHC). (B-B ") No plano focal da placa cuticular do utrículo, numerosas células ciliadas express GFP (setas). GFP, proteína verde fluorescente. OHC, exterior de células ciliadas. Barras de escala são 25 µm (A"para um", B "para B-B"). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: imagens confocal representativas de um traumatizado utrículo obtidos 30 dias após a injeção de AAV8-GFP através de canalostomy. Um rato adulto foi injetado com estreptomicina via 7 dias mais tarde, injetados com AAV8-GFP através do canal semicircular posterior e lateral canal semicircular. GFP (verde), miosina VIIa (vermelho) e actina (azul). Setas indicam representante apoio células transfectadas com AAV8-GFP (GFP + miosina VIIa-células), e as setas indicam representante cabelo células transfectadas com AAV8-GFP (GFP + / células de miosina VIIa +) com pacotes de cabelo imaturo. Barra de escala é de 20 µm (D para a-D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, mostramos que administração de medicamentos por canalostomy resultou em ampla distribuição do reagente ao longo da cóclea e extremidade-órgãos vestibulares. Como um método de entrega de gene do ouvido interno, canalostomy resultou na expressão de GFP no ouvido interno de ratos adultos e Neonatais com danos mínimos para função auditiva e vestibular. Além disso, injeções múltiplas podem ser facilmente executadas no mesmo animal.
Uma das maiores forças de canalostomy é que causa danos mínimos para a função do ouvido interno, especialmente em ratos adultos16,18,28,29,,30, que é significativo para a avaliação do efeito protetor e para aspectos de translação. Muitos grupos têm usado canalostomy para lançar vários reagentes, tais como vetores virais, siRNA, células-tronco e aminoglicosídeos, para o ouvido murino18,19,28,29, 34,35,36,37. No estudo atual, descrevemos passo a passo, detalhadas técnicas cirúrgicas de canalostomy em camundongos adultos e Neonatais. Comparado com estudos anteriores, nosso estudo fornece detalhes adicionais sobre o posicionamento dos canais semicirculares, que é um procedimento chave para cirurgia bem sucedida. Como mostrado na Figura 2B e C, o PSC e LSC foram localizado geralmente ~ 3 mm da raiz da pinna em 2-03:00. A LSC estava em um ângulo de aproximadamente 30° desde o plano paralelo a calvária e o PSC foi vertical para a LSC. Além disso, simplificamos os procedimentos cirúrgicos e encurtou o tempo cirúrgico para cerca de 25 min com resultados comparáveis29.
Durante a canalostomy, é imperativo evitar vazamento no local da injeção e obstrução da cânula. Antes de ligar a bomba, é importante assegurar que a ponta da cânula é inserida no canal semicircular e que a cânula não é dobrada ou bloqueada. Músculo seco é recomendado para ser usado quando a vedação do orifício do canal semicircular de ratos adultos, porque, na presença do fluido do canal semicircular, que se expande e se conecta o buraco (consulte as etapas 2.6 e 2.10). Porque a parede do canal semicircular de ratos neonatais é suave e frágil, a abertura deve ser selada por cobertura com músculo autógeno ou cola médica30. Também removemos a cânula sem cobrindo a abertura com músculo; a resultados revelados comparáveis AAV transdução eficiência na orelha interna (dados não mostrados), indicando que a abertura em CPS de ratos neonatais foi fechada satisfatoriamente.
Outra vantagem do canalostomy é a viabilidade de vários procedimentos, o que permite que aplicativos repetitivos dos reagentes iguais ou diferentes (Figura 6). Porque fibróticas e tecidos de granulação são frequentemente encontrados em sítios cirúrgicos anteriores e o canal semicircular pode ser obstruído após cirurgia,34, é aconselhável efectuar injecções durante cirurgias repetidas em uma área diferente da lateral e/ou posterior canais semicirculares18.
A principal limitação da canalostomy é a dificuldade de determinar se a cânula de injeção é inserida no espaço de peri ou endolinfático. Após a administração de vetores adenovírus para o ouvido interno16 através de canalostomy, mais células transduzidas localizavam-se no espaço Peri, sugerindo que a injeção era provável realizado nessa área. Compostos de baixo peso molecular (por exemplo, vírus adeno-associados, estreptomicina e siRNA) podem passar através da barreira entre a perilinfa e endolinfa e alcançar o epitélio sensorial após a injeção o espaço endolinfático ou peri de18,19 ,34. No entanto, após a injeção para a perilinfa, reagentes podem permanecer no espaço peri se eles não podem penetrar a barreira entre a perilinfa e endolinfa16,39,40. Portanto, a permeabilidade dos reagentes injetados deve ser considerada antes de usar canalostomy.
Em conclusão, canalostomy resulta em uma ampla distribuição de reagentes na cóclea e vestíbulo com o mínimo de perturbação da função auditiva e vestibular. A cirurgia é facilmente implementada em camundongos adultos e Neonatais, e vários procedimentos podem ser realizados, se necessário. Canalostomy é, portanto, uma abordagem eficaz e segura para a entrega da droga para o ouvido interno de roedores e pode, no futuro, ser usada clinicamente no tratamento de doenças humanas cochleovestibular.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse são declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (concessão números 81570912, 81771016, 81100717).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
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