Summary
Aquí describimos el procedimiento de canalostomy que permite la entrega del local de la droga en los oídos interiores de ratones adultos y neonatales a través del canal semicircular con mínimo daño a la función auditiva y vestibular. Este método puede utilizarse para inocular vectores virales, productos farmacéuticos y pequeñas moléculas en el oído interno de ratón.
Abstract
Entrega local de fármacos terapéuticos en el oído interno es una terapia prometedora para las enfermedades del oído interno. Inyección a través de los canales semicirculares (canalostomy) ha demostrado ser un método útil para la entrega local de la droga en el oído interno. El objetivo de este artículo es describir, detalladamente, las técnicas quirúrgicas en canalostomy en ratones adultos y neonatales. Como se indica por tinte de fast-green y virus adeno-asociado del serotipo 8 con el gen de la proteína verde fluorescente, el canalostomy facilitado amplia distribución de los reactivos inyectados en la cóclea y final-órganos vestibulares con mínimo daño a la audición y Función vestibular. La cirugía se implementó con éxito en ratones adultos y neonatales; de hecho, podrían realizarse múltiples cirugías si es necesario. En conclusión, canalostomy es un enfoque eficaz y seguro para el suministro de medicamentos en los oídos interiores de ratones adultos y neonatales y puede ser utilizado para tratar las enfermedades del oído interno humano en el futuro.
Introduction
Neurosensorial auditiva pérdida y disfunción vestibular afectan un número importante de pacientes y están estrechamente asociados con los trastornos del oído interno. Entrega de medicamentos en el oído interno muestra promisorio para el tratamiento de los trastornos del oído interno. Un enfoque sistémico o local puede utilizarse para administrar medicamentos en el oído interno. Algunas enfermedades del oído interno son tratados con éxito con medicamentos sistémicos, tales como hipoacusia súbita idiopática, que es comúnmente tratado con esteroides sistémicos1. Además, Lentz et al demostró que la administración sistémica de oligonucleótidos antisentido fue capaz de mejorar la audición y equilibrio de funciones en el ratón mutante Ush1c modelo2. Sin embargo, una gran parte de enfermedades del oído interno no son efectivamente tratadas por administración sistémica de medicamentos debido a la barrera del sangre-laberinto, que limita el acceso de drogas al oído interno3,4. En cambio, estrategias de entrega local de la droga pueden tratar trastornos del oído interno más eficiente. De hecho, el oído interno es potencialmente un objetivo ideal para la entrega local de la droga; está lleno de líquido, que facilita la difusión de la droga después de un sitio difusión o de inyección, y está relativamente aislada de órganos vecinos, que limita los efectos secundarios5,6.
Estrategias de entrega de drogas locales incluyen métodos intratimpánica y intralabyrinthine. La efectividad de la vía intratimpánica en gran parte depende de permeabilidad del fármaco a través de la membrana de ventana redonda (RWM) y el tiempo de permanencia del fármaco en el RWM3,4,7,8. Así, no es conveniente para la entrega de medicamentos o de reactivos que no pueden penetrar el RWM. Intralabyrinthine métodos implican la inoculación de drogas directamente en el oído interno, lo que resulta en una dosis alta y amplia distribución. Sin embargo, métodos intralabyrinthine requieren cirugías delicadas y son invasivos, resultando en daños a la función del oído interno. Actualmente, la inyección intralabyrinthine de drogas sólo se utiliza en los estudios en animales como se ha demostrado no ser suficientemente seguro para el uso en seres humanos9. Por lo tanto, deben simplificarse los procedimientos quirúrgicos y reducir el riesgo de lesiones para traducir intralabyrinthine enfoques en la clínica.
Varios enfoques intralabyrinthine han sido evaluados en animales por inyección a través de la RWM5,10,11 y en la scala media12,13,14, tympani del scala 15 , 16la scala portal17, los canales semicirculares16,18,19,20y el saco endolinfático21. Cada uno de estos enfoques tiene ventajas y desventajas6. A través de la RWM es atraumática en ratones neonatales5,22. Sin embargo, se observa una pérdida de audición leve en ratones adultos después a RWM inyección23, posiblemente debido a la efusión del oído medio después de la cirugía24. Inyección de medios de Scala, que consiste en la inyección del reactivo directamente en el espacio endolinfático que contiene el epitelio sensorial, alcanza una concentración de reactivo alta en destino final-órganos12,14, 25 , 26. sin embargo, este enfoque requiere un procedimiento complejo y da lugar a elevación significativa del umbral de audición si se realiza más adelante que día postnatal 5 (P5)25,27, que limita su aplicación.
En comparación con los mencionados enfoques intralabyrinthine, canalostomy causa un mínimo daño al oído interno, especialmente en ratones adultos16,18,28,29,30, que es importante para la evaluación de los efectos protectores y aspectos de translational. Además, en los roedores, los canales semicirculares están situados más allá de la bulla, que facilita los procedimientos quirúrgicos y evita perturbaciones del oído medio durante la cirugía. En la clínica, cirugías de canal semicircular se utilizan para el Vértigo posicional paroxístico benigno intratable31,32,33, lo que sugiere la viabilidad clínica de canalostomy. Desde que primero fue descrita por Kawamoto et al. 16 en 2001, canalostomy se ha utilizado para entregar diversos reactivos, tales como vectores virales, siRNA, células madre y aminoglucósidos, en el oído interno murino18,19,28,29 ,34,35,36,37. Inoculación de vectores de virus adeno-asociado (AAV) por canalostomy que la sobreexpresión de genes exógenos en el epitelio sensorial y las neuronas primarias de la cóclea y final-órganos vestibulares18,28, 29,30. Whirlin terapia génica por canalostomy restaura la función de equilibrio y mejora la audición en un modelo murino de humano Usher síndrome19, lo que sugiere que canalostomy es útil para estudios de terapia génica para enfermedades genéticas cochleovestibular. Trasplante de células madre mesenquimales por canalostomy resulta en la reorganización de fibrocitos coclear y la recuperación de la audición en un modelo de rata de pérdida de oído sensorineural aguda35. Además, canalostomy puede utilizarse para introducir aminoglucósidos en el oído interno para establecer las lesiones vestibulares18,34,38, y las inyecciones múltiples se pueden realizar si es necesario18 , 34.
En el presente artículo, se describen, en detalle, técnicas de canalostomy en ratones adultos y neonatales. Nos inocula diversos reactivos, colorante verde rápido como serotipo AAV 8 (AAV8), junto con el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) (AAV8-GFP) y la estreptomicina, en el oído interno de ratón para evaluar los resultados inmediatos y a largo plazo después de canalostomy.
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Protocol
Se realizaron todos los procedimientos y cirugías de animales según las directrices del Comité de uso de la Universidad médica de China de Capital y cuidado Animal.
1. dispositivo preparaciones
- Para hacer la cánula de inyección (figura 1A), conectar la tubería de polyimide (diámetro interno 114.3 μm, μm diámetro exterior 139,7, longitud de ~ 3 cm) a la tubería de polietileno (diámetro interno 280 μm, diámetro externo 640 μm, longitud de ~ 40 cm). Con pegamento, sella la conexión con al menos tres aplicaciones. Esterilizar la cánula de inyección con óxido de etileno.
Nota: Al sellar la tubería, evitar que el pegamento penetre en la tubería de polyimide, que puede resultar en una obstrucción de la cánula. Sellar la tubería en por lo menos tres veces, porque la esterilización con gas puede causar fugas en la conexión. - Utilizando una aguja de 30 G, conecte el extremo de la tubería de polietileno a una jeringa de 1 cc con solución salina normal. Llenar la cánula con solución salina normal por la inyección con la jeringa de 1 cc para detectar cualquier fuga o la obstrucción en la conexión entre la tubería de polyimide y tubería de polietileno.
Nota: Si hay una fuga o una obstrucción de la conexión, la cánula no puede utilizarse en los procedimientos siguientes. - Evacuar una micro-jeringa de 10 μl con solución salina normal y conéctela a la aguja de 30 G ya mencionados con la cánula de inyección. Instalar la jeringa micro en una bomba de la microinyección (figura 1B). Fije la velocidad de la inyección de 0,5 μl/min y el volumen a 1 μl de colorante verde rápido y AAV8-GFP, 2 μl de estreptomicina.
Nota: El rango recomendado de la velocidad de la inyección es 0.1−0.5 μl/min, y el rango recomendado de volumen de inyección es 0.5−2 μl. - Tire la jeringa micro a 1 μl y extraer el reactivo de inyección. Se forma un espacio de aire entre la solución salina normal y el reactivo inyectado (figura 1).
- Etiqueta opcional la posición de la frontera de gas líquido en la tubería de polietileno con un rotulador. Esto puede usarse para monitorear el flujo de reactivo durante la inyección.
2. Canalostomy en ratones adultos
- Anestesiar un ratón adulto (mujer, FVB/N, 5 a 6 semanas de edad) por inyección intraperitoneal de ketamina HCl (120 mg/kg) y xilacina HCl (7 mg/kg). Espere 5−10 min hasta que el animal no exhibe respuesta a estímulos dolorosos (el reflejo del pellizco del dedo del pie). Coloque el animal en un cojín eléctrico precalentado después de la anestesia. Analgésico, Meloxicam (1 mg/kg), fue aplicado por vía subcutánea antes de la cirugía.
- Cubrir los ojos del animal con ungüento oftálmico. Afeite la región poste-auricular izquierda con una podadoras animales eléctricas y desinfectar la piel tres veces con etanol al 75%.
- Coloque el animal en un cojín eléctrico precalentado. Ajustar la temperatura de la almohadilla eléctrica ~ 37° C. Coloque el animal en la posición de lateral derecho para facilitar la cirugía en el oído izquierdo.
- Hacer una incisión de 1-1.5 cm poste-auricular ~ 3 mm desde el surco retroauricular izquierda (figura 2A).
- Posicionamiento del canal semicircular posterior (PSC) y el canal semicircular lateral (LSC): cuando la raíz del pabellón de la oreja (puntos en negrita en la figura 2B) se define como el origen y el plano paralelo a la bóveda craneal como de 3 a 9:00, el PSC y el LSC son típicamente situado a ~ 3 mm de la raíz del pabellón de la oreja entre el 2 y 3:00 (figura 2B).
- Sin rodeos disecar el músculo que cubre el hueso temporal con micro-pinzas para exponer el PSC y LSC, cuyos márgenes son claramente visibles como bandas oscuras en el hueso temporal (figura 2). El LSC se encuentra en un ángulo de aproximadamente 30° del plano paralelo a la bóveda craneal, y el PSC es vertical al LSC (figura 2). Recoger una pequeña porción de músculo con micro-pinzas y deje que se seque. En el siguiente paso, este músculo se utilizará para sellar el agujero.
Nota: Evite el excesivo lagrimeo de los tejidos para reducir al mínimo lesión a los músculos. Evitar dañar la nave adyacente al exponer el PSC (Figura 2D). - Hacer un pequeño agujero en la parte media del PSC con una aguja de 26 G (Figura 2D). Fuga de fluido a través del orificio indica penetración acertada de la pared huesuda del PSC. Agrande el orificio a un tamaño apropiado, un poco más grande que el diámetro de la tubería de polyimide.
Nota: Perfore y agrandar el agujero suavemente y gradualmente para evitar la fractura del PSC. - Limpie el derrame que rodea el orificio del PSC con una torunda de algodón.
- Inserte suavemente la punta de la tubería de polyimide en el PSC hacia la comuna de muslo a una profundidad de 1−2 mm (Figura 2E). Iniciar la inyección pulsando el botón 'ejecutar' en la bomba.
- Después de la inyección, esperar 2 minutos para permitir que el reactivo difundir. Recorte el pedazo pequeño del músculo recogido en el paso 2.6 con micro tijeras. A continuación, retire la cánula de inyección y colocar inmediatamente el músculo en el agujero en el PSC.
Nota: Busque cualquier líquido que se escapa del agujero después de enchufar para asegurar que el orificio está completamente sellado. - Volver los músculos separados y los tejidos subcutáneos. Sutura de la incisión con una sutura 5-0. Desinfectar la región de la incisión con povidona yodada.
Nota: Todos los procedimientos quirúrgicos anteriores toman unos 25 minutos. - Coloque el animal en un cojín eléctrico precalentado a ~ 37 ° C. Coloque el animal en la posición de lateral derecho para la recuperación.
- Realizar mediciones de respuesta (ABR) auditivas del médula oblonga y nadar pruebas una semana después de la cirugía18.
- Si es necesario, realizar inyecciones repetidas en un área diferente del PSC o de LSC.
3. Canalostomy en ratones neonatales
- Uso de hipotermia para inducir y mantener la sedación en ratones neonatales (FVB/N) en los días postnatales 1 y 2 (P1-2). Colocar el cachorro sobre una cama cubierta de envoltura de plástico de granizado ~ 4 minutos. A continuación, ponga el cachorro en una plataforma de lleno de hielo. Desinfección del campo quirúrgico tres veces con etanol al 75%.
Nota: Asegúrese de que la cabeza de la cría es de hielo. Realizar la cirugía entera con el cachorro en una plataforma de lleno de hielo. - Los siguientes pasos difieran en el recién nacido en comparación con los ratones adultos.
- Hacer una incisión postauricular ~ 3 mm de ~ 2 mm posterior al pliegue auricular (Figura 3A -B).
- Suavemente haga una abertura en el PSC suave utilizando una aguja de 26 G. Inserte la cánula en el PSC sin ampliación de la abertura (figura 3 -E).
- Después de la inyección, use un pedazo de músculo para cubrir, en lugar de enchufe, la apertura, éste puede conducir a una fractura de la PSC suave (figura 3F).
- Cerca de la piel mediante una sutura 6-0.
- Realizar mediciones de ABR y pruebas de natación en P3030.
- Canibalismo de los padres es un problema común después de la cirugía neonatal. Los pasos siguientes reducen la probabilidad del canibalismo de los padres.
- Limpiar la sangre que rodea la incisión con toallitas de alcohol después de la cirugía.
- Asegúrese de que el recién nacido puede moverse libremente antes de volver a la presa.
- Frotis de recién nacidos con ropa de cama sucia de la jaula de la madre y el lugar que los recién nacidos de nuevo en medio de la camada.
- Cualquiera no sometidos a cirugía deben recibir una incisión postauricular similar y sutura.
- Separar el macho de la jaula de cría.
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Representative Results
Colorante verde rápido se inyectó en el PSC de ratones adultos y neonatales, para evaluar su distribución inmediata en el oído interno. El tinte fue detectado a lo largo de la cóclea, vestíbulo y canales semicirculares inmediatamente después de la cirugía (figura 4).
Para evaluar la seguridad y la eficacia de la canalostomy para la entrega del gene de oído interno, AAV8-GFP se inyecta en el oído de ratones adultos y neonatales. Todos los animales exhibieron umbrales ABR normal y resultados de las pruebas de natación después de GFP AAV8 inyección18,30. Immunohistology reveló que, en el epitelio sensorial auditivo, las células ciliadas internas (CCI) y algunas células de pelo externas (CCE) de la vuelta basal mostraron fuerte expresión de GFP30. En el epitelio sensorial vestibular, se detectó expresión de GFP en el utrículo, sáculo y ámpula30. Células de pelo vestibulares (figura 5) y células de soporte fueron transduced con alta eficiencia18,30.
Infusión de estreptomicina por canalostomy induce pérdida severa de la célula de pelo en el utrículo18,34,38. Para probar la viabilidad de múltiples inyecciones vía canalostomy, ratones recibieron estreptomicina a través del LSC, seguido 7 días más tarde por suspensiones AAV8-GFP con el PSC. Este experimento también fue diseñado para evaluar las características de la transducción de AAV8-GFP en el utrículo lesionado, que era útil para estudios de terapia génica en el oído interno dañado después de la pérdida HC18. GFP fue distribuida a través del utrículo lesionado (figura 6). Numerosas células GFP-positivas eran negativas para la miosina VIIA, lo que indica que fueron transduced SCs. Unos HCs (células de miosina VIIa-positivas) con paquetes del pelo inmaduro también expresan GFP.
Figura 1: preparación de dispositivo. (A) la tubería de polyimide (i) y la tubería de polietileno (ii) estén sellados para hacer una cánula de inyección (iii). (B) la cánula es conectada a una micro-jeringa de 10 μl con una aguja de 30 G y luego instalada en una bomba. La flecha indica la punta de la cánula. (C) reactivo de inyección y solución salina normal están separadas por un boquete de aire. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Canalostomy en un ratón adulto. (A) una incisión poste-auricular (flecha). (B) se exponen los músculos que cubren el hueso temporal. Si definimos la raíz del pabellón de la oreja (puntos en negrita) como el origen y el plano paralelo a la bóveda craneal como 3/9, el canal semicircular posterior (PSC) y el canal semicircular lateral (LSC) se encuentran generalmente en la región de entre 2 y 3:00 (pentagrama) , ~ 3 m m del origen. Detalle: imagen de menor magnificación de la orientación. La línea punteada indica el plano de la bóveda craneal. (C) el PSC y LSC son expuestas (líneas punteadas). Recuadro: El LSC está en un ángulo de aproximadamente 30° del plano paralelo a la bóveda craneal, y el PSC es vertical al LSC. (D) un pequeño agujero hecho en el PSC. (E) la punta de la cánula se inserta en el PSC, y el reactivo es inyectado. (F) el agujero se sella con un trozo pequeño de músculo. Barra de escala en el A es 5 mm, que en B es de 1 mm (B para B-F), que en el recuadro b es 1 cm, y en el recuadro c 5 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Canalostomy en un ratón neonatal. (A) una incisión poste-auricular (flecha). (B) se exponen los músculos que cubren el hueso temporal, y el canal semicircular posterior (PSC) es de ~ 2 mm de la raíz del pabellón de la oreja (puntos en negrita) en 2-3:00 (pentagrama). La orientación es idéntica a la de ratones adultos (figura 2B). (C) el PSC y el canal semicircular lateral (LSC) están expuestas (líneas punteadas). (D) se hace una pequeña abertura en el PSC. (E) la cánula se inserta en el PSC. (F) un pequeño trozo de músculo se utiliza para cubrir la abertura después de la inyección. La escala de barras en el A y B inserción son 5 mm, que en B es de 1 mm, y que en C es de 1 mm (C de C-F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: estereo imágenes microscópicas de los oídos interno de adulto (A-a ') y ratones neonatales (B-B') administrada rápido verde tinte a través de canalostomy. Se recolectaron muestras inmediatamente después de la cirugía. (A y B) La superficie extracraneal. (A' y B') La superficie intracraneal. Colorante verde rápido se distribuye a lo largo de la cóclea, vestíbulo y canales semicirculares. Barras de escala están de 1 mm (A' de A-A 'y B' de B-B'). PSC, del canal semicircular posterior. LSC, canal semicircular lateral. SSC, canal semicircular superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: representante de imágenes confocales de montajes enteros de la cóclea (A-A") y el utrículo (B-B") de ratones adultos, elaborado 30 días después de la inyección de GFP AAV8 via canalostomy. Las muestras se tiñen con anticuerpos para GFP (verde) y la miosina VIIa (rojo). (A-A ") GFP se expresa en células más internas (IHC). (B-B ") En el plano focal de la placa cuticular del utrículo, numerosas células expresan GFP (flechas). GFP, proteína fluorescente verde. Sobre la cabeza, células de pelo externas. Las barras de escala son 25 μm (A"para A-A", B "B-b"). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: imágenes representativas confocales de un utrículo traumatizado obtienen 30 días después de la inyección de GFP AAV8 via canalostomy. Un ratón adulto fue inyectado con estreptomicina vía el canal semicircular lateral y 7 días más tarde inyectadas AAV8-GFP mediante el canal semicircular posterior. GFP (green), miosina VIIa (rojo) y actina (azul). Puntas de flecha indican células soporte representativas transduced con AAV8-GFP (GFP + miosina VIIa-células), y las flechas indican representante de células transduced con AAV8-GFP (GFP + miosina VIIa + las células) con paquetes del pelo inmaduro. Barra de escala es de 20 μm (D de A-D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, mostramos que fármaco de canalostomy dio lugar a la amplia difusión del reactivo a lo largo de la cóclea y final-órganos vestibulares. Como un método de entrega del gene de oído interno, canalostomy dio lugar a la expresión de GFP en el oído interno de ratones adultos y neonatales con mínimo daño a la función auditiva y vestibular. Además, las inyecciones múltiples pueden realizarse fácilmente en el mismo animal.
Una de las mayores fortalezas de canalostomy es que causa un daño mínimo a la función del oído interno, especialmente en ratones adultos16,18,28,29,30, que es importante para la evaluación de efectos protectores y para aspectos de translational. Varios grupos han utilizado canalostomy para entregar diversos reactivos, tales como vectores virales, siRNA, células madre y aminoglucósidos, en el oído interno murino18,19,28,29, 34,35,36,37. En el presente estudio, describimos técnicas quirúrgicas paso a paso, detalladas de canalostomy en ratones adultos y neonatales. En comparación con estudios anteriores, nuestro estudio proporciona más detalles sobre la colocación de los canales semicirculares, que es un procedimiento clave para la exitosa cirugía. Como se muestra en la figura 2B y C, el PSC y LSC fueron generalmente encuentra ~ 3 mm de la raíz del pabellón de la oreja en 2-3:00. El LSC fue en un aproximadamente 30° de ángulo desde el plano paralelo a la bóveda craneal, y el PSC era vertical al LSC. Además, hemos simplificado los procedimientos quirúrgicos y había acortado el tiempo quirúrgico a alrededor de 25 min con resultados comparables29.
Durante el canalostomy, es imprescindible para evitar fugas en el sitio de la inyección y la obstrucción de la cánula. Antes de encender la bomba, es importante asegurarse de que la punta de la cánula se inserta en el canal semicircular y que la cánula no está doblada o bloqueada. Músculo seco se recomienda para ser utilizado al sellar el agujero en el canal semicircular de ratones adultos porque, en presencia del líquido del canal semicircular, se expande y tapa el orificio (ver pasos 2.6 y 2.10). Porque la pared del canal semicircular de ratones neonatales es suave y frágil, la apertura debe sellarse por la cubierta con músculo autógeno o pegamento médico30. También retiramos la cánula sin obstruir la abertura con el músculo; la resultados revelaron comparable AAV transducción eficiencia en el oído interno (datos no mostrados), indicando que la apertura en el PSC de ratones neonatales se cerró satisfactoriamente.
Otra ventaja del canalostomy es la viabilidad de múltiples procedimientos, que permite a las aplicaciones repetitivas de los mismos o diferentes reactivos (figura 6). Porque fibrótica y tejidos de granulación se encuentran con frecuencia en sitios quirúrgicos anteriores y el canal semicircular puede quedar obstaculizado tras cirugía34, se recomienda realizar las inyecciones durante cirugías repetitivas en un área diferente de la lateral o canales semicirculares posterior18.
La limitación principal de canalostomy es la dificultad para determinar si se inserta la cánula de inyección en el espacio perilymphatic o saco endolinfático. Después de la administración de vectores adenoviral en el oído interno16 via canalostomy, más células transduced fueron situadas en el espacio perilymphatic, sugiriendo que la inyección era probable que en esa zona. Compuestos de bajo peso molecular (por ejemplo, AAV, estreptomicina y siRNA) pueden atravesar la barrera entre la perilinfa y endolinfa y llegar al epitelio sensorial después de la inyección en el espacio endolinfático o perilymphatic18,19 ,34. Sin embargo, después de la inyección en la perilinfa, reactivos pueden permanecer en el espacio perilymphatic si no penetran la barrera entre la perilinfa y endolinfa16,39,40. Por lo tanto, se debe considerar la permeabilidad de los reactivos inyectados antes de usar canalostomy.
En conclusión, canalostomy da como resultado una amplia distribución de los reactivos en la cóclea y vestíbulo con disturbio mínimo de la función auditiva y vestibular. La cirugía se implementa fácilmente en ratones adultos y neonatales, y múltiples procedimientos pueden realizarse si es necesario. Canalostomy así es un enfoque eficaz y seguro para el suministro de medicamentos en el oído interno de los roedores y en el futuro, podrá ser utilizado clínicamente para tratar enfermedades humanas cochleovestibular.
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Disclosures
No se declaran conflictos de interés.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (números de concesión 81570912, 81771016, 81100717).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
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