Summary
実験的肝組織体内のプラズマ凝固法を評価するためにプロトコルをご紹介します。ブタのモデル レーザードップラー微小循環を検討、組織凝固深度を測定、凝固サイト赤外線放射温度計とサーモグラフィ カメラとダクトのシール効果で温度は圧力によって文書化されます。実験。
Abstract
プラズマ凝固焼灼の一形態としては、後の段階で出血を防ぐために主要な肝切除後大きい肝カット表面をシールする何十年も肝臓手術で使用されます。プラズマ凝固肝組織の厳密な効果は単に不十分検討しました。ブタのモデルでは、臨床応用に近い凝固効果を調べることができます。組み合わせたレーザー ドップラー流量計、分光光度計ドキュメント微小循環は非侵襲的、組織深さ 8 mm で凝固時変更臨床印象を超えて止血について定量的な情報を提供します。凝固過程で評価サーモグラフィ カメラと赤外線温度計前およびポスト凝固凝固サイトで温度、ガス ビーム温度の測定デバイスの上限のしきい値のために可能ではないです。凝固の深さは、ヘマトキシリン ・ エオシン オブジェクト マイクロメータの校正後染色標本の顕微鏡は測定し、電源設定凝固深度の関係について正確な情報を与えます。シール効果を胆管に調査する大きな血管をシールするプラズマ凝固装置のため不可能です。バースト圧力実験を血圧を除外する explanted 臓器に関連した効果。
Introduction
アルゴン プラズマ凝固法 (APC) は、三十年1,2以上の腹部手術で広く使われている楽器です。肝臓のシールによる主要な肝切除後の出血3を防ぐために表面をカット後、二次止血の達成のための標準的な技法です。プラズマ凝固法は、高周波電気焼灼器、イオン化されたガスのアークを介して電気エネルギーを提供の特殊な形式です。モノポーラ電熱止血を提供し、この非接触技術組織4に固執する電極を防止する利点があります。イオン化されたガスのビームは自動的に最低の電気抵抗の領域に送られます、抵抗上昇乾燥のため他の地域がまだ乾燥して離れになっています。これは凝固5,6の制服の限られた深さを生成します。凝固効果に影響する要因は活性化凝固装置とプローブから組織までの距離の電源設定の時間します。ヘリウムは別のキャリア ガスをプラズマ凝固7に使用することができます。最近の臨床研究に集中して成績ではなく、機能的な組織学的所見3,8,9,生体外で調査10 に焦点を当てた実験中または分離臓器11実験。
基になるプロトコルにより、豚の人間の標準的な装置を使用して臨床応用に近い大規模な動物モデルのプラズマ凝固法の効果に関する研究: 微小循環がレーザーのドップラー流量計による非侵襲的評価と分光光度計、この表示12,13の標準的な臨床ツールです。凝固過程での温度変化は、赤外線放射温度計とサーモグラフィ カメラで監視されます。凝固の深さは、組織学的ヘマトキシリン ・ エオシン組織サンプルの採取後のセクションを染色で測定されます。二次止血のための他の手段との比較、バースト圧力実験を行った。血圧を除外する explanted 器官で実施されますが前述のテクニック14とは対照的に関連した効果。プラズマ凝固のローカル影響の調査の説明に加えてブタモデルで標準的な血液検査を実施することもできます。
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Protocol
原則研究所動物ケアの (健康の国民の協会文書編 8、2011) と同様、動物研究のドイツの立法によって支配される規則に従っていた。政府の動物の世話のオフィス (Landesamt für Natur 環 und Verbraucherschutz ノルトライン ・ ヴェストファーレン州、レックリングハウゼン、ドイツ) から公式許可します。
1. 動物
- オープンケージで収容 (25-30 kg) 女性ドイツ在来種豚を使用します。
- 5 動物群 (アルゴン ・ ヘリウム) を使用します。
- 実験する前に、少なくとも 1 週間、環境に順応する動物を許可します。水への無料アクセスと手術前に 24 h の高速動物。
2. 麻酔
- Premedicate (15 mg/kg 体重 [BW]) ケタミン ・ キシラジン (10 mg/kg BW)、アトロピン (0.1 mg/kg BW) 筋肉内注射と動物麻酔導入前に 10 分。
- 22 ゲージ カニューレの耳静脈に配置によって末梢静脈アクセスを設立します。
- プロポ フォール 2 mg/kg の静脈注射による麻酔を誘導します。
- 仰臥位で動物を置き、2 cm。 皮下組織の鈍的準備を通じ検索静脈の長さの頸静脈の溝に縦切開を実行します。セルジンガー ワイヤー、カニューレを挿入します。
- カニューレを撤回し、ガイドワイヤー 14 神父カテーテルを挿入します。ガイドワイヤーを撤回します。拡張機能にカテーテルを接続し、ストラップや縫合糸でカテーテルを固定します。
- 舌を抜くし、まっすぐ喉頭鏡を挿入します。喉頭鏡のヒントを使用して、喉頭蓋をプルダウンします。声帯からチューブを挿入します。声門下カフを配置し、膨らませます。
- 36 と 42 の mm Hg の間呼気終末部分炭素二酸化炭素の張力を維持する 40% 酸素 20 26 呼吸/分で 10 ml/kg の一回換気量と換気します。
- 1 1.5% の濃度でイソフルランと 3-4 μ g/kg/h の濃度でフェンタニル麻酔を維持します。
- 4 mL/kg の初期速度で乳酸リンゲル液を供給/h、8 mL/kg の持続注入率を開腹後増加/h。
3. 手術とプラズマ凝固
- 標準的な手術台に仰臥位に動物を配置します。
- 標準的な手術の消毒薬を適用することによって皮膚を消毒 (2-プロパノール 45 g/100 g、1-プロパノール 10 g/100 g、ビフェニル-2-オール 0.2 g/100 g) を 3 回手術綿棒。
- 剣状突起からメスと恥骨へ広い正中開腹を実行し、手術リトラクターをインストールします。
- プラズマ凝固装置のスイッチは、使用キャリアガスによって、アルゴンまたはヘリウムのガスのボトルを開きます。3 L/分に応じて選択凝固デバイス出力へのガス流を調整します。
注: プラズマ凝固の両方の気高いガス、アルゴンまたはヘリウムを使用できます。凝固効果はほぼ同等です。詳細については文献7を参照してください。 - 上記7として左肝葉でプラズマ凝固を実行します。チタン金型 (正方形開口 1 × 1 cm2) を使用して、凝固ゾーンを標準化します。5 凝固プローブ距離 1 cm で s。それぞれ異なる電源設定と凝集は、短い間隔 5 mm (図 1) の凝集と並行実行できます。
- 肝臓の収穫のため肝臓にすべての靭帯接続を分割します。分離し、門脈と胆管の長い部分を残して優れた十二指腸曲げ上肝椎弓根を分割します。大静脈上と下の肝臓を分割し、器官を取得します。
- 肝臓を採取後、豚は 0.16 g/kg BW ペントバルビ タールの投与によって安楽死されました。
- バースト圧力実験のための鋭いはさみで左の内側の肝葉の半分を切除します。プラズマ凝固させ、カット面 (100 w 出力) またはフィブリン (図 2) でカット表面をシールします。
4. 微小循環測定
注: レーザー ドップラー分光は、赤血球の移動によるドップラー シフトの測定を通じて組織の血流を確認できます。レーザー信号移動赤血球の数と相関します。レーザー ドップラー分光法は臨床使用 (例えば移植医学) とされている複数回15を検証します。
- レーザー レーザードップラー血流計や分光光度計に切り替えます。フラットのプローブを使用します。
- 流れと速度の基準測定値を取る。保存または値に注意してください。
- 前述の下 3.5 凝固を実行します。
- 速度とメジャー流凝固サイトにフラットのプローブを配置します。もう一度、保存または値に注意してください。
- 凝固装置装置のすべての電源設定について繰り返します。
5. 温度測定
- (サーモグラフィ カメラ、ノートブック、および赤外線温度計) にシステムを切り替え、測定を実行する前に少なくとも 1 時間を実行します。
- フォーカスを調整し、凝固敷地サーモグラフィ カメラのフレームを表示します。20 よりも大きい温度解像度 1024 x 768 ピクセルの空間分解能で検出できる赤外線シーケンス mK。考慮する凝固や周囲の組織の地域-熱伝達によって影響を受ける-ビューの途中であります。
注: それは可能な限り最適な空間解像度のフレームのピクセル数を含める必要があります。 - 2 分にわたって肝表面にプラズマ凝固装置、サーモグラフィ カメラで凝固プロセスを記録します。
- サーモグラフィー解析ソフトウェアで画像を分析: 興味の領域を定義します。
注: ソフトウェアは、時間をかけて対応する平均温度のコースを計算します。
6. 凝固深度測定
- シャープはさみ左内側肝葉を収穫します。
- 1 cm の厚さで凝固サイトを切除します。さらなる処理のため 3 mm 厚の経度方向のセグメントにカットします。
- 一晩で中立的な 10% の 4 ° C で修正組織サンプルは、ホルマリンをバッファリングします。パラフィン 2 ° C、融点以上に加熱し、スライスを埋め込みます。一晩プロセス。
- ヘマトキシリン ・ エオシン染色を実行します。
- Deparaffinize し、その後を 2 に浸すことによって組織をメタンハイド レート x キシレン 100% エタノール (エタノール)、95% エタノール、70 %etoh, 脱イオン H2O 2 分。
- 3 分のマイヤーのヘマトキシリン液と組織標本を染色します。
- 今、5 分間水道水ですすいでください。
- エオシン溶液 3 分間で組織を染色します。
- 3 分の 2 の x EtOH 95%、キシレンですすいでください。メディアを標準マウントをマウントします。
- (顕微鏡接続カメラ、イメージング ソフトウェア) のシステムに切り替えます。40 倍の倍率ですべてのセクションを表示します。
- 40 倍の倍率でオブジェクト マイクロメータのイメージを取る。再目的ウィンドウでボタンを押します。手動校正を選択します。入力 0, 1 mm] ダイアログ ボックスでは、100 μ m のマイクロメータ イメージ上に線を描画し、OK を押します。
- ビューで長さを選択 > 解析コントロール > アノテーションや測定ウィンドウ。マウスを使って凝固余白に肝臓表面から測定します。エクスポートまたは結果に注意してください。同じスライド上の別の場所で測定を繰り返します。
注: 凝固深度は、通常肝細胞コードと縮められた細胞質、核濃縮核出血ゾーンと壊死のゾーン間のシャープなマージンによって通常の肝組織から簡単に区別できます。 - 2 つの測定の平均値を計算します。
7. バースト圧力測定
- スイッチ (自動ポンプ、圧力計) のシステム。ステップ 3.7 によると肝臓のサンプルを準備します。
注: 3 方法活栓を介して接続された 2 つの並列ポンプを使用します。シングル ポンプで 1,500 の mm Hg の最大圧力が得られません。 - 触覚の茎にはさみで門脈、肝動脈、胆管を分離します。門脈を喀鉗子でクランプし、4-0 monofil 縫合糸で結紮します。総肝動脈 overholt 鉗子をクランプし、4-0 monofil 縫合糸で結紮します。
- Ch 16 カテーテルを胆管に挿入し、2-0 絹縫合糸で結紮します。圧力計 (図 3) と三方活栓をインストール、自動ポンプにカテーテルを接続します。
- 生理食塩水で灌流注射器を満たしなさい。
- 99 mL/h の配信率の自動ポンプを開始します。
- 漏れとレコードの破裂圧力の肝カット面と圧力計を監視します。
注: を漏れの簡単に認識、特許の青は生理食塩水 (2 mL 特許ブルー + 18 mL 生理食塩水) を追加できます。圧力計の圧力の損失の時に気付いて、破裂圧力を確認しやすいです。
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Representative Results
微小循環:次のプラズマ凝固止血診断装置を利用したは、微小循環の変化によって発揮できます。142.7 ± 76.08 のベースライン値から毛細血管血流 (任意の単位 (AU) として表示) が減少 57.78 ± 49.57 AU 25 W デバイス、出力 48.5 ± 7.26 で AU AU 5.04 ± 1.31 と 50 W で 100 W (図 4) で AU。
温度:凝固のサイトで温度をサーモグラフィ カメラ (図 5) で測定しました。些細だけ温度変化は赤外線温度計を使って文書化されました。32.42 ± の基準温度を示した 2.27 ° c.25 W で凝固後気温は 33.33 ± 1.81 の ° c.50 W レーザー凝固をもたらした 31.17 ± 温度 2.13 ° c.100 W の最大電力設定凝固後温度は概ね 30.17 ± 3.19 ° C (図 6) と変更されました。
凝固深度:プラズマ凝固することができますと壊死の表面的なゾーンを作成します (図 7) 正常肝実質と簡単に区別されます。壊死の深さは複数のセクションで測定できるし、プラズマ凝固装置の上昇の電力レベルで完全に線形ではない増加を示しています。次のヘリウム プラズマ凝固、凝固深度が 230.2 ± 57.83µm、25 w、50 W、75 w で 292.2 ± 入れる 45.65 μ と μ m ± 160.9 412.9 100 W のデバイス出力電力 (図 8) で 314.6 ± 87.39 μ m。デバイスの出力は自由に選択することができますおよび凝固深度7と正の相関を選んだ。
バースト圧力:バースト圧力測定後に実施 explanted 左内側肝葉ショーの切断面にない違い (1254±578.7 mmHg) ヘリウムまたはアルゴン (1003 ± 554.4 mmHg) プラズマ凝固 (図 9)。バースト圧力はフィブリン シーラント7に比べて低いが、臨床使用に適しているでしょう。
図 1: アルゴン プラズマ凝固後左内側肝葉。左の内側の肝葉に 8 つの凝固サイト (右下に左上から: 10 W、15 W、20 W、25 W、30 W、50 W、75 W、100 W)。凝固金型標準化の範囲。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: バースト圧力測定の肝移植の準備。肝葉の半分が切除され、フィブリンと肝の切断面を密封します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: バースト圧力測定のための機器。自動ポンプ (生理食塩水で満たされた注射器) 圧力計は、3 の方法活栓を介して接続されているとします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 微小循環変化します。前に (任意の単位として表示) の流れを血に変化し、50 W と 100 W のデバイス出力電力 25 W でアルゴン プラズマ凝固後、(n = 3-6)。* P= < 0.05、1 ウェイ分散。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 凝固サイトで温度をサーモグラフィ カメラで測定します。40 w デバイス出力をもつヘリウム プラズマ凝固時のサーモグラフィ カメラで模範的な画像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 凝固現場温度赤外線温度計で測定します。アルゴン プラズマ凝固法の前後に凝固のサイトで温度を赤外線温度計で測定 (n = 3-6)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 表在性壊死ヘリウム プラズマ凝固、次のゾーン。ヘマトキシリン ・ エオシン染色 40 倍の倍率で肝のセクションです。壊死部は縮められた細胞質と出血ゾーン細胞肝細胞コード アーキテクチャの損失を示しています。矢印は、2 つの異なる場所で凝固の深さを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: ヘリウム プラズマ凝固凝固深さ。異なる電力レベルにおける凝固深度 (25 w、50 w、75 w、100 w、n = 6)。* P= < 0.05 * * * P= < 0.001、1 ウェイ分散。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 圧力をバーストします。次のヘリウムまたはアルゴン プラズマ凝固肝の切断面に圧力測定でバーストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: 血液検査の結果。臨床生化学・血ガスの結果の前に表示され、次のアルゴン プラズマ凝固法のパラメーターを選択します。重要な変更が発生しないプラズマ凝固凝固サイトでローカルの変更を制限の影響を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
長い時間16肝臓手術の齧歯動物モデルが確立されます。大動物モデルがある特定の利点を提供するにもかかわらず、: 人間のための標準的な手術機器を適用できる、手術手技、臨床使用に匹敵する、標準的な臨床的評価方法は、顕微鏡の装置は必要ありません実験に移ります。特別な実験室試験方法 (図 10) を必要とせず標準臨床血液検査が実施されることができます。
豚は、自分の生理機能によく似た人間17呼吸循環の研究のための適切な実験動物です。サイズ、分節構造および組織学の類似性のため豚がまた実験的肝手術18標準実験動物の一つです。プラズマ凝固は、利点 (人間の生理と標準的な臨床機器の評価に類似)7のためブタのモデルで評価した.手術方法と対照をなして学管理を容易に推定することはできません。特に気道管理困難な17をすることができます。門歯から声門までの距離が非常に長い、解剖学は人間の経験の浅い研究者に気管挿管が困難に異なります。また、サルベージ戦略 (例えば気管切開) が存在する必要がありますので、マスク換気が豚ではほぼ不可能です。
プラズマ凝固法で同等の結果を達成するため、研究者は、厳密に標準化プローブ間隔および凝固の持続期間に注意を取る必要があります。ストップウォッチを使用する、5 を数えることができますプローブの距離を維持し比較的易いが、凝固の s。肝表面にプラズマ凝固の記載した技術は、基になるプラズマ凝固、肝生体内で7の効果に関する基礎的研究で使用されました。主要な肝切除を検討し、その後シール切断面のさまざまなテクニックを比較、豚の麻酔、外科および血漿の凝固の上記のテクニックを使用もできます。
レーザーのドップラー流量計と微小循環測定用分光光度計標準臨床ツール19であり高い臓器実質内に直接循環の評価に有用であることが判明しました。血流量と血流速度の値は、非 invasivity の利点と計算されます。微小循環パラメーターは、ドップラー測定は凝固の客観的パラメーターと相関する必要がありますので、のみ凝固効果の間接的な測定です。実験では、相関関係を組織凝固深度を使用します。
血しょうビームの温度が両方のデバイス上のしきい値を超えるため凝固時血しょうビームの温度の測定は温度測定の欠点。赤外線温度計は、サーモグラフィ カメラのセットアップはより複雑より正確なデータを提供するのに対し、適用する簡単です。凝固は (ブタのボディ温度 ~38.5 ° C17) を予想を下回る前に基準温度は体温に開腹の破壊的な影響を示します。測定温度は、中および肝臓の優れた血流を示す凝固後に増加しません。肝臓のこの熱盗む効果は、高周波アブレーション20から知られています。バースト圧力管理を行った肝血管ではなく胆管システムに単純な理由: 不可能だプラズマ凝固剤の (フィブリン シーリング材用として) より大きい容器を密封するため。二次止血の両方の手段は、切除時に大きな船が組み合わされて、切除臓器の切断面をシールします。バースト圧力実験が報告されたテクニック14と比較して若干変更されました。Explanted 臓器組織のための圧力を測定しました。血圧をこれらのルールに関連した効果、使用灌流または体内臓器により適用するはるかに簡単です。灌流圧が異なる場合があります、そのため、実験の値/変更された肝臓のための生体内測定構造 (explanted 臓器に通常より高い圧力)。上記バースト圧力法は、実行される体内をこともできます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者の謝辞があります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine 20 mg/mL | Vetoquinol GmbH | Xylapan | |
| Ketamine 100 mg/mL | Ceva GmbH | Ceva Ketamine Injection | |
| Atropine 100 mg / 10 mL | Dr. Franz Köhler Chemie GmbH | Atropinsulfat Köhler 100mg Amp. | |
| Propofol | Fresenius Kabi GmbH | Propofol 1% MCT Fresenius | |
| Fentanyl | KG Rotexmedica GmbH | Fentanyl 0,5mg Rotexmedica | |
| Isoflurane | Abbot GmbH | Forene 100% (V/V) 250 mL | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | sodium 131mmol/l, potassium 5 mmol/l, calcium 2 mmol/l, cloride 111 mmol/l, lactate 29 mmol/l | |
| Surgical disinfactant | Schülke & Mayr GmbH | Kodan Tinktur forte gefärbt 1l 104804 | |
| Motorized microscope | Nikon Instruments Europe | Eclipse TE2000-E | |
| Microscope camera | Nikon Instruments Europe | Digitalsight DS-Qi1Mc | |
| Imaging software | Nikon Instruments Europe | NIS elements Vers. 4.40 | |
| Plasma coagulator | Söring GmbH | CPC-1000 | |
| Argon gas | Linde AG | Argon 4.8 | |
| Helium gas | Linde AG | Helium 4.8 | |
| O2C | LEA Medizintechnik GmbH | O2C Version 1212 | with LF-2 or LF-3 probe |
| Infrared thermometer | Voltcraft | VOLTCRAFT IR 260-8S | |
| Thermographic camera | InfraTec GmbH | VarioCAM HD head 820 | |
| Thermographic analysis software | InfraTec GmbH | IRBIS 3 | |
| Mayer's Hematoxylin solution | Merck 1.09249 | ||
| Eosin solution | VWR International GmbH | Merck 1.09844 | |
| Rollerpump Masterflex L/S easy Load | Cole-Parmer Instrument Company | model 7518-10 | |
| Perfusorpump | B. Braun Melsungen AG | Perfusor secura FT | |
| Digital pressure meter | Greisinger electronic | GMH 3161 | |
| Perfusorsyringe, 50 mL | B. Braun Melsungen AG | REF 8728810 F | |
| Perfusor line, Type IV Standard, PVC Luer lock | B. Braun Melsungen AG | REF 8722960 | |
| 3-Way stopcock, Dicofix C35C | B. Braun Melsungen AG | REF 16494 C | |
| Silk 2-0. 3 metric | Resorba | REF H5F | |
| Vicryl 4-0 Sutupak | Ethicon | V1224H | |
| NaCl 0.9 % | B. Braun Melsungen AG |
References
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