Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Byggandet av syntetiska Phage visas Fab bibliotek med skräddarsydd mångfald

doi: 10.3791/57357 Published: May 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Det här protokollet beskriver ett detaljerat förfarande för byggandet av en phage-visas syntetiska antikroppsbiblioteket med skräddarsydd mångfald. Syntetiska antikroppar har breda program från grundforskning till sjukdom diagnostik och therapeutics.

Abstract

Efterfrågan på monoklonala antikroppar (mAbs) i grundläggande forskning och medicin ökar årligen. Hybridomteknik teknik har varit den dominerande metoden för mAb utveckling sedan sin första rapport i 1975. Som en alternativ teknik är phage display metoder för mAb utveckling allt mer attraktivt eftersom Humira, första phage-derived antikroppen och en av de bäst säljande mAbs, godkändes för klinisk behandling av reumatoid artrit i 2002. Som en icke-animalisk baserat mAb utveckling teknik, kringgår phage display antigen immunogenicitet, humanisering och djur underhåll som krävs från traditionella Hybridomteknik teknikbaserade antikroppsutveckling. I detta protokoll beskriver vi en metod för byggandet av syntetiska phage-visas Fab bibliotek med mångfalder av 109-10-10 som kan erhållas med en enda elektroporation. Detta protokoll består av: 1) högeffektiv electro-behöriga cell förberedelse; (2) utvinning av uracil-innehållande enkelsträngat DNA (dU-ssDNA); (3) Kunkels metod baserad oligonukleotiden riktad mutagenes; (4) elektroporation och beräkning av bibliotek storlek; (5) protein A/L-baserad enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) för vikning och funktionella mångfald utvärdering. och 6) DNA sekvensanalys av mångfald.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

mAbs har breda program sträcker sig från grundforskning till sjukdom diagnostik och therapeutics. Från och med 2016, har mer än 60 mAbs godkänts av United States Food and Drug Administration (USFDA) för klinisk behandling av autoimmuna sjukdomar, cancer och infektionssjukdomar1,2.

I 1975 rapporterade Kohler och Milstein en teknik för kontinuerlig produktion av antikroppar av en enda klonal specificitet från en cellulär källa kallad 'hybridomceller' och denna teknik har därefter blivit en hörnsten inom medicin och industri3 ,4. Generation av mAbs av denna metod kräver olika steg inklusive antigen produktion, mus immunisering, utvinning av B-lymfocyter, fusion av B-celler med myelomceller att bilda odödliga Hybridomteknik celler, klon urval, och för terapeutiska tillämpningar, humanisering krävs att undvika human antimus-antikropp (HAMA)4,5. Men för denna teknik är antigener inklusive toxiner, patogener och mycket proteiner relativt ineffektiv utlösa ett i vivo immunsvar för mAb produktion5.

1978 rapporterade Hutchison et al. användning av en oligonukleotid till direkta mutagenes av en restprodukt i ett enkelsträngat bacteriophage virus6. 1985 rapporterade Smith att utländska gen fragment kan vara smält i ram med den gen som kodar phage coat protein III och kan därmed visas på phage ytan utan att kompromissa med dess smittsamhet7. Dessa banbrytande verk lade en grund för efterföljande byggandet av phage-visas antikropp bibliotek i immun, naiv och syntetiska bildar med format av singel-kedjan variabel fragment (scFv) och antigen-bindande fragment (Fab) för terapeutiska mAb utveckling8,9. Från teknisk synvinkel, phage display-baserade antikroppsutveckling erbjuder en kompletterande strategi till hybridom-baserade mAb utveckling som kan bidra till att kringgå de begränsningar som vissa antigener kan utgöra och humanisering process som hybridom-derived antikroppar kräver ofta5. Från och med 2016 6 phage display-derived mAbs har godkänts på marknaden inklusive Humira, en av de mest framgångsrika mAbs används för behandling av reumatoid artrit, och många phage display-derived antikropp kandidater är för närvarande i olika stadier av klinisk undersökningen10.

För immun- och naiva phage antikropp bibliotek, mångfalden av komplementaritet-bestämma regionerna (cdr-skivor) i lätta och tunga kedja härleds från den naturliga immuna repertoaren (dvs.från B-celler). Däremot är mångfalden av cdr-skivor i syntetiska phage antikropp bibliotek helt konstgjorda. Syntetiska metoder för bibliotek konstruktion ger exakt kontroll över utformningen av sekvens mångfald och erbjuda möjligheter för mekanistiska studier av antikropp struktur och funktion11,12. Ramen för syntetiska bibliotek kan dessutom optimeras innan biblioteket konstruktion att underlätta nedströms, storskalig industriell utveckling11,12.

1985, Kunkel rapporterade ett enkelsträngat DNA (ssDNA) mallbaserade mutagenes strategi att införa webbplats riktad mutationer i M13 bacteriophage effektivt13. Denna metod användes därefter allmänt för byggandet av phage-visas bibliotek. Kemiskt syntetiserade DNA oligonukleotider utformad för att införa mångfald i Fab CDRs införlivas i en phagemid med en antikropp ryggraden mall. I denna process, phagemid uttrycks som en uracil-innehållande ssDNA (dU-ssDNA) och oligonukleotider är glödgas på CDRs och utvidgas till att syntetisera dubbelsträngat DNA (dsDNA) T7 DNA-polymeras och T4 DNA-ligase närvaro. Slutligen, genererade ds-DNA kan införas i Escherichia coli genom elektroporation.

För hög mångfald, phage-visas bibliotek konstruktion, hög spänning elektroporation av en två-komponent blandning av electro-kompetenta celler och kovalent bör stängda cirkulär dsDNA (CCC-dsDNA) förberedas noga. Sidhu et al. modified utarbetandet av electro-kompetenta celler och DNA från traditionella metoder och kraftigt förbättrad bibliotek mångfald14.

I detta protokoll beskriver vi en metod för byggandet av syntetiska phage-visas Fab bibliotek med mångfalder av 109-10-10 som kan erhållas med en enda elektroporation. Figur 1 visar en översikt över bibliotek konstruktion inklusive: 1) högeffektiv electro-behöriga cell förberedelse; (2) utvinning av dU-ssDNA; (3) Kunkels metod baserad oligonukleotiden riktad mutagenes; (4) elektroporation och beräkning av bibliotek storlek; (5) protein A/L-baserad ELISA för vikning och funktionella mångfald utvärdering. och 6) DNA sekvensanalys av mångfald. Alla reagenser, stammar och utrustning listas i materialets tabell. Tabell 1 visar reagens setup.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Obs: Filter sterila tips måste användas under hela när man arbetar med phage för att undvika kontaminering pipett pistol och omgivningarna. Aseptiska område eller huv måste användas när hantering med bakterier och phage experiment. Phage experiment område måste rengöras med 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) följt av 70% etanol för att undvika phage kontaminering. För att göra seriespädningar i detta protokoll, bör nya tips användas för varje spädning.

1. E. Coli SS320 Electro-behöriga Cell förberedelse

  1. Pre varma LB/tet agarplatta (beredd och lagras vid 4 ° C för mindre än 1 - vecka-gammal) vid 37 ° C inkubator för 1 h. Använd en steril inympning loop eller sterila tips till strimma ut en glycerol lager av E. coli SS320 celler på förhand värmde LB/tet agarplattan i en zig-zag-riktning ning försiktigt längs ytan av plattan. Inkubera plattan vid 37 ° C inkubator över natten för cirka 12-15 h.
  2. Följande dag, Använd en steril inympning slinga eller steril tips att plocka en väl separerade enda koloni längs sicksack-linjen och Inokulera i 10 mL 2YT/tet medium i ett 50mL rund botten rör genom doppning slingan till medium och omrörning kort.
  3. Inkubera vid 37 ° C under skakning på 200 rpm för runt 3-4 h tills OD600 nås på runt 0.4-0.8 (log fas tillväxt). Övervaka OD600 på 2 h. Under denna period före varma 5 LB/tet agarplattor (beredd och lagras vid 4 ° C för mindre än 1 - vecka-gammal) i en 37 ° C inkubator för minst 1 h.
  4. Tillsätt 20 μL M13KO7 helper phage från lab lager med titer runt 1 x 1013 kolonibildande enhet (cfu) /mL in 180 μL av sterila 1 X PBS i Ånghärdad 1,5 mL rör att förbereda 10 tiofaldig seriespädningar.
  5. Alikvotens 4 mL autoklaveras och flytande 2YT topp agar till 5 X 14 mL runda botten rör, märka varje rör med en spädning från femte till nionde om tiofaldig utspädning, respektive, och inkubera i en 65 ° C inkubator att upprätthålla 2YT topp ägarn i flytande tillstånd.
  6. Blanda 500 μL av loggen fas E. coli SS320 celler i M13KO7 utspädning röret (välja femte tiofaldig utspädning till nionde tiofaldig utspädning) och inkubera i en 37 ° C inkubator för 5-10 min.
  7. Under inkubering av steg 1,6, överföra 2YT topp agar från steg 1,5 till rumstemperatur (RT) svalna i cirka 5 min till ca 42 ° C. Använda inre handled för att testa temperaturen av 2YT topp agar; Det bör förbli som vätska. Överföra varje utspädning blandning från steg 1,5 till varje motsvarande 2YT topp agar rör. Dra åt locket på varje rör och blanda genom att vända upp och ner flera gånger försiktigt och kortfattat att undvika bubbla generation.
  8. Häll varje blandning längs kanten av en redan varm LB/tet agarplatta (från steg 1.3) försiktigt och slant plattan något för att fullt och jämnt fylla plattan med blandningen samtidigt undvika införandet av bubblor. Hålla plattorna på RT för runt 5-10 min att stelna topp ägarn inom varje platta och inkubera 2YT topp agar plattorna vid 37 ° C över natten för runt 15-18 h.
  9. Välja den utspädning plattan efter övernattning tillväxt från steg 1,8 med runt 100-200 medelstor, enkel, väl separerade plaketter för plack inympningen. Använda en hand för att hålla agarplattan mot en ljuskälla, och å andra sidan att hålla en pipett pistol laddad med en lång sterila pipettspetsen att vertikalt sticka in den översta agar, och samla en enda och väl separerade plack.
    1. Slant pipettspetsen något för att separera topp agar med plack. Pipettera upp och ner flera gånger för att rubba agar med plakett till en 14-mL rund botten kultur rör förinstallerad med 1 mL 2YT/kan/tet medium (se tabell 1).
    2. Upprepa proceduren för att plocka 3-5 plack totalt. Syftet med plocka flera plack är att säkerställa framgångsrika Inympning, en plakett kan vara svag och relativt liten jämfört med en bakterier koloni. Växa plack under 8 timmar vid 37 ° C under skakning på 200 rpm.
  10. Överföra en tub av växande kultur till 50 mL av 2YT/kan/tet mediet i en 250 mL-kolv för förbryllad. Växer vid 37 ° C under skakning på 200 rpm övernattning för ca 12 h.
  11. Inokulera tre 2-L förbryllad kolvar som innehåller 900 mL superbroth/tet/kan medium varje med 5 mL av övernattning kultur. Inkubera vid 37 ° C under skakning på 200 rpm för 6-7 h till OD600 runt 0,6-0,8.
  12. Chill tre kolvar av bakteriekulturen i ett isbad för 5 min med mild konstant snurra för hand. Följande steg bör göras i ett kallt rum, på isen, med prechilled lösningar och utrustning.
  13. Använd absorbansen vävnad handduk för att torka den yttersta glaset i varje kolv; använda en hand till slant 1-L Ånghärdad centrifug flaskan på bänk och å andra sidan att hälla medlet försiktigt från varje kolv i flaskan centrifug.
  14. Snurra på 5.000 × g och 4 ° C i ca 10 min till pellet bakterier.
  15. Efter centrifugering, försiktigt Dekantera supernatanten till en 5-L Ånghärdad avfall bägare.
  16. Fyll varje flaska med 100 mL steril-filtrerad 1,0 mM HEPES, pH 7,4, och lägga till en Ånghärdad magnetiska rör bar i varje flaska till stöd i pellet resuspension på 200 rpm. Snurra och rubba hela pelleten från flaska väggen varje flera minuter under den magnetisk omrörningen. När pelleten är upplöst, Fyll flaskan med ytterligare 400 mL steril-filtrerad 1.0 mm HEPES, pH 7,4.
  17. Centrifugera vid 5.000 × g och 4 ° C i 10 min. Dekantera supernatanten, behålla den uppståndelse bar i flaskan.
  18. Upprepa steg 1.16 till 1.17 en gång.
  19. Återsuspendera varje pellet i 500 mL steril-filtrerad, 10% ultrarena glycerol med hjälp av de uppståndelse barerna. Snurra och rubba hela pelleten från flaska väggen varje flera minuter under den magnetisk omrörningen.
  20. Centrifugera och Dekantera som i steg 1.17. Upprepa steg 1.19 en gång. Använd lång-arm Ånghärdad pincett för att avlägsna rör baren.
  21. Centrifugera vid 5000 × g och 4 ° C i 15 min. Dekantera supernatanten och ta bort eventuella kvarvarande spår av supernatanten från varje centrifug flaska med pipett.
  22. Lägga till 3,0 mL 10% ultrarena glycerol i en flaska och försiktigt återsuspendera pelleten genom pipettering. Överför till nästa flaska och upprepa tills alla pellets är resuspended och kombinerade i en flaska. Ca 6 mL högkoncentrerad celler fås med en titer av omkring 3 x 1011 cfu/mL.
  23. Pre chill 1,5 mL Ånghärdad mikrocentrifugrör och en 96-väl röret förvaringsbox utan avdelare vid-80 ° C för minst 1 h innan detta steg. Överföra de redan kylda mikrocentrifugrör till kylrummet på is före pipettering alikvoter av cellsuspensionen pellet. Använd en pipett till alikvotens 350 μL av cellsuspensionen i varje 1,5 mL mikrocentrifug rör.
  24. Överföra alikvoter i en skum låda behållare fylld med flytande kväve för flash frysning (3-5 min).
    1. Transportera rutan skum med flytande kväve till-80 ° C frys (se steg 1,23).
    2. Ta bort rutan 1,5 mL mikrocentrifug rör lagring från frysen-80 ° C (se steg 1,23) och på is.
    3. Snabbt använda ett metallnät att sikten i alikvoter från flytande kväve och placera dem i rutan tube lagring. Förvaras vid-80 ° C.
      FÖRSIKTIGHET: Flytande kväve kan orsaka brännskador och försiktighet måste iakttas för säkerhetsskydd. Använd en Fab ryggraden phagemid för att kontrollera effektiviteten i de förberedda electro-behöriga celler (Fab ryggraden phagemid beståndet bör i ultrarent (MilliQ) vatten på 400 ng/µL). Tina 1 μg av den Fab ryggraden phagemid i 10 µL ultrarent vatten och en 350 μL alikvot av electro-behöriga SS320 på is, och prechill en 0,2-cm lucka elektroporation kyvetten på is.
  25. Tillsätt 350 μL electro-behöriga SS320 cellerna till 10 µL DNA efter upptining och blanda genom pipettering flera gånger samtidigt som blandningarna på is. Undvika att införa bubblor.
  26. Pre varma 15 mL SOC medium i en 50mL tub i ett vattenbad på 37 ° C i minst 30 min innan elektroporation. Överföra 360 μL blandningen till kyvetten och utföra elektroporation följa tillverkarens instruktioner.
  27. Omedelbart rädda cellerna efter elektroporation genom tillsats av 1 mL före värmde SOC medium (från steg 1,27) och pipettering. Överföra mediet från kyvetten till 125 mL-kolv förinstallerad med 5 mL före värmde SOC.
  28. Skölj kyvetten två gånger, varje gång med 1 mL före värmde SOC medium och överföra medium till 125mL-kolven (se steg 1,27). Lägg till före värmde SOC medium till en slutlig volym av 10 mL 125mL-kolven.
  29. Inkubera i 10 mL cellkulturen under 30 minuter vid 37 ° C under skakning på 200 rpm.
  30. Gör seriespädningar att bestämma transfection effektivitet och M13KO7 före infektionsfrekvensen.
    1. Använd en flerkanalig pipett för att lägga 180 μL av 2YT media till varje brunn för en kolumn med en 96-mikrobrunn tallrik.
    2. Gör 8 tiofaldigt seriella utspädningar: överföra 20 μL av kultur från steg 1,29 till den första brunnen av plattan, mix av pipettering, och överföra 20 μL av blandningen till nästa väl. Upprepa detta steg till slutet av den seriella utspädningen.
    3. Platta 10 μL av varje seriell utspädning på LB/carb, LB/kan och LB/tet plattorna i två exemplar.
    4. Inkubera över natten vid 37 ° C.
    5. Formel för beräkning av effektivitet: anta att M är antalet genomsnittliga kolonin räknas från den utspädda vika 10N (N är från 1-8). E. coli SS320 electro-behöriga cell transfection effektivitet den Fab ryggraden phagemid från LB/carb plattan är lika M X 10N + 3 cfu/µg. Den M13KO7 före infektionsfrekvensen uppskattas från förhållandet mellan kolonierna i LB/kan och LB/tet. Procentandelen av E. coli SS320 behöriga celler transfekterade med den Fab ryggraden phagemid uppskattas från förhållandet mellan kolonier i LB/carb och LB/kan.

2. förbereda Uracil-innehållande ssDNA (dU-ssDNA) från mallen Phagemid

Obs: A tidigare rapporterat Fab ryggraden phagemid användes som mall för dU-ssDNA förberedelse15. Arkitekturen av den Fab ryggraden phagemid visas i figur 2. En plasmid spin kit (QIAprep Spin M13) används för utvinning av dU-ssDNA med smärre ändringar.

  1. Pre värma en LB/cmp platta (beredd och lagras vid 4 ° C för mindre än 1 - vecka-gammal) i en 37 ° C inkubator för 1 h. strimma ut en glycerol lager E. coli CJ236 celler (eller en annan dut−/ung− stam) med sterila loopar eller tips på förhand värmde LB/cmp plattan. Inkubera plattan vid 37 ° C över natten för cirka 12-15 h.
  2. Plocka en enda koloni med en steril spets och Inokulera i 2 mL av 2YT/cmp medium i ett 14-mL polypropylen runda-botten rör.
  3. Inkubera mediet vid 37 ° C under skakning på 200 rpm för 3-4 h tills OD600 nås på runt 0.4-0.8 (log fas tillväxt).
  4. Tillsätt 5-10 μL phage av Fab ryggraden mall i kulturen och inkubera vid 37 ° C under skakning på 200 rpm för 30 min att tillåta phage infektion.
  5. Efter inkubation, Använd en steril spets till strimma ut 10 μL av kultur på förhand värmde LB/carb plåt vid 37 ° C. Inkubera vid 37 ° C över natten för cirka 12-15 h.
  6. Plocka en enda koloni av den E. coli CJ236 innehållande Fab ryggraden phagemid att Inokulera en förrätt kultur av 3 mL 2YT/carb/cmp i ett 14-mL polypropylen runda-botten rör och växa vid 37 ° C under skakning på 200 rpm övernattning för ca 12 h.
  7. Inokulera 0,3 mL förrätt kultur i 30 mL 2YT/carb/cmp i en 250 mL förbryllad flaska.
  8. Inkubera cellkulturen vid 37 ° C under skakning på 200 rpm för 3-4 h tills OD600 nås på runt 0.4-0.8 (log fas tillväxt).
  9. Lägg till M13KO7 (lab lager, titer för ca 1 x 1013 cfu/mL) till kulturen från steg 2,8 med en multiplicity av infektion (MOI) cirka 10 och sista antikroppnivåns på M13KO7 är ca 1 x 1010 cfu/mL.
  10. Inkubera vid 200 rpm och 37 ° C i 1 h.
  11. Pellet kulturen genom centrifugering i en 50 mL runda-botten röret vid 5000 × g och 25 ° C i 20 min.
  12. Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten med 30 mL färsk 2YT/carb/kan/uridin. Över resuspension till en ny förbryllad 250 mL-flaska.
  13. Inkubera vid 200 rpm och 25 ° C för 22-24 h.
  14. Överföra kulturen från steg 2.13 i ett 50 mL runda-botten rör och centrifugera kulturen på 12.000 × g i 20 min för att separera phage supernatant från bakteriell cell pellets. Överför phage supernatanten till en ny 50 mL runda-botten rör och tillsätt 1/5 slutvolymen av PEG/NaCl-lösning att fälla phage. Blanda väl och inkubera på is för 30 min till fällningen phage partiklarna.
  15. Centrifugera vid 12 000 × g och 4 ° C i 30 min. Dekantera supernatanten och centrifugera vid 4000 × g och 4 ° C under 2 min. Aspirera återstående supernatanten.
  16. Återsuspendera pelleten phage i 2 mL steril-filtrerad 1 X PBS och överföring till 1,5 mL mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 12.000 × g i 5 min i en bänkmonterade mikrocentrifug ta bort eventuellt kvarvarande bakteriell skräp och överföra phage supernatanten till nya 1,5 mL mikrocentrifugrör och förvaras vid 4 ° C.
  17. Kontrollera uracil inkorporering effektiviteten i E. coli CJ236 genom jämförelse sida vid sida med E. coli SS320.
    1. Tillsätt 180 μL av 2YT media till varje brunn på en enda rad med en plattan med 96 brunnar.
    2. Göra tio 10-faldig seriella utspädningar: överföra 20 μL av phage supernatanten till den första brunnen av plattan, blanda genom pipettering och överföra 20 μL av blandningen till nästa väl. Upprepa detta steg till slutet av den seriella utspädningen.
    3. Tillsätt 10 μL av phage från åtta senaste seriespädningar att infektera 90 μl av E. coli CJ236 och E. coli SS320 i loggen fas (OD600 = 0,4-0,8). Inkubera vid 37 ° C i 30 min under varsam skakning.
    4. Platta 10 μL från seriell utspädning av varje infektion i E. coli CJ236 och E. coli SS320 på 2YT/Carb tallrikar i två exemplar.
    5. Inkubera över natten vid 37 ° C.
    6. Titer beräkningsformel: anta att M är antalet genomsnittliga kolonin räknas från den utspädda vika 10N (N är 1-10). Titern från E. coli CJ236 eller E. coli SS320 är lika med M X 10N + 2 cfu/mL. Uppskattning av uracil införlivandet från förhållandet titer av E. coli CJ236 och E. coli SS320 effektivitet.
  18. Tillsätt 1/100 mängd phage nederbörd bufferten MP i phage supernatanten i 1,5 mL mikrocentrifugrör och vänder upp och ner försiktigt för att blanda flera gånger. Inkubera vid RT i minst 2 min. Phage partiklar fälls ut från odlingssubstratet, och således en grumlig lösning ska synas på denna punkt.
  19. Gälla provet från steg 2.18 en plasmid spin kolumn (t.ex., QIAprep) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Bindande kapacitet ett spin kolumn för ssDNA når minst 10 µg. Centrifugera vid 6000 × g och 25 ° C under 30 s i en bänkmonterade mikrocentrifug. Kassera den genomströmmande som är i 1,5 mL mikrocentrifug röret. Phage partiklar vara bundna till kolumn matrisen i detta skede.
  20. Lägga till 0,7 mL UT-MLB phage lysis och bindande buffert (se diskussion) i kolumnen och inkubera vid RT i minst 1 minut.  Centrifugera vid 6000 x g och 25 ° C under 30 s och kassera genomflöde.
  21. Lägg till ytterligare 0,7 mL UT-MLB bufferten och inkubera vid RT i minst 1 minut.
  22. Centrifugera vid 6000 × g i 30 s. Kassera genomflöde. I detta skede, är phage coat protein skild från den dU-ssDNA, som fortfarande är bundna till kolumn matrisen.
  23. Lägg till 0,7 mL wash buffer PE innehållande etanol följa tillverkarens instruktioner. Centrifugera vid 6000 × g i 30 s och kassera genomflöde.
  24. Upprepa steg 2,23, sedan Centrifugera gång vid 6000 × g i 30 s för att ta bort kvarvarande buffert PE.
  25. Flytta kolumnen till ett nytt 1,5 mL mikrocentrifug rör och tillsätt 100 μL av eluering buffert EB (10 mM Tris· CL, pH 8,5) till mitten av kolumn membranet.
  26. Inkubera vid RT i 10 min och centrifugera vid 6000 × g i 1 min till eluera de dU-ssDNA. Ca, 1,5-2,5 μg dU-ssDNA/mL kultur kan erhållas.
  27. Analysera de eluerade DNA genom electrophoresing 1 μL på en 1% agaros TAE gel. DNA ska visas som ett huvudsakligen enda band med ingen smutskastning.
  28. För att bestämma DNA koncentration genom att mäta absorbansen på en nanodrop spektrofotometer vid 260 nm (en260 = 1,0 för 33 ng/μl av ssDNA). Typiska dU-ssDNA koncentrationer ligger inom 200-500 ng/μl.

3. Kunkels metod baserad oligonukleotiden riktad mutagenes

Anteckningar: Det är lämpligt att genomföra småskaliga reaktioner innan full skala reaktioner att säkerställa kvaliteten på de mutagena oligonukleotiden och reaktion komponenterna. En tecknad av Kunkels metod baserad riktad oligonukleotiden mutagenes visas i figur 3. Olika aminosyror mångfaldens introduceras in i CDRH1, CDRH2, CDRH3 och CDRL3 regioner med IMGT numreringen nomenklaturen16 (tabell 2). Den teoretiska aminosyra mångfalden av varje CDR, totala teoretiska aminosyra mångfald och oligonukleotiden sekvenser listas i tabell 2.

  1. Oligonukleotid fosforylering med T4 polynucleotide kinase
    1. Kombinera 0,6 μg av mutagena oligonukleotider, utformad för att mutera en enda CDR, med 2 μL 10 X TM buffert, 2 μL 10 mM ATP och 1 μL 100 mM DTT. Lägg till ultrarena H2O till en total volym på 18 μL i en 1,5 mL tub. För bygg-bibliotek ställs 4 separata och parallella fosforylering reaktioner motsvarande CDRH1, CDRH2, CDRH3 och CDRL3, respektive.
    2. Lägg till 20 U (2 uL) T4 polynucleotide-Kinas till varje rör och inkubera i 1 h vid 37 ° C (reaktion 1 i tabell 3). Användning omedelbart för glödgning.
  2. Glödgning av oligonukleotider till mallen
    1. Med 20 μg av dU-ssDNA mall, Lägg 25 μL 10 X TM buffert, 20 μL av varje fosforyleras oligonukleotiden lösning och ultrarena H2O till en slutlig volym av 250 μL på 0,5 mL tub. Blanda väl och överför till 0,20 mL PCR-rören (50 μL varje) som reaktion 2 i tabell 3. Dessa DNA-mängder ger en molar förhållandet 3:1 mellan oligonukleotiden och mall, antar att förhållandet längd av oligonukleotiden och mallen är 1: 100.
    2. Inkubera reaktionen i en PCR-maskin vid 90 ° C för 3 min, 50 ° C för 3 min, och 20 ° C i 5 min.
  3. Enzymatisk syntes av CCC-dsDNA
    1. Till 250 μL glödgas oligonukleotiden/mall blandningen, tillsätt 10 μL 10 mm ATP, 10 μL av 25 mM dNTP mix, 15 μL av 100 mM DTT, 30 Weiss enheter T4 DNA-ligase och 30 U T7 DNA-polymeras som reaktion 3 i tabell 3.
    2. Inkubera reaktionen i 1,5 mL röret vid 20 ° C över natten.
    3. Tvätta och koncentrera den syntetiserade CCC-dsDNA i en 0,5 mL centrifugal filterenhet med 30 kDa pore storlek membran på RT.
      1. Överföra övernattning reaktionsblandningen till enhetens filter och Lägg till ultrarena H2O 400 µL slutlig volym. Snurra på 14.000 × g i ca 10 min; volymen är mindre än 50 μL.
      2. Kassera flödet genom, tillsätt 400 µL av ultrarena H2O i filtret och snurra på 14.000 × g i 10 min.
      3. Upprepa steg 3.3.3.2 gång.
      4. Placera filtret uppochner i en ren mikrocentrifug rör till återvinna den CCC-dsDNA. Snurra på 1 000 × g i 2 min; återvunna volymen är i allmänhet omkring 20-40 μl. Den återvunna CCC-dsDNA kan användas omedelbart för elektroporation av E. coli eller fryst vid-20 ° C för senare användning. Normalt 20-40 μg CCC-DNA kan erhållas.
    4. Electrophorese 1,0 µL av eluerade reaktionsprodukten tillsammans med dU-ssDNA mallen att visualisera resultatet av reaktionen.

4. elektroporation och beräkning av storleken på bibliotek

  1. Chill den renade CCC-dsDNA (20 μg i en maxvolym på 50 μL) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och en 0,2-cm lucka elektroporation kyvetten på is.
  2. SOC media i ett 50mL polypropylen koniskt centrifugrör i 37 ° C vattenbad i minst 30 min före varma 20 mL.
  3. Tina en 350 μL alikvot av electro-behöriga E. coli SS320 på is. Lägga till celler till DNA och blanda grundligt genom pipettering flera gånger. Undvika att införa bubblor.
  4. Överför blandningen till kyvetten och utföra elektroporation följa tillverkarens instruktioner. Till exempel när BTX ECM-630 elektroporation systemet används, är relevanta inställningar 2,5 kV fältstyrka, 125 Ω motstånd och 50 µF kapacitans.
  5. Omedelbart rädda electroporated cellerna genom att tillsätta 1 mL före värmde SOC medium och överföra till 17 mL för SOC medium i 125mL-kolv. Skölj kyvetten två gånger med 1 mL av SOC medium och överföring till samma kolven (slutlig volym är 20 mL).
  6. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C under skakning på 200 rpm.
  7. Bestämma elektroporation effektivitet.
    1. Tillsätt 180 μL av 2YT media till varje brunn för en kolumn med en 96-mikrobrunn tallrik.
    2. Gör 8 tio gånger seriella utspädningar: överföra 20 μL av 20 mL kulturen till den första brunnen av plattan, blanda med pipettering och överföra 20 μL av blandningen till nästa väl. Upprepa detta steg till slutet av den seriella utspädningen.
    3. Platta 10 μL av varje av de seriella utspädningarna på en LB/carb tallrik i två exemplar. Tallrik 100 µL kvar från varje de seriella utspädningarna på separata LB/carb plattor för kolonin greve avstämning. Dessa plattor ger också enda kloner för ELISA och sekvens analys (avsnitt 5).
    4. Inkubera över natten vid 37 ° C.
    5. Räkna kolonierna från 10 μL dubbletter på LB/carb plattan. Anta att M är den genomsnittliga kolonin antal räknade på 10N vik LB/carb plattan (N är från 1-8). Den totala bibliotek storleken är lika med 2 M X 10N + 3 kolonier.
  8. Alikvot kulturen från steg 4,6 lika till två 2-L förbryllad kolvar, vardera innehållande 500 mL av 2YT/carb/kan medium för phage bibliotek generation.
  9. Inkubera vid 37 ° C under skakning på 200 rpm övernattning för ca 16 h.
  10. Överföra kulturen till två 1-L Ånghärdad centrifug flaskor och Centrifugera under 30 minuter vid 12.000 × g vid 4 ° C.
  11. Överför supernatanten till två nya 1-L Ånghärdad centrifug flaskor och tillsätt 1/5 slutvolymen av PEG/NaCl-lösning att fälla phage. Inkubera i isen i 30 min.
  12. Centrifugera i 30 min på 12.000 × g och 4 ° C. Försiktigt Dekantera supernatanten och undvika att störa den phage pellet. Snurra för 1 min vid 4000 x g och ta bort återstående supernatanten med en pipett.
  13. Återsuspendera pelleten phage med 20 mL sterilt-filtrerad 1 X PBS-bufferten och överföring till en ny 50 mL tub.
  14. Pellet olösliga frågan genom centrifugering för 5 min vid 12 000 × g och 4 ° C. Överför supernatanten till en ny 50 mL tub.
  15. Mätning av phage koncentrationen av spektrofotometer (OD268 = 1,0 för en lösning av 5 X 1012 phage/mL).
  16. Justera phage koncentration till 5 X 1012 phage/mL i 1 X PBS med 10% ultrarena glycerol.
  17. Alikvotens 1 mL phage lösning per 1,5 mL mikrocentrifug rör. Använda biblioteken omedelbart för panorering eller lagra vid-80 ° C.

5. kvalitetsbedömning av Protein A / L direkt bindande ELISA Assay och sekvensering

  1. Slumpmässigt välja 96 enstaka kolonier på LB/carb tallrik från steg 4.7.3 i en 96-djupt väl kultur plattan som innehåller 800 μL av 2YT/carb i varje brunn. Inkubera under 3-4 timmar vid 37 ° C med skakningar vid 1000 rpm till OD600 = 0.4-0.8.
  2. Tillsätt 100 μL av M13KO7 (1 X 1011 cfu/mL) till varje brunn i en 96-djup väl kultur plattan med en flerkanalspipett. Inkubera vid 37 ° C med skakningar vid 1000 rpm för 1 h.
  3. Tillsätt 100 μL av 2YT innehåller 10 X koncentration av kanamycin (500 μg/mL) till varje brunn med en flerkanalspipett. Inkubera över natten vid 37 ° C med skakningar vid 1000 rpm.
  4. Lös upp protein L till 1 µg/mL i 1 X PBS. 3/4 kappa av brunnarna i en 384-väl hög proteinbindning polystyren plattan med 30 µL per brunn av protein L lösningen. Inkubera över natten vid 4 ° C.
  5. Kassera den natten protein L beläggning lösningen från steg 5,4. Tillsätt 50 µL av M-PBST (blockerande lösningen) till alla brunnar i 384-väl hög proteinbindning polystyren plattan med en flerkanalspipett. Inkubera plattorna på en mikroplattan shaker för 1 h på RT.
  6. Snurra ner över natten kulturen från steg 5.3 i en djup 96-väl kultur plattan vid 3 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Phage är i supernatanten.
  7. Kassera den blockerande lösningen från steg 5,5. Lägga till 15 μL av M-PBST och 15 μL av varje phage supernatant (steg 5,6) 3 av protein L belagda brunnarna som tre exemplar, och 1 icke-belagda väl som negativ kontroll med hjälp av en flerkanalspipett. Inkubera vid RT för 1 h med skakningar vid 200 rpm.
  8. Kassera phage lösningen. Tvätta plattan 6 gånger med 80 μl PBST av en automatiserad tallrik bricka.
  9. Tillsätt 15 μL av M-PBST och 15 μL av Protein A-HRP (1:1, 500 utspädd i 1 X PBS) till varje brunn med en flerkanalspipett och inkubera vid RT för 1 h med skakar på ca 200 rpm.
  10. Kassera Protein A-HRP/M-PBST lösningen. Tvätta plattan 6 gånger med 80 μl PBST.
  11. Lägg till TMB substrat (30 μl per brunn) med en flerkanalspipett och inkubera i 2-3 min tills färgen utvecklar. Stoppa reaktionen med 1,0 M H3PO4 (30 μl per brunn).
  12. Läs plattorna spektrofotometriskt vid 450 nm. Positiva kloner definieras som de som uppvisar ett genomsnittligt förhållande av OD450 absorbansen av protein L brunnar till den väl större än 3,0 M-PBST.
  13. I en 96-djup väl, infektera 50 μL av SS320 i 2YT/tet på loggen fas med 5 μL av den samma phage används för ELISA (steg 5,6) under 30 minuter vid RT.
  14. Lägg till 950 μL av 2YT/carb på 96-djupet väl från steg 5.13 och inkubera över natten vid 37 ° C med skakningar vid 1000 rpm.
  15. Extrahera phagemid DNA av mini prep DNA extraktion kit. Använda uppströms primers av VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') och VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') för sekvensanalys att uppskatta bibliotek sekvens mångfalden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Följande flödesschema av Fab bibliotek konstruktion (se figur 1), vi beredda M13KO7 helper phage pre infekterad E. coli SS320 electro-kompetenta celler. Effektiviteten i dessa electro-kompetenta celler uppskattas 2 X 109 cfu/µg när Fab phagemid ryggraden för bibliotek konstruktion användes (figur 4).

Uracil inkorporering effektivitet var genom jämförelse av titer i både E. coli CJ236 och E. coli SS320 celler kontrolleras. E. coli CJ236 och E. coli SS320 cellerna smittades av phage härbärgerat dU-ssDNA. E. coli SS320 har enzymer (dUTPase och uracil glykosylas) som kan försämra uracil-innehållande DNA, medan E. coli CJ236 saknar dessa enzymer och kan inte försämra som innehåller uracil DNA. För att uppnå en acceptabel uracil inkorporering effektivitet, måste titrar från E. coli CJ236 vara minst 104 gånger högre än de från E. coli SS320. Annars kommer att vildtyp befolkningen öka i Byggyta antikroppsbiblioteket på grund av ineffektiva uracil inkorporering. Figur 5 visade att titern från E. coli CJ236 är cirka 3 X 105 gånger högre än från E. coli SS320, som anger en effektiv uracil införlivande phage ssDNA.

Nästa, vi förberett och extraherade dU-ssDNA. DU-ssDNA renhet kontrolleras av agaros gel-elektrofores (figur 6). Då det oligonukleotiden riktad mutagenicitet genomfördes och effektiviteten i dU-ssDNA omvandlingen till CCC-DNA utvärderades (figur 6). Tre produkter med lägre motilitet än dU-ssDNA kan visualiseras på gel inklusive snabbaste-kör bandet (CCC-dsDNA), det mellersta svaga bandet (nicked band) och långsammaste-kör bandet (strand-förflyttade DNA).

Efter elektroporation i E. coli SS320, biblioteket storleken uppskattades från natten inkubation plattan (se steg 4.7.5). Den genomsnittliga bibliotek storleken var 5 X 109 från dubbla seriespädningar på LB/carb tallrikar (figur 7). Den uppskattade storleken på detta steg kan dock innehålla phage som inte visar Folkesson på grund av närvaron av en frameshift eller stoppa codon, eller Visa felveckning Folkesson. Sekvensering och ELISA användes att uppskatta funktionella mångfalden av konstruerade bibliotek. 96 slumpmässigt plockade enda kloner skickades för sekvensering analys. Tabell 4 visar att 90 av 96 slumpmässigt plockade enda klonerna var framgångsrikt sekvenserade, som innehåller 70 kloner utan en tidig stop-kodon (53 kloner med minst en CDR mutant) och 17 kloner med den wild-type-sekvensen och 20 kloner med en för tidig stop kodon på olika regioner. Inom 70 klonerna är mutant CDRH1, CDRH2, CDRH3 och CDRL3 50%, 57%, 53% och 56%, respektive, medan andelen muterade med minst en CDR är 76%. I de 20 klonerna med en tidig stop kodon (90%) härrör den förtida stop kodon huvudsakligen från frameshift av oligonukleotiden mutagenes primers, inklusive 45% (CDRH1), 10% (CDRH2), 15% (CDRH3) och 20% (CDRL3).

Att upptäcka visningen av ordentligt vikta Folkesson, en protein A / L baserade ELISA var anställd eftersom det är känt att protein A och protein L kan identifiera rätt vikning av VH framework och VL ram, respektive17,18. I samförstånd med sekvensering analysen visade ELISA-testet i tre exemplar (figur 8) att 20 kloner med en tidig stop kodon var alla negativa medan 17 kloner med en wild-type-sekvens var alla positiva när positiva förhållandet var empiriskt inställd på 3.0. För 53 kloner med minst en CDR mutant var 43 kloner positiva i ELISA medan 10 kloner var negativa. Detta indikerar att de flesta av klonerna veks väl medan de cdr-skivor från 10 kloner kan ha skadliga effekter på Fab vikning. Totalt 43 kloner av 90 kloner (48%) var väl vikta och innehöll minst en CDR mutant. Det funktionella aminosyra mångfalden av konstruerade biblioteket baserat på protein A / L ELISA och sekvens analys beräknades till 2,4 X 109 (dvs, 48% av 5 X 109).

Figure 1
Figur 1: översikt över phage-visas Fab bibliotek byggandet. Phage-visas Fab bibliotek konstruktion följer en grundläggande serie steg. Det handlar om förberedelse av högeffektiv electro-behöriga bakterieceller, utvinning av dU-ssDNA, Kunkels metod baserad oligonukleotiden riktad mutagenes, elektroporation och beräkning av phage Fab bibliotek storlek, funktionell utvärdering av protein A / L ELISA, och DNA-sekvens analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Phagemid arkitekturen för Fab bibliotek byggande. De grundläggande funktionerna i phagemid ryggrad består av ursprunget till enkelsträngat (f1 ori) och dubbelsträngat (dsDNA ori) DNA replikation och en ampicillin/carbenicillin motstånd gen (AmpR). För Fab display, under kontroll av promotorn alkaliskt fosfatas (PhoA), phagemid innehåller en bicistronic kassett till drive uttryck och utsöndring av: ljus kedja (LC) bestående av en sekretion signal, VL (variabel region av lätt kedja), CL (konstant regionen av lätt kedja), och C-terminal flagga tagg; och tung kedja (HC) bestående av en sekretion signal, VH (variabel region av tung kedja) och CH1 (konstant region 1 av tung kedja) smält med en p3 phage mindre coat protein. Ljusslinga och församling tung kedja till Fab inom det E. coli periplasm styr visningen av Fab på phage ytan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schematisk bild av Kunkels metod baserat oligonukleotiden riktad mutagenes. I detta protokoll använde vi Kunkels metod för att förbereda dU-ssDNA mall. Oligonukleotider för CDRH1, CDRH2, CDRH3 och CDRL3 med designade mångfald är fosforyleras glödgas i mallen och används för att konvertera ss-DNA till CCC-dsDNA. Efter elektroporation i E. coli SS320 electro-kompetenta celler, heteroduplex DNA repareras till antingen den vilda typen eller den muterade formen; På grund av närvaron av uracil i vildtyp Stranda, reparationsprocessen gynnar den mutanta formen, och således den muterade formen dominerar biblioteket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Uppskattning av M13KO7 pre infekterad E. coli SS320 electro-behöriga celleffektivitet. En phagemid ryggraden vektor användes för att kontrollera elektroporation effektiviteten hos behöriga cellerna. Formel för att beräkna effektiviteten är som följer: anta att M är antalet genomsnittliga kolonin räknas från den mest utspädda vika 10N (N är från 1-8) i två exemplar. E. coli SS320 effektivitet från LB/carb plattan är lika M X 10N + 3 cfu/µg. Effektiviteten av de electro-kompetenta cellerna är cirka 2 X 109 cfu / µg. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Bedömning av uracil införlivande ssDNA av phage infektion i E. coli CJ236 och E. coli SS320 celler. Baserat på Kunkels metod, uracil inkorporering effektivitet kontrolleras genom jämförelse mellan phage infektion titer i både E. coli CJ236 och E. coli SS320 celler. Titer beräkningsformeln är följande: anta att M är antalet genomsnittliga kolonin räknas från den mest utspädda vika 10N (N är 1-10), och att titern från E. coli CJ236 eller E. coli SS320 är lika med M X 10N + 2 cfu/mL. Effektiviteten av uracil inkorporeringen kan uppskattas från förhållandet titer av E. coli CJ236 och E. coli SS320. Titern i E. coli CJ236 var 9 X 1012 cfu/mL medan titern i E. coli SS320 var 3 X 107 cfu/mL. Titer var av E. coli CJ236 och E. coli SS320 3 X 105. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: konvertering av dU-ssDNA CCC-DNA av oligonukleotiden riktad mutagenes. Efter oligonukleotiden riktad mutagenes utvärderades effektiviteten i dU-ssDNA konvertering till CCC-DNA. dU-ssDNA konverterades helt mot dsDNA. Dominerande bandet är CCC-dsDNA medan det finns en mindre del av nicked dsDNA och strand-förflyttade DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Phage titrering för beräkning av bibliotek storlek. Efter elektroporation i E. coli SS320 uppskattades bibliotek storlek från seriespädningar på LB/carb tallrikar. Formeln för beräkning av storlek är följande: Antag M är antalet genomsnittliga kolonin räknas från den mest utspädda vika 10N från en 2YT/Carb tallrik (N är från 1-8), storlek är lika med 2 M X 10N + 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Protein A / L direkt bindande phage ELISA. Protein L kan känna igen ramen för väl vikta kappa lätt kedja VL och protein en kan känna igen ramen för väl vikta tung kedja VH. Bindningen av Fab med protein L och A anger korrekt vikning av både tung kedja och ljusslinga. I korthet protein L i tre exemplar och den negativa kontrollen M-PBST var belagda till plattan, Fab phage supernatanterna från olika kloner inkuberades med protein L och M-PBST, sedan efter tvätt, protein A-HRP användes för att fånga bundna Fab phage. Phage ELISA avläsningar visade 90 slumpmässigt plockade kloner med framgångsrika sekvensering avläsning. En tröskel linje som representerar klonen som positivt var empiriskt definieras där OD450 absorbansvärde från protein L (medelvärde av tre exemplar med felstapel) kontra negativa kontrollen var mer än 3.0. Tre grupper utifrån sekvensering analys visades, motsvarar en mutant utan stop kodon i rött (53 kloner), vildtyp (WT) i blått (17 kloner) och mutant med stop kodon i grönt (20 kloner). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Reagens setup Komponent Belopp kommentarer/Beskrivning
2YT medium Jästextrakt 10 g Tillsätt ultrarent vatten att göra upp volymen till 1.0 L, justera pH till 7,0, autoklav.
Trypton 16 g
NaCl 5 g
2YT topp agar Jästextrakt 10 g Tillsätt ultrarent vatten för att göra upp volymen till 1,0 L och justera pH till 7,0, värme att upplösa, autoklav.
Trypton 16 g
NaCl 5 g
Granulerad agar 7,5 g
2YT/carb/cmp medium Carbenicillin 100 μg/mL
Kloramfenikol 10 μg/mL
2YT/carb/kan/uridin medium Carbenicillin 100 μg/mL
Kanamycin 50 mikrog/mL
Uridin 0,25 μg/mL
2YT/carb/tet medium Carbenicillin 100 μg/mL
Tetracyklin 10 μg/mL
2YT/carb medium Carbenicilin 100 μg/mL
2YT/kan medium Kanamycin 50 mikrog/mL
2YT/kan/tet medium Kanamycin 50 mikrog/mL
Tetracyklin 10 μg/mL
2YT/tet medium Tetracyklin 10 μg/mL
2YT/cmp medium Kloramfenikol 10 μg/mL
LB medium agar Jästextrakt 5 g Tillsätt ultrarent vatten att göra upp volymen till 1.0 L, justera pH till 7,0, autoklav. För LB agar, tillsätt 20 g granulerad agar, autoklav.
Trypton 10 g
NaCl 10 g
LB/carb plattor LB agar 1L
Carbenicillin 100 μg/mL
LB/tet plattor LB agar 1 L
Tetracyklin 10 μg/mL
LB/cmp plattor Kloramfenikol 10 μg/mL
LB/kan plattor Kanamycin 50 mikrog/mL
SOC medium Jästextrakt 5 g Tillsätt ultrarent vatten för att göra upp volymen till 1,0 L och justera pH till 7,0, autoklav.
Trypton 20 g
NaCl 0,5 g
KCl 0,2 g
2,0 M MgCl2 5,0 mL
1,0 M glukos 20 mL
Superbroth medium Trypton 12 g Tillsätt ultrarent vatten till 900 mL, autoklav, tillsätt 100 mL av Ånghärdad 0.17 M KH2PO4, 0,72 M K2HPO4.
Jästextrakt 24 g
Glycerol 5 mL
Superbroth kan/tet medium Kanamycin 50 mikrog/mL
Tetracyklin 10 μg/mL
1 X PBS NaCl 137 mM Justera pH-värdet till 7,2, autoklav.
KCl 3 mM
Na2HPO4 8 mM
KH2PO4 1,5 mM
TAE-och/eller agarosgel TAE buffert
Agaros 1% (w/v)
GelRed 1:10000 (v/v)
TMB-substratet TMB 50% (v/v)
H2O2 peroxidas substrat 50% (v/v)
M-PBST buffert 1 X PBS 100 ml
Tween-20 0,05% (v/v)
Fettfri mjölkpulver 5% (v/v)
5 X PEG/NaCl PEG-8000 20% (w/v) Tillsätt ultrarent vatten gör upp volymen till 1L och autoklav.
NaCl 2,5 M
PBST buffert 1 X PBS 1 L 0,22 μm filter-sterilisera.
Tween-20 0,05% (v/v)
10 x TM buffert MgCl2 0,1 M Justera pH till 7,5.
Tris 0,5 M
1,0 mM HEPES, pH 7,4 1,0 M HEPES 4,0 mL 0,22 μm filter-sterilisera.
Ultrarent vatten 4,0 L
10% (v/v) ultrarena glycerol Ultrarena glycerol 100 ml 0,22 μm filter-sterilisera.
Ultrarent vatten 900 mL
Ultrarent vatten H20 DNAS-fri, Rnase-fri, pyrogenfri.

Tabell 1: Reagens setup.

Table 2
Tabell 2: CDR mångfalder och mutagenes primers. De DNA-sekvenserna av Regionkommittén CDR att vara muterade visas i rött; sekvenserna är formaterade med hjälp av IUPAC-nukleotid koden. ”X” anger tri-nukleotid från en blandning avsedda att innehålla olika aminosyra uppsättningar; ”n” visar olika antal X. fem grundfärger med olika antal X användes att diversifiera CDRL3 eller CDRH3, respektive, för att generera varierande längd på CDRL3 och CDRH3. Rester siffrorna definieras av IMGT nomenklaturen. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.

Kunkels metod baserat mutagenes
Reaktion 1. Oligonukleotid fosforylering med T4 polynucleotide kinase
Komponent Belopp Slutliga
mutagent oligonukleotider 0,6 μg
10 x TM buffert 2 ΜL 1 X
10 mM ATP 2 ΜL 1 mM
100 mM DTT 1 ΜL 5 mM
T4 polynucleotide kinase (10 U/μL) 2 ΜL 20 U
Ultrarena H20 Upp till 20 μL
Reaktion inställning
Steg 1. 37 ° C i 1 h
Reaktion 2. Glödgning av oligonukleotider till mallen
Komponent Belopp Slutliga
dU-ssDNA mall 20 μg 20 μg
10 x TM buffert 25 ΜL 1 X
intracellulärt fosforylerade CDRH1 oligonukleotider 20 ΜL 0,6 μg
intracellulärt fosforylerade CDRH2 oligonukleotider 20 ΜL 0,6 μg
intracellulärt fosforylerade CDRH3 oligonukleotider 20 ΜL 0,6 μg
intracellulärt fosforylerade CDRL3 oligonukleotider 20 ΜL 0,6 μg
Ultrarena H20 Upp till 250 μL
Reaktion inställning
Steg 1. 90 ° C i 3 min
Steg 2. 50 ° C för 5 min
Steg 3. 20 ° C för 5 min
Reaktion 3. Enzymatisk syntes av CCC-dsDNA
Komponent Belopp Slutliga
glödgad oligonukleotider/mall blandningar 250 ΜL
10 mM ATP 10 ΜL 346 µM av varje nukleotid
dNTP mix (25 mM av varje nukleotid) 10 ΜL 865 µM av varje nukleotid
100 mM DTT 15 ΜL 5 mM
T4 DNA-ligase 1 ΜL 30 Weiss enheter
T7 DNA-polymeras 3 ΜL 30 U
Reaktion inställning
Steg 1. 20 ° C för övernattning

Tabell 3: Förfaranden och komponenter av Kunkels metod baserat reaktion.

Grupp Klon nummer Region Andel
Ingen tidig stop kodon 70 CDRH1-mutation 50% (35/70)
CDRH2-mutation 57% (40/70)
CDRH3-mutation 53% (37/70)
CDRL3-mutation 56% (39/70)
Minst en CDR-mutation 76% (53/70)
För tidig stop kodon 20 CDRH1 defekt 45% (9/20)
CDRH2 defekt 10% (2/20)
CDRH3 defekt 15% (3/20)
CDRL3 defekt 20% (4/20)
Andra fel 10% (2/20)

Tabell 4: Analys av CDRH1, CDRH2, CDRH3 och CDRL3 från syntetiska Fab biblioteket i sekvens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att konstruera hög mångfald, phage-visas Fab bibliotek, kvalitetskontroll behövs kontrollpunkter för att övervaka olika skeden av byggprocessen, inklusive kompetensen av electro-kompetenta celler, kvaliteten på mallen dU-ssDNA, effektivitet CCC-dsDNA syntes, titer efter elektroporation, Fab vikning och aminosyra mångfald av cdr-skivor av sekvensanalys av Fab-phage kloner.

Hög avkastning och renhet av dU-ssDNA är viktigt för hög mutagenes. Vår erfarenhet, kan phage induktion vid 25 ° C under natten ge mer dU-ssDNA än från phage induktion vid 37 ° C under natten. Detta är överens med en tidigare rapport19. Angående ssDNA utvinning innehöll första plasmiden Spin kit (QIAprep) MLB för phage lysis och bindande. MLB var senare avbröt med okänd anledning och ersättas med PB. Vi hittade att utbytet av dU-ssDNA är mycket lägre från PB behandling jämfört med att från MLB behandling. I detta protokoll använde vi ett reagens som heter UT-MLB20 att ersätta MLB och hittade avkastningen av dU-ssDNA är liknande den från den ursprungliga snurra Kit.

Som CDRH3 och CDRL3 är de mest olika regionerna för antigen erkännande21, att införa en skräddarsydd mångfald med en specifik uppsättning aminosyra kombinationer och nyckeltal, och ta bort redundans bias och stop-kodon infördes genom degenererade kodon såsom NNK (N, equimolar/c/G/t; K, equimolar av G/T), trimer kodon phosphoramidite-baserade oligonukleotider22 med exakt en trimer kodon motsvarar en specifik aminosyra var avsett för CDRH3 och CDRL3. Dessutom användes variabla längder av CDRH3 och CDRL3 oligonukleotider att ytterligare öka mångfalder.

Efter enzymatisk syntes av CCC-dsDNA, generellt tre band observeras av agaros gel-elektrofores och banden bör vara klar utan utstryk. Bland dem är snabbaste-kör bandet den CCC-dsDNA som kan ge en hög mutationshastighet (cirka 80%) efter elektroporation23. Långsammaste-kör bandet är strand-förflyttade DNA som uppstår från inneboende strand-deplacement aktivitet T7 DNA-polymeras och har en låg mutationen klassar (runt 20%)23. Det mellersta svaga bandet är trasiga DNA efter förlängning på grund av otillräcklig T4 DNA-ligase aktivitet eller otillräcklig oligonukleotiden fosforylering.

En liten sekvensering prov pool var används för att uppskatta bibliotek mångfalden men inte exakt24. För att uppskatta den verkliga mångfalden korrekt, kan nästa generation sequencing (NGS) vara ett bra alternativ i gruvdrift mångfald djupet av de konstruera bibliotek25. I praktiken, på grund av de nuvarande utmaningarna på NGS teknik inklusive läsa längd, precision, kostnad och hög genomströmning, sekvensering av Fab phage biblioteket används i detta protokoll med längden på omkring 950 bp som spänner över CDRH1, CDRH2, CDRH3 och CDRL3 är inte kan uppnås; Det är dock möjligt att uppskatta scFv (cirka 700 bp) bibliotek mångfald inom spänna av miljontals24,25. En annan nyckel standard att utvärdera mångfalden av konstruerade bibliotek är att använda biblioteket att panorera mot många olika typer av antigener och beräkna de positiva kloner tagna eftersom biblioteket mångfald är direkt korrelerad med andelen framgångsrika antigen panorering26. Hög genomströmning urval plattform är väl lämpad för detta ändamål och läsare kan hänvisa till ett detaljerat protokoll som rapporterats av Miersch et al. 27

Teoretiskt, phage-visas syntetiska antikropp bibliotek med skräddarsydd mångfald kan användas för att rikta någon antigen och därmed har breda program. För närvarande kan beroende företag inklusive Cambridge antikropp teknik (CAT), MedImmune, Genentech, Dyax, Bioinvent, Pfizer och MorphoSys starkt phage display plattformar för terapeutiska antikroppar utveckling28. Dessutom har många phage display core teknik patent löpt ut29. Detta utan tvivel kommer att frigöra phage-visas antikropp teknik maximala potential.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna uppskattar Dr Frederic Fellouse från Sidhu lab för kritiska synpunkter på Kunkels metod baserad syntetisk Fab phage bibliotek konstruktion. Författarna uppskattar Mrs. Alevtina Pavlenco och andra medlemmar från Sidhu lab för värdefull hjälp med att förbereda högeffektiv electro-behöriga E. coli celler och hög kvalitet dU-ssDNA. Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation Kina (Grant No.: 81572698, 31771006) till DW och vid ShanghaiTech universitet (Grant No.: F-0301-13-005) till laboratorium av antikropp Engineering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9, (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21, (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34, (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253, (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228, (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8, (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2, (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425, (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27, (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9, (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58, (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31, (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22, (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12, (5), e0177574 (2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81, (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16, (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28, (5), 538-544 (2011).
Byggandet av syntetiska Phage visas Fab bibliotek med skräddarsydd mångfald
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).More

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter