Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Строительство синтетических Фаговые отображается ВСБ библиотеки с учетом разнообразия

Published: May 1, 2018 doi: 10.3791/57357
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 1,2,3, 1, 1
1Laboratory of Antibody Engineering, Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University, 2Banting and Best Department of Medical Research, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Molecular Genetics, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает подробную процедуру на строительство библиотеки отображается Фаговые синтетических антитела с учетом разнообразия. Синтетические антитела имеют широкое применение от фундаментальных исследований для диагностики заболеваний и терапии.

Abstract

Ежегодно растет спрос на моноклональных антител (mAbs) в фундаментальных исследований и медицины. Гибридомной технологии был доминирующим методом развития МАБ начиная со своего первого доклада в 1975 году. Как альтернативная технология ФАГ методы отображения для развития МАБ становятся все более привлекательными, поскольку Humira, первым антителом, фаг производные и один из бестселлеров mAbs, был одобрен для клинического лечения ревматоидного артрита в 2002 году. Как не животного на основе технологии развития МАБ, фаг дисплей обходит иммуногенность антигена, гуманизации и животных обслуживания, которые требуются от традиционных гибридомной технологии на основе антител развития. В этом протоколе мы описываем метод для построения синтетических ФАГ отображается Fab библиотек с различий можно получить с одного электропорации 1010 9-10. Этот протокол состоит из: 1) электро компетентных клеток высокой эффективности подготовки; 2) добыча урацил содержащих одноцепочечной ДНК (дю ssDNA); 3) метод Канкел основе олигонуклеотида Направленный мутагенез; 4) электропорации и расчет размера библиотеки; 5) белка на основе A/Л энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для складывания и функциональное разнообразие оценки; и 6) анализ последовательностей ДНК разнообразия.

Introduction

mAbs имеют широкое применение, начиная от фундаментальных исследований для диагностики заболеваний и терапии. Начиная с 2016 года более чем 60 mAbs были одобрены Соединенных Штатов продовольственной и наркотиков администрации (АППМ) для клинического лечения аутоиммунных заболеваний, рака и инфекционных заболеваний в1,2.

В 1975 году Колер и Мильштейн сообщили, что техника для непрерывного поколения антител одного клоновых специфичности от клеточного источника называют «hybridomas» и этот метод впоследствии стать краеугольным камнем в медицине и промышленности3 ,4. Поколение mAbs этот метод требует различные шаги, в том числе производство антигена, мыши иммунизации, извлечения лимфоцитов B, слияния клеток B с миеломой клетки сформировать Бессмертный hybridoma клетки, клон выбор и для терапевтического применения, Гуманизация требуется избежать человеческих антител анти мыши (HAMA)4,5. Однако для этой технологии, антигены, включая токсины, патогенов и высоко сохраненных белков являются относительно неэффективными в провоцировании в vivo иммунный ответ для mAb производства5.

В 1978 году Хатчинсон et al. сообщили об использовании олигонуклеотида для прямого мутагенеза остатков в одноцепочечной бактериофага вирус6. В 1985 году Смит сообщила, что иностранные гена фрагменты могут сливается в рамке с гене шифруя протеин пальто Фаговые III и таким образом могут быть отображены на поверхности Фаговые без ущерба для его инфективности7. Эти новаторские работы заложили фундамент для последующего строительства библиотек ФАГ отображается антител в иммунной, наивно, и синтетические формы с форматами переменной фрагмент одной цепи (scFv) и антиген связывая фрагмент (ФАБ) для терапевтических МАБ развития8,9. С технической точки зрения ФАГ дисплей на основе антител развития предлагает дополнительный подход к развитию на основе гибридомной МАБ, которые могут помочь обойти ограничения, которые могут представлять некоторые антигены и гуманизации процесса гибридомной полученные антител часто требуют5. По состоянию на 2016 6 Фаговые дисплей производные mAbs были одобрены на рынке, включая Humira, один из самых успешных mAbs, используется для лечения ревматоидного артрита, и многие кандидаты Фаговые отображения полученных антител в настоящее время находятся на различных стадиях клинических расследование10.

Для иммунной и наивно Фаговые антитела библиотек, разнообразие взаимодополняемости определение регионов (CDR) в легких и тяжелых цепи является производным от природных иммунной репертуар (т.е., от клетки B). В противоположность этому разнообразие CDR-файлов в библиотеках антитела синтетических Фаговые полностью искусственный. Синтетические подходы к построению библиотеки обеспечивают точный контроль над дизайн последовательности разнообразия и предлагают возможности для механистический исследования структуры антител и функционировать11,12. Кроме того рамки для синтетических библиотек может быть оптимизирована до строительства библиотеки для облегчения вниз по течению, крупномасштабного промышленного развития11,12.

В 1985 году, Канкел сообщили одноцепочечной ДНК (ssDNA) на основе шаблона мутагенеза подход эффективно представить сайт направленных мутаций в бактериофага M1313. Этот подход был впоследствии широко используется для строительства ФАГ отображается библиотек. Химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК предназначена внести разнообразие в Fab CDR включены в phagemid с шаблоном позвоночника антитела. В этом процессе phagemid выражается в урацил содержащих ssDNA (дю ssDNA) и олигонуклеотиды отожженная на CDR и продлил синтезировать двуцепочечной ДНК (dsDNA) в присутствии Т7 ДНК-полимеразы и T4 ДНК лигаза. Наконец сгенерированный ds ДНК может быть введено в Escherichia coli электропорации.

Высокое разнообразие, фаг отображается библиотека строительство, электропорация высоковольтные двухкомпонентная смесь электро компетентных клеток и ковалентно закрытой круговой dsDNA (CCC-dsDNA) должен быть подготовлен тщательно. Сидху et al. изменения подготовки электро компетентных клеток и ДНК от традиционных методов и значительно улучшенная библиотека разнообразия14.

В этом протоколе мы описываем метод для построения синтетических ФАГ отображается Fab библиотек с различий можно получить с одного электропорации 1010 9-10. Рисунок 1 показывает обзор строительства библиотеки, в том числе: 1) электро компетентных клеток высокой эффективности подготовки; 2) добыча dU-ssDNA; 3) метод Канкел основе олигонуклеотида Направленный мутагенез; 4) электропорации и расчет размера библиотеки; 5) белок A/Л-на основе ELISA для складывания и функциональное разнообразие оценки; и 6) анализ последовательностей ДНК разнообразия. Штаммов, реагенты и оборудование, перечислены в таблице материала. Таблица 1 показывает установки реагента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Стерильные советы фильтр должен использоваться во всем при работе с Фаговые чтобы избежать загрязнения пипеткой пистолет и окрестностях. Асептические области или капот должны использоваться при обработке с бактериями и ФАГ экспериментов. Фаговые эксперимент области должен быть очищен с помощью 2% лаурилсульфат натрия (SDS) следуют на 70% спирте во избежание загрязнения ФАГ. Для изготовления серийных разведений в настоящем Протоколе, должны использоваться новые советы для каждого разведения.

1. Подготовка электро компетентных клеток кишечной палочки SS320

  1. Предварительно теплой LB/tet агар плита (подготовлены и хранятся на 4 ° C для менее чем 1 - неделя старый) при 37 ° C инкубатор для 1 ч. использовать стерильные прививка цикла или стерильной наконечник, чтобы полоска из глицерина запас E. coli SS320 клеток на подогретым LB/tet агар пластину в Зиг заг direc Тион нежно вдоль поверхности пластины. Инкубируйте пластину на инкубатора 37 ° C ночь для около 12-15 h.
  2. Следующий день, используйте стерильные прививка петлёй или стерильной подсказка выбрать хорошо разделенных одной колонии вдоль линии Зиг заг и инокуляции в 10 мл 2YT/tet среды в 50-мл круглым дном трубки окунать цикла в средних и помешивая кратко.
  3. Инкубируйте при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm для около 3-4 ч до од600 на около 0,4-0,8 (фаза роста журнала). Монитор ОД600 в 2 ч. В этот период, предварительно теплой 5 фунтов/tet агар плит (подготовлены и хранятся на 4 ° C на менее чем 1 - неделя старый) в 37 ° C инкубатор для по крайней мере 1 час.
  4. Добавить 20 мкл M13KO7 вспомогательный Фаговые из лаборатории запасов с титр около 1 x 1013 колонии, формировать группы (cfu) / мл в 180 мкл стерильных 1 X PBS в газобетона 1.5 мл пробирок подготовить 10 десятикратный серийных разведений.
  5. Аликвота 4 мл газобетона и жидких 2YT Топ агар в 5 X 14 мл раунд нижней трубы, маркировать каждую пробирку с одной разбавления от пятого до девятого десятикратный разбавления, соответственно и инкубировать в инкубаторе 65 ° C для поддержания 2YT Топ агар в жидком состоянии.
  6. Смесь 500 мкл журнала фазы E. coli SS320 клеток в M13KO7 трубу разрежения (выбрать пятый десятикратный разбавления до девятого десятикратный разрежения) и инкубировать в инкубаторе 37 ° C за 5-10 мин.
  7. Во время инкубации шаг 1.6 передачи 2YT Топ агар с шагом 1,5 до комнатной температуры (RT), чтобы охладить на около 5 мин до 42 ° C. Использовать внутреннюю запястье для проверки температуры 2YT Топ агар; Она должна оставаться в жидком состоянии. Передачи каждой разбавления смеси с шагом 1,5 для каждого соответствующего 2YT Топ агар трубки. Завинтите крышку пробирки и перемешать, повернув вниз несколько раз осторожно и кратко избежать пузырь поколения.
  8. Осторожно налить каждой смеси вдоль края предварительно теплой плиты агара LB/tet (от шага 1.3) и наклонной пластины слегка, чтобы полностью и равномерно Залейте смесь пластину избегая введения пузыри. Держите пластины на RT около 5-10 мин, чтобы затвердеть Топ агар в пределах каждой пластины и инкубировать 2YT Топ агар пластины при 37 ° C ночь для около 15-18 h.
  9. Выбрать пластину разбавления после ночи роста от шага 1.8 с около 100-200 среднего размера, один, хорошо разделенных таблички для прививки доска. Использование одной стороны провести пластину агар против источника света и с другой стороны держать пипетку пистолет загружен с наконечником долго стерильной пипеткой с вертикально ножом в топ агар и собирать один и хорошо разделенных зубного налета.
    1. Наклонной наконечник пипетки слегка отделить Топ агар с номерным знаком. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы выбить агар с налета в 14-мл круглым дном культуры трубу предварительно загружены с 1 мл среды 2YT/Кан/tet (см. таблицу 1).
    2. Повторите эту процедуру, чтобы выбрать 3-5 бляшек в общей сложности. Цель выбора несколько бляшек — для обеспечения успешной прививки, как доска может быть слабый и относительно небольшой по сравнению с колонии бактерий. Растут бляшки за 8 ч при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин.
  10. Перенесите трубку выращивания культуры в 50 мл 2YT/Кан/tet среды в недоумение флакон 250 мл. Растут при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm на ночь для около 12 ч.
  11. Прививать три 2-L озадачен флаконы содержащие 900 мл superbroth/tet/Кан среды с 5 мл на ночь культуры. Инкубируйте при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm для 6-7 ч до600 ОД около 0,6-0,8.
  12. Холод три колбы бактериальной культуры в ледяной бане на 5 мин с нежным постоянно крутятся вручную. Следующие шаги должны быть сделано в холодной комнате, на льду, с prechilled решения и оборудование.
  13. Использование оптической плотности ткани полотенце для просушки внешнее стекло каждого колбу; одной рукой наклонной газобетона центрифуге 1-Л бутылку на скамейке и с другой стороны залить средство мягко от каждого колбу в каждой бутылке центрифуги.
  14. Спина на 5000 × g и 4 ° C на 10 минут, чтобы Пелле бактерии.
  15. После центрифугирования осторожно декантируют супернатант в стакан газобетона отходов 5-L.
  16. Заполните каждый флакон со 100 мл стерильной фильтрации 1,0 мм HEPES, рН 7,4 и добавить панель газобетона магнитные переполох в каждой бутылке для помощи в Пелле ресуспендирования в 200 об/мин. Вихрем и выбить всю гранулы от стены бутылку каждые несколько минут во время магнитная перемешивании. После того, как гранулы растворяется, заполните каждую бутылку с еще 400 мл стерильной фильтрации 1,0 мм HEPES, рН 7,4.
  17. Центрифуга на 5000 × g и 4 ° C на 10 мин Decant супернатанта, сохраняя перемешать бар в бутылке.
  18. Повторите шаги 1.16 в 1.17 один раз.
  19. Ресуспензируйте каждой гранулы в 500 мл с помощью панели перемешать стерильной фильтрации, 10% сверхчистого глицерина. Вихрем и выбить всю гранулы от стены бутылку каждые несколько минут во время магнитная перемешивании.
  20. Центрифуга и сцеживаться как шаг 1.17. Повторите шаг 1.19 один раз. Для удаления панели перемешать используйте длинные руки газобетона щипцы.
  21. Центрифуга на 5000 × g и 4 ° C на 15 мин Decant супернатант и удалите все оставшиеся следы супернатант с каждой бутылки центрифуги с пипеткой.
  22. Добавление одной бутылки 3,0 мл 10% сверхчистого глицерина и нежно ресуспензируйте гранулы, закупорить. Передать следующей бутылке подвеска и повторять до тех пор, пока все гранулы высокомобильна и объединены в одном флаконе. Примерно в 6 мл высококонцентрированных клеток, полученные с титр около 3 x 1011 кое/мл.
  23. Предварительно охладите газобетона microcentrifuge 1,5 мл трубки и ящик для хранения одной 96-луночных трубы без разделителей в-80 ° C для по крайней мере 1 час перед этот шаг. Переведите предварительно охлажденные microcentrifuge трубы холодной комнате на льду до закупорить аликвоты гранул суспензии клеток. Использование пипетки для аликвота 350 мкл суспензии клеток в каждую пробирку microcentrifuge 1,5 мл.
  24. Перенесите аликвоты в контейнер box пены заполнены с жидким азотом для flash замораживания (3-5 мин).
    1. Транспорт в коробе с жидким азотом в морозильной камере-80 ° C (см. шаг 1,23).
    2. Удалить поле хранения пробки microcentrifuge 1,5 мл из морозильной камеры-80 ° C (см. шаг 1.23) и поставить на льду.
    3. Быстро используйте металлические сетки сита аликвоты из жидкого азота и поместить их в поле хранилище трубки. Хранить при температуре-80 ° C.
      Предупреждение: Жидкий азот может вызвать ожоги, и необходимо позаботиться для защиты безопасности. Используйте phagemid Fab позвоночника для проверки эффективности подготовленных электро компетентных клеток (Fab позвоночника phagemid запас должен быть в ультрачистая вода (MilliQ) на 400 нг/мкл). Размораживание 1 мкг phagemid Fab позвоночника в 10 мкл ультрачистая вода и 350 мкл Алиготе электро компетентных SS320 на льду и prechill кювет электропорации 0,2 cm разрыв на льду.
  25. Добавить электро компетентных клеток SS320 350 мкл 10 мкл ДНК после оттаивания и перемешать, закупорить несколько раз при сохранении смеси на льду. Избегайте введения пузыри.
  26. Предварительно теплой 15 мл SOC среды в 50-мл пробирку в ванну воды 37 ° C для по крайней мере 30 минут до электропорации. Передача смеси 360 мкл кювет и выполнять электропорации следуя инструкциям производителя.
  27. Сразу же спасти клетки после электропорация, добавив 1 мл подогретым SOC средних (от шаг 1.27) и закупорить. Передавать средства из кювета 125 мл флакон предварительно загружены с 5 мл подогретым соц.
  28. Промойте кювет дважды, каждый раз с 1 мл раствора подогретым SOC среднего и передать 125 мл флакон среднего (см. шаг 1.27). Добавьте подогретым SOC среднего окончательный объем до 125 мл флакон 10 мл.
  29. Инкубируйте 10-мл клеточной культуры для 30 минут при 37 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
  30. Сделайте серийных разведений определить эффективность трансфекции и M13KO7 до инфекции.
    1. Используйте многоканальные пипетки для добавления 180 мкл 2YT СМИ в каждой скважине одного столбца 96-микрорезервуар плиты.
    2. Сделать 8 десятикратно серийный разведения: передача 20 мкл культуры из шага 1.29 к первой скважины пластины, микс, закупорить и передать следующий 20 мкл смеси хорошо. Повторите этот шаг до конца последовательным разрежения.
    3. Пластина 10 мкл каждого последовательного разрежения на LB/карбюратора, LB/Кан и LB/tet пластины в двух экземплярах.
    4. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    5. Формула расчета эффективности: предполагается, что M — средняя колонии номер отсчитывается от разбавленных раза 10N (N — от 1-8). E. coli SS320 электро компетентных клеток эффективность трансфекции phagemid Fab позвоночника от LB/карбюратора пластины равноN + 3 М X 10 кое/мкг. M13KO7 предварительно инфекции оценивается от соотношения колоний в LB/Кан и LB/tet. Процент клеток E. coli SS320 компетентным transfected с phagemid Fab позвоночника оценивается от соотношения колоний в LB/карбюратора и LB/Кан.

2. Подготовка урацил содержащих ssDNA (дю ssDNA) из шаблона Phagemid

Примечание: A ранее сообщалось, что ВСБ позвоночника phagemid был использован как шаблон для dU-ssDNA подготовка15. Архитектура phagemid Fab позвоночника показана на рисунке 2. Набор спин плазмида (QIAprep спина M13) используется для извлечения dU-ssDNA с незначительными изменениями.

  1. Предварительно теплой LB/cmp пластины (подготовлены и хранятся на 4 ° C на менее чем 1 - неделя старый) в инкубаторе 37 ° C за 1 ч. полоска из глицерина запас E. coli CJ236 клеток (или другой штамм dut−/ung−) с стерильных петли или советы на подогретым плиту LB/cmp. Инкубируйте пластины при 37 ° C ночь для около 12-15 h.
  2. Выберите единую колонию с стерильных наконечником и инокуляции в 2 мл 2YT/cmp среды в 14-мл полипропиленовые раунд снизу трубку.
  3. Инкубируйте в среду при 37 ° C с встряхивания на 200 rpm для 3-4 ч до од600 на около 0,4-0,8 (фаза роста журнала).
  4. Добавить 5-10 мкл Фаговые Fab позвоночника шаблона в культуру и инкубировать при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин за 30 минут, чтобы позволить Фаговые инфекции.
  5. После инкубации используйте стерильные оконечности полоска из 10 мкл культуры на подогретым плиту LB/карбюратора при 37 ° C. Инкубируйте при 37 ° C ночь для около 12-15 h.
  6. Выберите единую колонию E. coli CJ236 phagemid содержащий Fab позвоночника для прививок закваски по 3 мл 2YT/карбюратора/cmp в 14-мл полипропиленовые раунд снизу трубку и расти при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm на ночь для около 12 ч.
  7. Прививать 0,3 мл закваски в 30 мл 2YT/карбюратора/cmp в недоумение бутылка 250 мл.
  8. Инкубируйте культуре клетки при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm для 3-4 ч до од600 на около 0,4-0,8 (фаза роста журнала).
  9. Добавить M13KO7 (Лаборатория штока, титр приблизительно 1 x 1013 кое/мл) в культуру от шаг 2.8 с разносторонностью инфекции (МВД) примерно 10 и окончательный титр M13KO7 является 1 x 1010 кое/мл.
  10. Инкубируйте на 200 об/мин, 37 ° C в течение 1 ч.
  11. Пелле культуры центрифугированием в 50 мл раунд снизу, на 5000 × g и 25 ° C в течение 20 мин.
  12. Декант супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 30 мл свежего 2YT/карбюратора/Кан/уридина. Перенесите ресуспендирования в новой озадачен бутылка 250 мл.
  13. Инкубируйте на 200 об/мин и 25 ° C для 22-24 ч.
  14. Передача культуры из шага 2.13 в 50-мл раунд снизу трубку и центрифуги культуры на 12000 g × 20 мин отделить Фаговые супернатанта от бактериальных клеток Пелле. Передача Фаговые супернатант в новый раунд снизу трубку 50 мл и добавить 1/5 окончательный объем раствора ПЭГ/NaCl ускорять ФАГ. Хорошо перемешайте и инкубировать на льду для 30 минут, чтобы осадить Фаговые частицы.
  15. Оставшиеся супернатант аспирационная центрифуги на 12 000 × g и 4 ° C на 30 мин Decant супернатант и центрифуги на 4000 × g и 4 ° C на 2 мин.
  16. Ресуспензируйте Фаговые Пелле в 2 мл стерильной фильтрации 1 X PBS и передачи microcentrifuge 1,5 мл трубки. Центрифуга на 12000 g × 5 мин в benchtop microcentrifuge удалить любые оставшиеся бактериальных мусора и передать новые трубы 1,5 мл microcentrifuge супернатанта ФАГ и хранить при 4 ° C.
  17. Проверка эффективности включения урацила в E. coli CJ236 через бок о бок сравнение с E. coli SS320.
    1. Добавьте 180 мкл 2YT СМИ в каждой скважине одной строки 96-луночных плиты.
    2. Сделать десять 10 серийный разведения: передачи 20 мкл Фаговые супернатанта первой скважины пластины, смешивать, закупорить и передать следующий 20 мкл смеси хорошо. Повторите этот шаг до конца последовательным разрежения.
    3. Добавить 10 мкл Фаговые из восьми последних серийных разведений заразить 90 мкл CJ236 E. coli и E. coli SS320 в фазе журнала (OD600 = 0,4-0,8). Инкубируйте при 37 ° C за 30 минут с нежным встряхивания.
    4. Пластина 10 мкл от последовательного растворения каждой инфекции E. coli CJ236 и SS320 E. coli на тарелках 2YT Carb в двух экземплярах.
    5. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    6. Формула расчета титр: предполагается, что M — средняя колонии номер отсчитывается от разбавленных раза 10N (N — от 1-10). Титр кишечной палочки CJ236 или E. coli SS320 равноN + 2 M X 10 кое/мл. Оцените эффективность урацила инкорпорации от соотношения титр кишечной палочки CJ236 и SS320 E. coli .
  18. Добавить 1/100 объем буфера осадков Фаговые MP в Фаговые супернатант в 1,5 мл microcentrifuge трубы и поверните вниз осторожно смешать несколько раз. Инкубируйте на RT для по крайней мере 2 мин Фаговые частицы осаждаются из питательной среды, и таким образом, облачно раствор должен быть видимым в данный момент.
  19. Применить образец из шага 2.18 плазмида спин столбцу (например, QIAprep) в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Связывающая способность столбца один спин на ssDNA может достигать по крайней мере 10 мкг. Центрифуга на 6000 × g и 25 ° C за 30 s в benchtop microcentrifuge. Выбросите проточный, который находится в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Фаговые частицы остаются связанными к матрице столбца на данном этапе.
  20. Добавьте в столбец 0,7 мл UT-MLB Фаговые лизис и привязки буфера (см. обсуждение) и Инкубируйте на RT для по крайней мере 1 мин.  Центрифуга на 6000 x g и 25 ° C для 30 s и отмены потока через.
  21. Добавить еще один 0,7 мл буфера UT-MLB и Инкубируйте на RT для по крайней мере 1 мин.
  22. Центрифуга на 6000 × g для 30 s. отклонения потока через. На данном этапе протеин пальто Фаговые отделяется от dU-ssDNA, которой остается привязанным к матрице столбца.
  23. Добавление 0,7 мл мыть содержащие этанола буфера PE следуя инструкциям производителя. Центрифуга на 6000 g × 30 s и отмены потока через.
  24. Повторите шаг 2.23, затем еще раз центрифуги на 6000 g × 30 s, чтобы удалить остаточные буфера PE.
  25. Передать новой трубки 1,5 мл microcentrifuge столбца и добавьте 100 мкл буфера EB (10 мм Tris· CL, рН 8,5) к центру колонки мембраны.
  26. Инкубируйте на RT 10 мин и центрифуги на 6000 × г за 1 мин до элюировать dU-ssDNA. Приблизительно 1,5-2,5 мкг/мл dU ssDNA культуры могут быть получены.
  27. Анализировать eluted дна electrophoresing 1 мкл на агарозы 1%, TAE гель. ДНК должен появиться как преимущественно однодиапазонный с не мазать.
  28. Определение концентрации ДНК путем измерения оптической плотности на nanodrop спектрофотометром в 260 Нм (260 = 1.0 для 33 нг/мкл ssDNA). Типичные dU-ssDNA концентрации находятся в пределах 200-500 нг/мкл.

3. Канкел метод на основе олигонуклеотида Направленный мутагенез

Примечания: Это целесообразно проводить мелкомасштабные реакций до полной шкалы реакций для обеспечения качества мутагенных олигонуклеотида и реакции компонентов. Мультфильм Канкел метода на основе олигонуклеотида направлены мутагенеза показано на рисунке 3. В CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL3 регионов вводятся различные аминокислоты разнообразности с IMGT нумерация номенклатуры16 (Таблица 2). Теоретические аминокислоты разнообразие каждой CDR, Общая теоретическая аминокислоты разнообразия и последовательности олигонуклеотида, перечислены в таблице 2.

  1. Фосфорилирование олигонуклеотида с T4 полинуклеотид киназы
    1. Объединить 0,6 мкг мутагенных олигонуклеотиды, призванных мутировать одного CDR, с 2 мкл 10 X буфер ТМ, 2 мкл 10 мм АТФ и 1 мкл 100 мм DTT. Добавьте сверхчистого H2O общего объема 18 мкл в 1,5 мл. Для строительства библиотеки 4 фосфорилирование отдельных и параллельных реакций настроены соответствующий CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL3, соответственно.
    2. Добавить 20 U (2 uL) T4 полинуклеотид киназы каждой трубки и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C (реакция 1 в таблице 3). Использование немедленно для отжига.
  2. Отжиг олигонуклеотиды в шаблон
    1. До 20 мкг dU-ssDNA шаблона добавьте 25 мкл 10 X ТМ буфера, 20 мкл каждого решения фосфорилированных олигонуклеотида, и особочистых H2O конечный объем 250 мкл в 0,5 мл. Хорошо перемешайте и перевести на 0.20 мл ПЦР пробирок (по 50 мкл) в реакции 2 в таблице 3. Эти количества ДНК обеспечивают молярное соотношение 3:1 между олигонуклеотида и шаблон, предполагая, что длина олигонуклеотида и шаблон составляет 1: 100.
    2. Инкубировать реакции в машину ПЦР на 90 ° C на 3 мин, 50 ° C на 3 мин и 20 ° C за 5 мин.
  3. Ферментативного синтеза CCC-dsDNA
    1. В 250 мкл отожженная олигонуклеотида/шаблон смесь добавьте 10 мкл 10 мм АТФ, 10 мкл dNTP смеси 25 мм, 15 мкл, 100 мм DTT, 30 Вайсс T4 единиц ДНК лигаза и 30 U Т7 ДНК-полимеразы как реакция 3 в таблице 3.
    2. Инкубируйте реакции в 1,5 мл при 20 ° C на ночь.
    3. Вымойте и сконцентрировать синтезированных CCC-dsDNA в 0,5 мл центробежного фильтра устройства с мембраной размер поры 30 кДа на RT.
      1. Передать ночи реакционную смесь на устройство фильтра и добавьте сверхчистого H2O 400 мкл окончательный объем. Спина на 14 000 × g 10 мин; объем составляет менее 50 мкл.
      2. Отменить через поток, 400 мкл сверхчистого H2O в фильтр и спина на 14 000 × g за 10 мин.
      3. Повторите шаг 3.3.3.2 еще раз.
      4. Переверните фильтр в чистой microcentrifuge трубки для восстановления CCC-dsDNA. Спина на 1000 g × 2 мин; восстановленный том обычно составляет около 20-40 мкл. Восстановленные CCC-dsDNA могут быть использованы непосредственно для электропорации кишечной палочки или заморожены при-20 ° C для последующего использования. Обычно 20-40 мкг CCC-ДНК могут быть получены.
    4. Electrophorese 1.0 мкл eluted реакция продукта наряду с дю ssDNA шаблон для визуализации результатов реакции.

4. электропорации и расчет размера библиотеки

  1. Холод очищенный CCC-dsDNA (20 мкг в максимальный объем 50 мкл) в пробки microcentrifuge 1,5 мл и разрыв 0,2 см кювета электропорации на льду.
  2. Предварительно теплой 20 мл SOC СМИ в 50-мл полипропиленовые конические пластиковых пробирок на водяной бане 37 ° C по меньшей мере 30 мин.
  3. Оттепель 350 мкл Алиготе электро сведущее Escherichia coli SS320 на льду. Добавьте клетки ДНК и перемешать тщательно, закупорить несколько раз. Избегайте введения пузыри.
  4. Передача смеси кювет и выполнять электропорации следуя инструкциям производителя. Например когда используется система электропорации BTX ECM-630, соответствующие параметры являются прочность поля 2.5 кв, 125 Ω сопротивления и 50 МКФ емкости.
  5. Сразу же спасти electroporated клетки, добавив 1 мл подогретым SOC средних и передачи в 17 мл SOC среды в 125 мл флакон. Промойте кювет дважды с 1 мл SOC средних и передачи же колбу (окончательный объем составляет 20 мл).
  6. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
  7. Определите эффективность электропорации.
    1. Добавьте 180 мкл 2YT СМИ в каждой скважине одного столбца 96-микрорезервуар плиты.
    2. Сделать 8 десять раз серийный разведения: передачи 20 мкл 20 мл культуры первой скважины пластины, смешать с закупорить и передать следующий 20 мкл смеси хорошо. Повторите этот шаг до конца последовательным разрежения.
    3. Пластина 10 мкл каждого из серийных разведений на одну плиту LB/карбюратора в двух экземплярах. Пластина 100 мкл, оставшиеся от каждого из серийных разведений на отдельных пластин LB/карбюратора для колонии Фото кросс проверить. Эти пластины также предоставит единый клонов для анализа ELISA и последовательности (см. раздел 5).
    4. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    5. Подсчет колоний от 10 мкл дубликатов на пластину LB/карбюратора. Предположим, что M является средняя колонии, число подсчитанных на 10N раз LB/карбюратора пластины (N-1-8). Общая библиотека размер равен 2 М X 10N + 3 колоний.
  8. Алиготе культуры от шага 4.6 одинаково в два 2-L озадачен колбы, каждый содержащий 500 мл 2YT/карбюратора/Кан среды для поколения библиотека ФАГ.
  9. Инкубируйте при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm на ночь для около 16 h.
  10. Передача культуры двух бутылки 1-L газобетона центрифуги и центрифуги для 30 мин при 12000 х g при 4 ° C.
  11. Супернатант передать два новых газобетона центрифуге 1-Л бутылок и добавить 1/5 окончательный объем раствора ПЭГ/NaCl ускорять ФАГ. Инкубируйте на льду за 30 мин.
  12. Центрифуги для 30 мин при 12000 х g и 4 ° C. Тщательно сцеживаться супернатант и не мешать Пелле ФАГ. Спиновые 1 мин на 4000 x g и удалить оставшиеся супернатант с пипеткой.
  13. Ресуспензируйте Фаговые лепешка с 20 мл стерильной фильтрации 1 ПБС буфере и передачу новой 50 мл трубки.
  14. Пелле нерастворимый центрифугированием 5 мин на 12 000 × g и 4 ° C. Супернатант передать новый 50-мл.
  15. Измерить концентрацию Фаговые спектрофотометр (OD268 = 1.0 для решения 5 X 1012 Фаговые/мл).
  16. Отрегулируйте Фаговые концентрации до 5 X 1012 Фаговые/мл в 1 X PBS с 10% сверхчистого глицерина.
  17. Аликвота 1 мл раствора ФАГ в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Используйте библиотеки немедленно для сдвига или хранить при температуре-80 ° C.

5. качество оценки белок А / Л прямой привязки ELISA пробирного и последовательности

  1. Случайным образом выберите 96 одного колоний на табличке LB/карбюратор от шага 4.7.3 в 96-глубокие хорошо культуры пластины, содержащий 800 мкл 2YT carb в каждой скважине. Инкубируйте 3-4 ч при 37 ° C с тряску при 1000 об/мин до од600 = 0,4-0,8.
  2. Добавить 100 мкл M13KO7 (1 Х 1011 кое/мл) для каждой скважины 96-глубокой хорошо культуры пластины с многоканальные пипетки. Проинкубируйте при 37 ° C с тряску при 1000 об/мин на 1 ч.
  3. Добавьте 100 мкл 2YT содержащие 10 X концентрации канамицин (500 мкг/мл) для каждой скважины с многоканальные пипетки. Инкубируйте на ночь при 37 ° C с тряску при 1000 об/мин.
  4. Растворите белка L 1 мкг/мл в 1 X PBS. Слой 3/4 скважин в 384-Ну высокий связывания белков полистирольные пластины с 30 мкл/хорошо белка Л раствора. Инкубируйте на ночь при 4 ° C.
  5. Отказаться от ночи раствор для нанесения покрытия белка L от шага 5.4. Добавьте 50 мкл M-PBST (блокирующие решение) для всех скважин в 384-Ну высокий связывания белков полистирольные пластины с многоканальные пипетки. Инкубировать пластины на Гонав шейкер для 1 h на RT.
  6. Спин вниз ночь культуры от шага 5.3 в пластине глубоко 96-луночных культуры на 3000 x g 10 мин при 4 ° C. Фаговые находится в надосадке.
  7. Отмена блокировки решение от шага 5.5. Добавьте 15 мкл M-PBST и 15 мкл каждого Фаговые супернатанта (шаг 5.6) 3 L покрытием скважин белка в трех экземплярах и 1-покрытием хорошо как отрицательный контроль с помощью многоканальных дозаторов. Инкубируйте на RT 1 h встряхивании в 200 об/мин.
  8. Отменить решение ФАГ. Промойте пластины 6 раз с 80 мкл PBST шайбой автоматизированной пластины.
  9. Добавьте 15 мкл M-PBST и 15 мкл белок А-ПХ (1:1, 500 разводят в 1 X PBS) для каждой скважины с многоканальные пипетки и Инкубируйте на RT 1 h встряхивании в приблизительно 200 об/мин.
  10. Слейте раствор белка A-ПХ/M-PBST. Вымойте тарелка 6 раз с 80 мкл PBST.
  11. Добавление подложки (30 мкл/хорошо) ТМБ с многоканальные пипетки и проинкубируйте 2-3 мин до тех пор, пока цвет развивается. Остановите реакции с 1,0 М H3PO4 (30 мкл/хорошо).
  12. Читайте пластины спектрофотометрически на 450 Нм. Позитивные клоны определяются как те, которые демонстрируют среднее соотношение ОД450 поглощения белков L скважин также больше, чем 3.0 М-PBST.
  13. В 96-глубокий, заразить 50 мкл SS320 в 2YT/tet на этапе журнала с 5 мкл же фага, используемых для ELISA (шаг 5.6) за 30 мин на RT.
  14. Добавьте 950 мкл 2YT carb в 96-глубокие хорошо из шага 5.13 и инкубировать на ночь при 37 ° C с тряску при 1000 об/мин.
  15. Экстракт phagemid ДНК мини-prep набор экстракции ДНК. Используйте вверх по течению грунтовки ВЛ (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') и VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') для анализа последовательностей для оценки разнообразия последовательности библиотеки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После схема строительство Fab библиотеки (см. рис. 1), мы подготовили помощник M13KO7 ФАГ предварительно зараженных кишечной палочки SS320 электро компетентных клеток. Эффективность этих электро компетентных клеток оценивается как 2 Х 109 cfu/мкг, когда использовался ВСБ phagemid основой для строительства библиотеки (рис. 4).

Была проведена проверка эффективности включения урацила сравнения титра антител в клетках E. coli CJ236 и SS320 E. coli . E. coli CJ236 и E. coli SS320 клетки были инфицированы фага, укрывательство dU-ssDNA. E. coli SS320 имеет ферментов (dUTPase и урацилом glycosylase), которые могут ухудшить урацил содержащих ДНК, в то время как E. coli CJ236 не хватает этих ферментов и не может ухудшить урацил содержащих ДНК. Для достижения эффективности включения приемлемого урацил, титры с E. coli CJ236 нужно быть по меньшей мере 104 раза выше, чем от кишечной палочки SS320. В противном случае одичал типа населения будет увеличиваться в построенных антитела библиотеки из-за неэффективного урацила инкорпорации. Рисунок 5 показали, что титр от кишечной палочки CJ236 примерно 3 X 105 раз выше, чем от кишечной палочки SS320, указанием эффективной урацила включения ssDNA ФАГ.

Далее мы подготовили и извлечено dU-ssDNA. DU-ssDNA чистоты проверяется электрофорезом геля агарозы (рис. 6). Затем было проведено олигонуклеотида направленного мутагенеза и оценивалась эффективность преобразования dU-ssDNA CCC-ДНК (рис. 6). Три продукта с нижней моторики чем dU-ssDNA могут быть визуализированы на геле, включая быстрый запуск группы (CCC-dsDNA), средняя полоса слабых (одноцепочечным группа) и медленный бег band (перемещенных нити ДНК).

После электропорации в E. coli SS320, размер библиотеки оценивалась от ночи инкубации плиты (см. шаг 4.7.5). Размер Средняя библиотеки был 5 Х 109 из повторяющихся серийных разведений на LB/карбюратора пластины (рис. 7). Однако предполагаемый размер на этот шаг может содержать фага, не показывать Fabs вследствие наличия фреймшифт или остановить кодон или отображать смятых Fabs. Последовательности и ELISA были использованы для оценки функционального разнообразия построенных библиотеки. 96 случайно взял один клоны были отправлены для анализа последовательности. Таблица 4 показывает, что 90 из 96 случайно взял один клоны были успешно виртуализации, которая содержит 70 клоны без преждевременной остановки кодоном (53 клоны с по крайней мере один мутант CDR) и 17 клоны с одичал тип последовательности и 20 клоны с кодон преждевременной остановки в различных регионах. В пределах 70 клонов мутант ставки CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL3 составляет 50%, 57%, 53% и 56%, соответственно, в то время как мутант с по крайней мере одного CDR составляет 76%. В 20 клонов с преждевременной остановки кодоном (90%) преждевременной стоп-кодон главным образом была получена из фреймшифт праймеров олигонуклеотида мутагенеза, включая 45% (CDRH1), 10% (CDRH2), 15% (CDRH3) и 20% (CDRL3).

Для определения отображения правильно сложенные Fabs, белок A / L на основе ELISA работал, как известно, что белок и белка L может признать надлежащего сворачивания VH и VL рамки, соответственно17,18. По согласованию с последовательности анализа анализа ELISA в трех экземплярах (рис. 8) показал, что 20 клоны с кодоном преждевременной остановки все негативные в то время как 17 клоны с одичал тип последовательности были все позитивные, когда положительное соотношение было эмпирически установите на 3.0. Для 53 клонов с по крайней мере один мутант CDR 43 клоны были положительными в ИФА в то время как 10 клоны были отрицательными; Это означает, что большинство клонов были хорошо сложены в то время как CDR от 10 клонов может иметь пагубные последствия для Fab складывания. В общей сложности 43 клоны из 90 клоны (48%) были хорошо сложенный и содержит по крайней мере один мутант CDR. Таким образом, разнообразие функциональных аминокислоты сконструированный библиотеки основе белка A / L ELISA и последовательности анализа составляла 2,4 X 109 (т.е., 48% 5 X 10-9).

Figure 1
Рисунок 1: Обзор строительства ФАГ отображается библиотека Fab. ФАГ отображается библиотека Fab строительство следует ряд основных шагов. Она включает в себя подготовку высокой эффективности электро компетентных клеток бактерий, извлечение dU-ssDNA, Канкел в метод основан олигонуклеотида направленного мутагенеза, электропорация и расчет Фаговые Fab библиотека размер, функциональной оценки белок А / Л ELISA и ДНК анализа последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Phagemid архитектуры на строительство Fab библиотека. Основные черты phagemid позвоночника состоят из происхождения одноцепочечной (f1 ori) и (dsDNA ori) double-stranded дна, репликации и сопротивление гена ампициллин/carbenicillin (AmpR). Для потрясающий дисплей, под контролем промотора щелочной фосфатазы (PhoA), phagemid содержит bicistronic Кассетный диск выражение и секрецию: легкие цепи (LC), состоящий из секреции сигнала, вл (переменная региона лёгкие цепи), CL (константа регионе лёгкие цепи) и C-терминала флаг тег; и тяжелые цепи (HC), состоящий из секреции сигнала, VH (переменная региона тяжелые цепи) и CH1 (постоянный регион 1 тяжелой цепи) сливается с протеином незначительные пальто Фаговые p3. Ассамблея лёгкие цепи и тяжёлые цепи в Fab в E. coli periplasm направляет отображения Fab на поверхности ФАГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: схема Канкел метода на основе олигонуклеотида Направленный мутагенез. В этом протоколе мы использовали метод Канкел подготовить dU-ssDNA шаблон. Олигонуклеотиды для CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL3 с дизайном разнообразия фосфорилированных, с отжигом в шаблон и используется для преобразования ss ДНК в КХЦ dsDNA. После электропорации в E. coli SS320 электро компетентных клеток гетеродуплексного ДНК отремонтированы дикого типа или мутантные формы; Благодаря наличию урацила в стренги дикого типа процесс восстановления способствует мутантные формы, и таким образом, мутантные формы доминирует библиотеки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Оценка M13KO7 предварительно инфицированных эффективности электро компетентных клеток кишечной палочки SS320. Phagemid позвоночника вектор использовался для проверки эффективности электропорации компетентных клеток. Формула для расчета эффективности является следующим: предполагается, что M — средняя колонии номер отсчитывается от наиболее разреженных раза 10N (N — от 1-8) в двух экземплярах. E. coli SS320 эффективность от LB/карбюратора пластины равноN + 3 М X 10 кое/мкг. Эффективность работы электро компетентных клеток является примерно 2 Х 109 cfu / мкг. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Оценка включения урацила в ssDNA Фаговые инфекции E. coli CJ236 и E. coli SS320 клеток. На основе метода Канкел в эффективности включения урацила проверяется сравнением Фаговые инфекции титр в клетках E. coli CJ236 и SS320 E. coli . Формула расчета титр выглядит следующим образом: Предположим, что М средняя колонии номер отсчитывается от наиболее разреженных раза 10N (N — от 1-10), и что титр кишечной палочки CJ236 или E. coli SS320 равенN + 2 M X 10 кое/мл. Эффективность урацила включение может быть оценена из соотношения титр кишечной палочки CJ236 и E. coli SS320. Титр в E. coli CJ236 был12 9 X 10 кое/мл, а титр в E. coli SS320 был 3 X 107 кое/мл. Титр кишечной палочки CJ236 и E. coli SS320 составляло 3 X 105. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: преобразование dU-ssDNA CCC-ДНК, олигонуклеотида Направленный мутагенез. После олигонуклеотида направленного мутагенеза оценивалась эффективность преобразования dU-ssDNA CCC-ДНК. dU-ssDNA был полностью преобразован dsDNA. Доминирующей группы — СТС dsDNA пока есть небольшая часть одноцепочечным dsDNA и перемещенных нити ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: фага титрования для расчета размера библиотеки. После электропорации в E. coli SS320 размер библиотеки оценивалась от серийных разведений на тарелках LB/карбюратора. Формула расчета размера выглядит следующим образом: Предположим, M — средняя колонии номер отсчитывается от наиболее разреженных раза 10N от пластины 2YT Carb (N-1-8), размер равен 2 М X 10N + 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: белок А / Л прямой привязки Фаговые ELISA. Белка L может признать что рамки хорошо сложенный Каппа лёгкие цепи ВЛ и белка может признать рамки хорошо сложенный тяжелые цепи VH. Связывание Fab с белком L и A указывает надлежащего складные тяжелые цепи и лёгкие цепи. Вкратце белка L в трех экземплярах и отрицательный контроль М-PBST были покрыты к пластине, Fab Фаговые supernatants с различных клонов инкубировали с белком L и M-PBST, затем после стирки, белок, используемый A-HRP для захвата связанных Fab ФАГ. Фаговые ELISA чтений показали 90 случайно выбранный клоны с успешным последовательность индикации. Порог линия, изображающая клон как позитивные эмпирически был определен, где соотношение значения поглощения450 ОД от белка L (в среднем экземплярах с погрешностей) против отрицательного контроля было более чем 3.0. Были показаны три группы, на основе анализа последовательности, соответствующий мутант без остановки кодон в красном (53 клоны), дикого типа (WT) в голубой (17 клоны) и мутанта с остановки кодон в зеленом (20 клоны). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Реагент установки Компонент Сумма Комментарии/описание
Средний 2YT Экстракт дрожжей 10 g Добавить ультрачистая вода сделать громкость до 1,0 Л, Отрегулируйте пэ-аш до 7.0, автоклав.
Триптон 16 g
NaCl 5 g
2YT Топ агар Экстракт дрожжей 10 g Добавление ультрачистая вода составляют объем 1,0 Л и Отрегулируйте пэ-аш до 7.0, тепло распустить, автоклав.
Триптон 16 g
NaCl 5 g
Гранулированный агар 7.5 g
Средний 2YT/карбюратора/cmp Carbenicillin 100 мкг/мл
Хлорамфеникол 10 мкг/мл
2YT/карбюратора/Кан/уридина среднего Carbenicillin 100 мкг/мл
Канамицин 50 мкг/мл
Уридина 0,25 мкг/мл
Средний 2YT/карбюратора/tet Carbenicillin 100 мкг/мл
Тетрациклин 10 мкг/мл
Средний 2YT carb Carbenicilin 100 мкг/мл
Средний 2YT/Кан Канамицин 50 мкг/мл
Средний 2YT/Кан/tet Канамицин 50 мкг/мл
Тетрациклин 10 мкг/мл
Средний 2YT/tet Тетрациклин 10 мкг/мл
Средний 2YT/cmp Хлорамфеникол 10 мкг/мл
LB средних агар Экстракт дрожжей 5 g Добавить ультрачистая вода сделать громкость до 1,0 Л, Отрегулируйте пэ-аш до 7.0, автоклав. Для LB агар, добавить 20 г гранулированного агар, автоклав.
Триптон 10 g
NaCl 10 g
LB/карбюратора пластины Агар LB 1 Л
Carbenicillin 100 мкг/мл
LB/tet пластины Агар LB 1 Л
Тетрациклин 10 мкг/мл
LB/cmp пластины Хлорамфеникол 10 мкг/мл
LB/Кан пластины Канамицин 50 мкг/мл
SOC среднего Экстракт дрожжей 5 g Добавить сверхчистого воды составляют объем 1,0 Л и Отрегулируйте пэ-аш до 7.0, автоклав.
Триптон 20 g
NaCl 0.5 g
KCl 0,2 г
2,0 М MgCl2 5,0 мл
1.0 M глюкозы 20 мл
Superbroth средний Триптон 12 g Добавить ультрачистая вода для 900 мл, автоклав, добавить 100 мл газобетона 0,17 М х2PO4, 0,72 М K2HPO4.
Экстракт дрожжей 24 g
Глицерин 5 мл
Superbroth Кан/tet среднего Канамицин 50 мкг/мл
Тетрациклин 10 мкг/мл
ПБС NaCl 137 мм Отрегулируйте пэ-аш до 7.2, автоклав.
KCl 3 мм
Na2HPO4 8 мм
KH2PO4 1,5 мм
ТЭ/агарозном геле Буфер TAE
Агарозы 1% (w/v)
GelRed 1: 10000 (v/v)
ТМБ субстрат ТМБ 50% (v/v)
H2O2 пероксидазы субстрат 50% (v/v)
M-PBST буфера ПБС 100 мл
Tween-20 0,05% (v/v)
Молоко сухое обезжиренное 5% (v/v)
5 X PEG/NaCl ПЭГ-8000 20% (w/v) Добавление сверхчистого воды, чтобы сделать громкость 1 Л и автоклав.
NaCl 2,5 М
PBST буфера ПБС 1 Л 0,22 мкм фильтр стерилизовать.
Tween-20 0,05% (v/v)
10 x буфер ТМ 2 MgCl 0,1 М Отрегулируйте пэ-аш до 7,5.
Трис 0.5 М
1,0 мм HEPES, рН 7,4 1.0 M HEPES 4.0 мл 0,22 мкм фильтр стерилизовать.
Ультрачистая вода 4.0 L
сверхчистый глицерина 10% (v/v) Сверхчистый глицерина 100 мл 0,22 мкм фильтр стерилизовать.
Ультрачистая вода 900 мл
Ультрачистая вода H20 Dnase, Rnase бесплатно, пирогена бесплатно.

Таблица 1: Реагент установки.

Table 2
Таблица 2: CDR разнообразности и мутагенез грунты. Последовательности ДНК CDR регионов быть мутировал показаны красным цветом; последовательности форматируются с использованием кода нуклеотидов ИЮПАК. «X» указывает tri нуклеотида из смеси, предназначенные для размещения множества различных аминокислот; «n» означает, что различное количество X. пять грунты с различным числом X были использованы для диверсификации CDRL3 или CDRH3, соответственно, для создания переменной длины CDRL3 и CDRH3. Остатки чисел определяются IMGT номенклатуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Кункель методом мутагенеза
Реакция 1. Фосфорилирование олигонуклеотида с T4 полинуклеотид киназы
Компонент Сумма Окончательное
Мутагенный олигонуклеотиды 0,6 мкг
10 x буфер ТМ 2 МКЛ 1 X
10 мм СПС 2 МКЛ 1 мм
100 мм DTT 1 МКЛ 5 мм
T4 полинуклеотид киназы (10 U/мкл) 2 МКЛ 20 U
Сверхчистый H20 До 20 мкл
Настройка реакции
Шаг 1. 37 ° С в течение 1 ч
Реакция 2. Отжиг олигонуклеотиды в шаблон
Компонент Сумма Окончательное
dU-ssDNA шаблон 20 мкг 20 мкг
10 x буфер ТМ 25 МКЛ 1 X
Фосфорилированный CDRH1 олигонуклеотиды 20 МКЛ 0,6 мкг
Фосфорилированный CDRH2 олигонуклеотиды 20 МКЛ 0,6 мкг
Фосфорилированный CDRH3 олигонуклеотиды 20 МКЛ 0,6 мкг
Фосфорилированный CDRL3 олигонуклеотиды 20 МКЛ 0,6 мкг
Сверхчистый H20 До 250 мкл
Настройка реакции
Шаг 1. 90 ° C на 3 мин
Шаг 2. 50 ° C за 5 мин
Шаг 3. 20 ° C за 5 мин
Реакция 3. Ферментативного синтеза CCC-dsDNA
Компонент Сумма Окончательное
отожженная олигонуклеотиды/шаблон смеси 250 МКЛ
10 мм СПС 10 МКЛ Каждый нуклеотид 346 мкм
dNTP смесь (25 мм каждый нуклеотид) 10 МКЛ Каждый нуклеотид 865 мкм
100 мм DTT 15 МКЛ 5 мм
T4 ДНК лигаза 1 МКЛ 30 единиц Вайс
Т7 ДНК-полимераза 3 МКЛ 30 U
Настройка реакции
Шаг 1. 20 ° C для ночлега

Таблица 3: Процедуры и компонентов метода Канкел в основе реакции.

Группа Клон номер Регион Процент
Нет преждевременная остановка кодон 70 CDRH1 мутация 50% (35/70)
CDRH2 мутация 57% (40/70)
CDRH3 мутация 53% (37/70)
CDRL3 мутация 56% (39/70)
По крайней мере одна мутация CDR 76% (53/70)
Преждевременная остановка кодон 20 CDRH1 дефект 45% (9/20)
CDRH2 дефект 10% (2/20)
CDRH3 дефект 15% (3/20)
CDRL3 дефект 20% (4/20)
Другие неисправности 10% (2/20)

Таблица 4: Анализ последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL3 из синтетических Fab библиотеки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Чтобы построить высокое разнообразие, фаг отображается Fab библиотек, контроль качества контрольно-пропускные пункты необходимы для мониторинга различных этапов процесса строительства, включая компетентность электро компетентных клеток, качество dU-ssDNA шаблона, эффективность СТС dsDNA синтез, титр после электропорация, потрясающий складной и аминокислоты разнообразие CDR последовательности анализа клонов ФАБ ФАГ.

Высокая урожайность и чистоту dU-ssDNA имеет важное значение для высокого мутагенеза ставки. По нашему опыту ФАГ индукции при 25 ° C ночь может принести больше ssDNA dU чем от фага индукции при 37 ° C на ночь. Это согласуется с предыдущего доклада19. Отношении ssDNA добыча первоначальный плазмида спин комплект (QIAprep) содержится MLB лизис ФАГ и привязки. Позже MLB было прекращено с неизвестной причине и заменены PB. Мы обнаружили, что доходность dU-ssDNA гораздо ниже от лечения PB по сравнению с уровнем от лечения MLB. В этом протоколе мы использовали реагент именем UT-MLB20 заменить MLB и обнаружил, что доходность dU-ssDNA похож на что из первоначального комплекта спина.

Как CDRH3 и CDRL3 являются самые разнообразные регионы для распознавания антигена21, представить с учетом разнообразия с определенным набором комбинаций аминокислот и коэффициенты и удалить избыточность предвзятости и стоп кодонов, представленный вырожденный кодонов такие как NNK (N, эквимолярных кондиционера/G/t; K, эквимолярных Г/т), тример кодон на основе фосфорамидит олигонуклеотиды22 с ровно один кодон тример, соответствующие одной конкретной аминокислоты были предназначены для CDRH3 и CDRL3. Кроме того переменной длины CDRH3 и CDRL3 олигонуклеотидов были использованы для дальнейшего увеличения различий.

После ферментативного синтеза CCC-dsDNA обычно электрофорезом геля агарозы наблюдаются три полосы и полосы должно быть ясно без мазка. Среди них быстрый запуск группа является CCC-dsDNA, который может принести высокий мутации курс (около 80%) после электропорации23. Медленный бег группа является перемещенных нити ДНК, которая возникает от присущего нити перемещение деятельности Т7 ДНК-полимеразы и имеет низкий мутации курс (около 20%)23. Средняя полоса слабых порезал ДНК после расширения из-за недостаточной активности T4 ДНК лигаза или недостаточно олигонуклеотида фосфорилирования.

Пул образец небольшой последовательности был использован для оценки разнообразия Библиотека, хотя и не точно24. Чтобы точно оценить реального разнообразия, следующее поколение виртуализации (НГС) может быть хорошим вариантом в горнодобывающей отрасли разнообразия глубина сконструированный библиотека25. На практике, из-за текущих проблем NGS технологии включая читать длина, точность, стоимость и высокую пропускную способность, секвенирование Fab Фаговые библиотеки, используемые в настоящем протоколе с длиной около 950 bp, CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL3 не является достижимыми; Однако, это можно оценить scFv (около 700 bp) библиотека разнообразия в пределах миллионы24,25. Другой ключевой стандарт для оценки разнообразия построенных библиотеки является использование библиотеки для панорамирования против многих различных типов антигенов и рассчитать позитивные клоны, захватили так как библиотека разнообразия прямо коррелировала с успешными темпами антигена панорамирование26. Высокая пропускная способность выбор платформа хорошо подходит для этой цели и читатели могут ссылаться на подробный протокол сообщили, Miersch и др. 27

Теоретически ФАГ отображается синтетических антитела библиотеки с учетом разнообразия может использоваться любой антиген и таким образом имеют широкое применение. В настоящее время включая Кембридж антитело технологии (CAT), визуальной, Genentech, Dyax, Bioinvent, Pfizer и MorphoSys компаний полагаются на Фаговые дисплей платформ для терапевтических антител развития28. Кроме того многие Фаговые отображения основных технологий патентов истек29. Несомненно это будет раскрыть максимальный потенциал технологии ФАГ отображается антитела.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы признательны д-р Фредерик Fellouse из Сидху лаборатории для критических замечаний Канкел в метод основан синтетических Fab Фаговые библиотека строительство. Авторы ценят миссис Алевтина Павленко и других членов из лаборатории Сидху за ценную помощь подготовки высокой эффективности электро компетентных клеток кишечной палочки и высокое качество dU-ssDNA. Эта работа была поддержана Национальный фонд естественных наук Китая (Грант №: 81572698, 31771006) для DW и ShanghaiTech университета (Грант №: F-0301-13-005) в лаборатории инженерной антител.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1.0 M H3PO4 Fisher AC29570
1.0 M Tris, pH 8.0 Invitrogen 15568-025
10 mM ATP Invitrogen 18330-019
100 mM dithiothreitol Fisher BP172
100 mM dNTP mix GE Healthcare 28-4065-60 solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-76-02
50X TAE Invitrogen 24710030
Agarose Fisher BP160
Carbenicillin, carb Sigma C1389 100 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL.
Chloramphenicol, cmp Sigma C0378 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9620G
Granulated agar VWR J637-500G
H2O2 peroxidase substrate Kirkegaard & Perry Laboratories Inc 50-65-02
K2HPO4 Sigma 795488
Kanamycin, kan Fisher AC61129 50 mg/mL in water,  0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL.
KH2PO4 Sigma P2222
Na2HPO4 Sigma 94046
NaCl Alfa Aesar U19C015
Nanodrop Fisher ND2000C
NaOH Fisher SS256 ! CAUTION NaOH causes burns.
NON-Fat Powdered Milk Sangon Biotech A600669
PEG-8000 Fisher BP233
Protein A-HRP conjugate Invitrogen 101123
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 22704
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28706
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Recombinant Protein L Fisher 77679
T4 DNA polymerase New England Biolabs M0203S
T4 polynucleotide kinase New England Biolabs M0201S
T7 DNA polymerase New England Biolabs M0274S
Tetracycline, tet Sigma T7660 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL.
Tryptone Fisher 0123-07-5
Tween-20 Sigma P2287
Ultrapure glycerol Invitrogen 15514-011
Uridine Sigma U3750 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL.
Yeast extract VWR DF0127-08
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E.coli CJ236 New England Biolabs E4141 Genotype: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA.
E.coli SS320 Lucigen 60512 Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production.
M13KO7 New England Biolabs N0315S
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvette BTX
96-well 2mL Deep-well plates Fisher 278743
96-well Maxisorp immunoplates Nunc 151759
Baffled flasks Corning
Benchtop centrifuge Eppendorf 5811000096
Centrifuge bottles Nalgene
ECM-630 electroporator BTX
Magnetic stir bars Nalgene
Thermo Fisher centrifuge Fisher
High speed shaker TAITEK MBR-034P
Microplate shaker QILINBEIER QB-9002
Liquid handler for 96 and 384 wells RAININ
Mutil-channel pipette RAININ E4XLS
Amicon concentrator Merck UFC803096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).

Tags

Иммунологии и инфекции выпуск 135 синтетические антитела Библиотека фаг дисплей антитела привязки фрагмента с учетом разнообразия дизайн Библиотека Библиотека строительство гибридомной технологии
Строительство синтетических Фаговые отображается ВСБ библиотеки с учетом разнообразия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S.,… More

Huang, G., Zhong, Z., Miersch, S., Sidhu, S. S., Hou, S. c., Wu, D. Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity. J. Vis. Exp. (135), e57357, doi:10.3791/57357 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter