Summary
腎構造の組織設計は、臓器不足や透析の有害な影響のためのソリューションを提供します。ここでは、マイクロ プロトコルについて述べるマウス腎臓皮質延髄セグメントの分離を解剖。これらのセグメントは、腎オルガノイドを形成、細胞スキャフォールド フリー構造に注入されます。
Abstract
腎臓移植は末期腎不全の主流療法今です。ただし、順番待ちリストの移植を達成するこれらの患者の 4 分の 1 のみ約 96,000 人に臓器を失敗した人のための代替のため緊急に必要があります。かかる全体的な医療費とともに透析の有害な結果を減らすために活発な調査は臓器移植に代替ソリューションの検索で進行中です。埋込型な組織設計の腎細胞の構成要素は、そのような可能な方法の 1 つ失われた腎機能を置き換えるです。ここでは、マウス腎臓生活髄の隔離のための顕微解剖腎セグメントは、初めて説明しました。これらのセグメントは、一度注入した宿主の血管系と高速接続を可能にするかもしれないスキャフォールド フリー内皮芽構造内で迅速な設立が可能です。成体マウス腎臓腎セグメントの直径 200-300 μ m を取得する万国実体写真レーザーマイクロダイ セクションに続いて、生きているドナーから手に入れられました。のみ 1 つの腎臓から収穫される主な腎のセグメントを使用して複数の腎構造を作製しました。このメソッドは、破棄されますそれ以外の器官から, 腎組織をサルベージできる手順を示します。
Introduction
慢性腎臓病 (CKD) は、現在主要な公衆衛生の課題世界1のいずれかです。アメリカ合衆国における CKD の有病率は苦しんでいる最も深刻な形、末期腎臓病 (ESRD)2600,000 以上のアメリカ人と、総人口の 14% を超えています。現在の透析と腎臓移植腎不全とのそれらに利用できる治療の選択肢。ただし、約 25,000 の患者数は全腎移植です毎年、毎年それらの命を救うオルガンとそれらの受信側の移植3を待っている間に大きな格差につながる患者のかなりの数が追加されます。寿命や生活の質に、深刻な悪影響を及ぼす、に加えて透析は驚異的な財政負担に関連付けられます。2014 年に、メディケアの支払い請求が以上 $ 300 億 ESRD 患者2となりました。限られた臓器供給と透析を必要とする患者のない明白な減少傾向で、透析に代替ソリューションの特定を目的とした研究活動と移植のこれまで重要です。透析の必要性で比較的短い遅延も透析関連コスト4,5,6を延期しながら生産性と品質調整生命年の患者さんの数が大幅に増加します。
腎不全のような機能的な組織の損失のためのソリューションが全臓器工学を使用して足場ベース organoid 作製に至る広く多様なアプローチと組織工学と再生医療研究所を検討中細胞注入7,8,9,10,11の器官構造を脱しました。限界または破棄された腎臓から複雑な腎構造をさただけ部分的に検討されています。実際には、ほぼ腎臓移植のために調達の 20% は様々 な理由から12,13破棄されます。これらの推定の移植から機能性腎組織を活用、1 つまたは多くの組織設計の構成要素に組み込む可能性があります。先行研究では、組織工学の目的14,15に細胞外のマトリックスのため腎臓を利用したこれらの破棄された器官での作業の可能性を実証しました。しかし、いくつかは組織工学目的16,17,18健康な腎臓からプライマリ nephronal 組織を使用しています。
キムらに記載された 1 つの方法は、コンストラクト作製16ポリグ リコール酸 (PGA) 足場で播種し、健康なラットの腎臓から腎「セグメント」分離を含みます。しかし、正確な郭清の方法論に関する少し情報を与え、セグメントが細かいミンチと濾過の組み合わせから得られました。我々 は、同様にそのまま nephronal アーキテクチャにより、個別の腎セグメントが生成されますが、代わりに顕微解剖技術に依存するこのプロトコルの変更について説明します。までは、生きている成体、腎臓、腎被膜を削除すると、組織はさらに解剖、解剖顕微鏡に転送後に実行されます。小口径 30 G 針、切断器具として使用されます、また郭清の支援をガイドとして針として直径腎セグメントのターゲット直径に等しい。分離、この場合マウス、腎のセグメントは文化の実行可能性を維持し、スキャフォールド フリー内皮芽細胞構造19組み込みます。これらの構成要素は以前20バイオ人工膵臓を含む他の臓器をエンジニアに使用されています。
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Protocol
下記すべての動物の外科手術は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 任意の動物の手術前にサウスカロライナの医学大学でまたは任意の動物の組織の使用によって承認されました。
1. マウス腎摘除術
- サージカル マスク、汚染のリスクを最小限にふっくキャップをドンします。外科領域の設定時に無菌性を維持します。
- 手術台の上の無窓型外科用ドレープを配置します。
- 滅菌ドレープをオートクレーブ器パックを開きます。3 小さな止血剤、微細鉗子歯、歯とストレート アイリスはさみなし微細鉗子腎摘除術に必要な楽器があります。
- 手術台の中央に別の非穴あき手術用ドレープを配置します。
- 5 mL のダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) カルシウムとマグネシウム、15 mL の生殖不能の円錐管に 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと補われるを準備します。オペレーティング テーブルの横に氷の上には、このソリューションを配置します。
- 動物の住宅団地から、8-12 週齢の c57bl/6 マウス (男性または女性) を取得します。
- 麻酔が誘導商工会議所の中にマウスを置くし、イソフルラン吸入 3.5% を誘発します。2% イソフルランを用いた維持麻酔期マウスの鼻の円錐形を配置します。
- ペダル反射 (しっかりつま先ピンチ) の評価を行い、手術を通して定期的に麻酔の十分な深さを監視します。
- 脱毛クリームを使用して腹側の胴体から髪の毛のすべてを削除します。蒸留水、腹部からすべての髪を削除されていることを確認するためにこの領域をすすいでください。
- マウスをトップ以外穴あきドレープの下で仰臥位で滅菌手術台に転送します。ちょうどマウスの腹部を覆うドレープの 2 × 2 cm2窓を切り取りなさい。
- ポビドン ヨード 70% エタノールで滅菌ガーゼや綿球を使用して腹部に続いてを適用します。
- はさみの歯とアイリス微細鉗子を使用して、3-4 cm 縦腹部の切開を正中、正中線の左に 0.5 cm に平行になるよう
注:右の腎臓を削除しようとすると、これは正中線の右に 0.5 cm 切開になります。- 歯のない微細鉗子で腹膜をつかみ、腹腔内を入力するアイリス ハサミで切開します。止血剤を皮膚と腹膜緊張を横方向に配置し、露出を高めるための優れたと劣る横方向のエッジに適用されます。
- 左の腎臓を公開する腹部の右側に腸の内容物を繊細なシフトします。腹部から昇格する腎臓にトラクションをそっと置きます。
- 場所左腎門部で止血します。アイリスのはさみを使用すると、尿管と腎血管のトランセクトします。
- 左の腎臓が 1%、氷の上のペニシリン/ストレプトマイシン DPBS ソリューション。
- 滅菌のティッシュ文化フードに腎臓を含むチューブを転送します。15 mL コニカル チューブから腎臓を 60 mm シャーレ (図 1) に転送します。カルシウムとマグネシウム 5 mL DPBS を 2 回使用してリンスします。5 ml 60 mm ディッシュの DPBS 中断腎臓を維持します。
- 5 ml の DPBS レーザーマイクロダイ セクション プロトコル中に使用する追加の 60 mm ペトリ皿を準備します。
- 承認済みの IACUC 動物プロトコルに従って開胸する外れると出血、腎臓の調達、次のマウスを安楽死させます。
2. マウス腎臓レーザーマイクロダイ セクション腎セグメントの分離
- 滅菌手袋、サージカル マスクを含むプロトコルのこの部分の無菌技術を使用し続けるとふっく汚染リスクを最小限に。
- 生殖不能の場所だけ残された領域と器具の滅菌フィールドを持っている顕微鏡の権利に関して同様のステレオ顕微鏡プラットフォームでおいましょう。顕微鏡焦点のノブにプラスチックの粘着シートを置き、70% エタノールをスプレーします。ステージの光デュアル グースネック照明をオンします。
- (歯、メス ハンドル、#15 メスの刃、2 つのストレートの止血剤、2 つの 30 の微細鉗子ゲージ中空穴針)、滅菌ドレープにオープン滅菌器具メスに場所 #15 ブレードは今処理、図 1に示すように、後で使用するため針解剖器械を作成する各の針のアダプター/ハブに 1 つ止血を取り付けます。
- DPBS で、唯一顕微鏡領域にティッシュ文化フードからの DPBS、腎臓を含む 60 mm のペトリ皿を移動します。
- 目的として 60 mm のペトリ皿を置き、腎臓を公開するふたを削除します。後で使用するため滅菌フィールド側に DPBS 含む料理を残します。
- 腎臓の前部または後部の表面だけが表示 (すなわち皿の底に触れる他の顔と腎臓の大きな平坦な面) に皿を移動します。手順のこの部分の 3.2 倍にズームします。非利き手を使用し、歯のない微細鉗子でピアスし、腎臓の下、優れた極周辺料理に対して腎臓を固定します。
- 腎臓を固定する場所に非支配的な手をしてください。支配的な手で露出面から半透明の線維性の被膜層を削除するのに #15 のブレードを使用します。カプセルの残りの部分を削除する腎臓の表面から最も表面的な 0.5 mm を剃る。
- #15 ブレードを使用して、サイズで約 2 mm3互換領域から組織のピラミッドを解剖します。DPBS のみを含む 60 mm ディッシュを取得し、きれいな皿に組織のピラミッドを配置します。腎臓の残りの部分を破棄します。
- 解剖の残りの 1.5 2.0 x 倍率が下がります。組織のセグメントが針の先端の径以下になるまで、漸進的により小さい一個に組織片をスライスして切断器具として 2 つの止血針楽器を使用して。腎組織 2 mm3サイズで一度は完全に解剖 50 以上のセグメントが生成されます。
- 腎のセグメントを持つ 60 mm ディッシュをティッシュ文化フードに移動します。1000 μ L ピペット DPBS を削除します。5 mL DMEM、10% 1% と胎仔ウシ血清 (FBS) ペニシリン/ストレプトマイシンと補足を追加します。
- インキュベーターや携帯にインプラントで 37 ° C で 3 日間培養をすぐに構築します。
3. 腎セグメント細胞構造の作製
- 文化正常ひと真皮線維芽細胞 (培養) と脂肪微小血管内皮細胞 (HAMEC) 構築希望あたり5血管内皮細胞線維芽細胞5 10 × 7.2 と 1.8 × 10 を取得する数週間。ティッシュ文化フードのスキャフォールド フリー事前血管内皮細胞線維芽細胞構成要素 (仕様) Czajkaによって前述を形成する agarose 金型で内皮細胞 (4:1) 棒状の井戸に線維芽細胞の適切な比率をシードら 19。
- 滅菌止血、30 G 針、滅菌スパチュラ フラット エンドを取得します。
- 吸引し、腎のセグメントを削除しないように注意して、腎のセグメントを含む 60 mm の板からメディアの大部分を削除します。
- セグメントの注入を視覚化する手術用ルーペを装備します。
- ヘラの先端に沿って均等に広がる 10 15 セグメントを取得する 60 mm ディッシュの下部に沿って優しくヘラの終わりをこすり。ヘラの先端をスペックに播種された井戸の唇にできるだけ近くに配置します。
- 井戸の端にヘラの先端からそれぞれの個々 のセグメントを移動するのに一方で止血 30 G 針機器を使用します。優しく下も若干以前シード細胞懸濁液に浸漬するまで針の先端を使用して、各セグメントを移動します。
- 2 腎セグメント仕様の文化: FGM-2/EGM-2/DMEM 培地 (2.5 mL 出来高の合計) の比率は 1:1。3 日間文化メディアすべての 24 h を変更します。72 h で金型から構成要素を削除、修正または急速凍結処理のため。
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Representative Results
説明されたプロトコルは、腎組織のピラミッド型 2 mm3セクションあたり約 50 腎セグメントを生成します。処理とイメージされている腎のセグメント (図 2を参照) の異なる割合で尿細管・糸球体のコンポーネントがあります。そのままセグメントは 3 日間異なるセグメント 24 時間に一度の生存率を決定するために分析を受けた。グリーン蛍光カルセイン AM は生体細胞、細胞内エステラーゼ活性の存在です。赤蛍光エチジウム ホモ-1 は、細胞膜の完全性の損失で見られます。これらのセグメントはそのままに、立体構造、重要なアッセイの浸透は共焦点顕微鏡とかなり (図 3参照)。
セグメントは、同じセル実行可能性の試金を使用してサイズの均一性に更に特徴付けられました。不況でスライド ガラスを使用して、セグメントに置かれたカバーの下スリップ セグメントの任意の次元に機械的な力なし。無料で浮動小数点、セグメント細胞生存性/毒性アッセイに配置したイメージの 30 分。10 μ m ステップ サイズの z 投影は、セグメント全体を通して撮影されました。最大 'の X' と 'Y' の寸法が得られ、記録。'Z' ディメンションが最後の最初からの距離を計算することによって得られた目に見える蛍光。セグメントが約 1 立方、簡単な体積測定を得、1 つ顕微解剖実験から 10 のランダムに選択されたセグメントを比較するプロットします。ターゲット ・ ボリュームを (300 μ m)3 = 0.027 mm3ヒストグラム(図 4)に赤いマーカーが表示されます。代表的な 'X' と 'Y' の測定は、図 4Bに表示されます。外れ値、ターゲット ・ ボリュームに近い多くのセグメントがあります。繰り返し実験が一貫した結果を示している (n = 20)。生の測定値 (ここでは示しません) は 200-300 μ m の測定を少なくとも 1 つのディメンションがあるセグメントの大半のことを示します。拡散の制限について重要な意味を持ちます。
腎のセグメントは、スキャフォールド フリー内皮芽構造体に埋め込まれた、3 日間培養します。腎のセグメントをそのまま構造を形成する細胞の構造 (図 5A参照) 3 日目に組み込みます。構造は、von Willebrand 因子 (図 5E) ラベルで示されている、あらかじめ血管内皮細胞ネットワークを維持します。しかし、それが腎細胞材料がネットワークに侵入することは表示されません。腎上皮細胞は、サイトケラチン 18 (図 5B緑) が付いています。体外腎機能をテストするためにこれらの構成要素と FITC 標識アルブミン (図 5C、灰色) 培養。残留がある一方アルブミン埋め込み腎組織のセグメントから「ホット スポット」がある地域で発見腎尿細管上皮の細胞、内 luminally を横断するアルブミンを取る知られているの。これは腎セグメント細胞構成要素でアルブミンをセロトニン再取り込みを表すと考えられます。
図 1: 代表写真摘除術および腎セグメント レーザーマイクロダイ セクション。マウス腎臓を削除、洗浄と 60 mm ディッシュに配置され万国実体写真顕微鏡ステージに移動します。針の先端の直径を使用して、郭清をご案内します。止血剤は、解離の楽器のためのヒントを針にアタッチされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: Microdissected 腎セグメント。Microdissected 腎セグメントでは、それらのネイティブの配置 (左下隅、好塩基性構造) は糸球体と尿細管 (画像の残りの部分) の変化する割合を含めます。10 X イメージは、スケール バーのとおり。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 腎セグメント生存します。Microdissected 腎セグメントは、ライブとデッドの組織の一部を含みます。主に、セグメントはリビング、すし自体実行可能性の試金は細胞に有毒、72 h 注別のセグメントが異なる時点で使用されたことで文化の維持します。10 X イメージ、スケールバー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 腎セグメント量均一。(A) mm3 1 つ解離実験からで容積をセグメント (n = 10)。個々 のセグメントは、赤いターゲット ポイント (ターゲット容積 0.027 mm3) と比較して、青の点で表されます。(B)代表者 X と Y は寸法ライブ デッド試金、10 X イメージからの計測です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 組織設計スキャフォールド フリー腎セグメントの構築。(A)腎セグメントの仕様(B)サイトケラチン 18-肯定的な腎尿細管上皮細胞 (グリーン) への取り込みを示すマージされた画像。(C) FITC 標識アルブミン。核(D) Hoescht 染色。(E)フォン ・ ヴィレブランド因子 (vWF) 陽性 prevascular ネットワークを強調表示します。10 X イメージ、スケールバー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
構造は広く細胞と生体材料の利用、そして多くの場合、両方のタイプに関してそれぞれ異なる生体腎組織をエンジニア リングに使用するメソッドは、古いまたは文献7にない特徴です。多くは幹細胞のアプローチを使用している、または単独で腎のアーキテクチャの個々 のコンポーネントの概説、人工的に細胞懸濁液から以上 26 種類の分化した細胞を臓器全体を再作成の見通しは圧倒的に21を考慮します。これはなぜ他の人はティッシュ エンジニア リング アプリケーションで腎組織のセグメントを使用してのアプローチに移動している可能性が高いです。前述のように、前作は PGA 足場16シードに腎のセグメントに分離されてきた。ただし、セグメントの分離を記述するための方法論は、細部で記述されていた、セグメントしない任意の期間の実行可能性を評価するために培養します。細胞アッセイの使用と共に、ここで説明するメソッドは、最低限、腎のセグメントの部分が前に記載されていない、72 h のマークに生存率を保持しているを示しています。メソッドは、かなり予測可能な寸法とセグメントの生産の利点もあります。さらに、これらのメソッドは、主に破棄されますそれ以外の器官から主な腎組織のセグメントの分離の可能なメソッドを示す腎の機能を失敗を増強する臨床的に翻訳可能なアプローチを提供します。
メソッドを開発する上で最大の課題が、最初に、適切なサイズ、および手順関与細胞文化フードの外多くのステップ不妊を維持する 2 番目の滅菌オブジェクトを識別します。30 G の針の先端は、解離装置と同様に有用な測定ことが分かった。不妊は、主に手術のセットアップと制御マウスの毛皮に関連実験の早い段階での挑戦でした。
プロシージャの制限は、腎組織のセグメントの三次元の性質に関連しています。顕微鏡下で 1 つのビュー、セグメントの寸法が約 0.260 mm 針径のサイズに表示されます。ただし、Z 軸は堅実に表示されません。それ自体が別の制限、レーザーマイクロダイ セクションは手で行われます。将来、ロボットの標準化は理想的であります。場合 2 mm3腎組織のピラミッド型の部分は、解剖時に正しい方向に維持された、そのままネフロンを解剖できません計り知れなかった。最後に、仕様内の膵島細胞が埋め込まれて、バイオ人工膵臓へのこれらの構造を比較する 1 つはキー違い20を承認しなければなりません。腎臓は機能的と建築膵臓からユニークで恐らく間違いなくより複雑です。また、膵島細胞は、この方法で腎のセグメントを分離した機能細胞の礫岩層ではなく、膵臓の機能を細胞の 1 つだけのサブタイプです。アーキテクチャと具体的方向性腎臓、特に濾過の機能にこのような大きな役割を果たす、コンストラクト内のセグメントの均一方向の欠如は、この方法論の追加弱点です。
進行中の研究は、腎のセグメントと腎の構造機能、アルブミン取込みが発生している範囲を明確にし、その他の腎機能を評価するための評価を目指しています。将来の動物実験は、膀胱壁の腎構造の注入を伴うでしょう。この血管性の高い身体構造の構成要素を埋め込むと急速な吻合を許可し同様、濾液を膀胱内に直接排泄とのコレクション システムの必要性を未然に防ぐ。体外腎組織の機能が極めて限られていることを考えると、生体内でテストが不可欠です。アルブミン取り込みとエリスロポエチン式17,22現在報告は本邦唯一の in vitroテストが中心となります。任意の外部の生体材料に依存しない、機能、生体腎組織置換に向かって約束を示す原始内皮のネットワークと構造に埋め込まれたこれらのネイティブ アーキテクチャでそのまま腎組織の生活セグメント.
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
NIH のポスドク研修制度の助成金、NIH HL 007260
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
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