Summary
Dans ce protocole, nous décrivons la sélection et la préparation de cellules appropriées pour micromanipulation et l’utilisation d’un micromanipulateur piézoélectrique à repositionner des chromosomes dans les cellules.
Abstract
La micromanipulation des chromosomes est une méthode essentielle pour éclairer le mécanisme de chromosome congression, la broche checkpoint et mouvements de chromosome de l’anaphase et a joué un rôle clé pour comprendre ce qui contrôle les mouvements du chromosome au cours d’une division cellulaire. Un biologiste qualifié peut utiliser un micromanipulateur pour détacher les chromosomes de la broche, de repositionner des chromosomes dans les cellules et d’appliquer des forces aux chromosomes à l’aide d’une aiguille de petit verre avec une pointe très fine. Tandis que des perturbations sont possibles aux chromosomes à l’aide d’autres méthodes comme le piégeage optique et autres utilisations d’un laser, à ce jour, aucune autre méthode ne permet le repositionnement des composants cellulaires à l’échelle de quelques dizaines à plusieurs centaines de microns avec peu ou pas de dommages à la cellule .
La sélection et la préparation des cellules appropriées pour la micromanipulation des chromosomes, décrivant spécifiquement la préparation des cultures primaires de sauterelle et le cricket spermatocyte pour l’imagerie de cellules vivantes et micromanipulation, sont décrit ici. En outre, nous montrons la construction d’une aiguille à utiliser pour le déplacement des chromosomes au sein de la cellule et l’utilisation d’un micromanipulateur piézoélectrique contrôlées par joystick avec une aiguille de verre attachée à elle pour repositionner des chromosomes dans les cellules en division. Un résultat de l’échantillon montre l’utilisation d’un micromanipulateur pour détacher un chromosome d’un axe dans un spermatocyte primaire et de repositionner ce chromosome au sein de la cellule.
Introduction
Micromanipulation a révélé des pièces du mécanisme pour une chromosome congression, la broche checkpoint et mouvements de chromosome de l’anaphase. La première publication décrivant les résultats des expériences de micromanipulation était par Robert Chambers1. Chambers a utilisé un micromanipulateur mécanique avec une aiguille de verre ci-joint pour sonder le cytoplasme d’un certain nombre de différents types cellulaires. Malheureusement, les méthodes de contraste permettant la visualisation des chromosomes et de nombreux autres composants cellulaires dans les cellules vivantes n’étaient pas disponibles dans le temps, donc expériences Chambers' impossible d’afficher les effets de ces composants cellulaires de repositionnement. Micromanipulations précoces qui a modifié la position chromosomique utilisé l’appareil Chambers à balayer le milieu de la broche dans les cellules de l’anaphase, montrant que ces manipulations pourraient modifier la position des bras chromosomiques en neuroblastes sauterelle de l’anaphase2 . Nicklas et ses collaborateurs furent les premiers à effectuer des micromanipulations fines des chromosomes, qui s’étend des chromosomes3, détacher de la fusée et induisant une réorientation3,4, stabiliser une malorientation en appliquant la tension pour les chromosomes5,6,7et en mesurant les forces produites par pivots en anaphase8,9. Autre travaux par le laboratoire de Nicklas ont montré que les granules cytoplasmiques pourraient également être manipulé10 et que les centrosomes pourraient être réorientées en micromanipulation11. Micromanipulation n’est pas seulement utile pour déplacer des chromosomes et autres composants cellulaires. Une aiguille de micromanipulation peut couper proprement un fuseau mitotique dans demembranated cellules12 ou peut être utilisée pour dissoudre l' enveloppe nucléaire13. En outre, les cellules adjacentes peuvent être fusionnés par micromanipulation14,15.
Avec une telle variété d’expériences intéressantes qui peut être fait à l’aide de micromanipulation, c’est à première vue surprenant que micromanipulation expériences ont été faites par très peu de biologistes du chromosome. Une des raisons de cette carence, c’est que les cellules cultivées de division mitotique qui sont dérivées de tissus vertébrés et sont couramment utilisés pour l’étude des mouvements des chromosomes sont extrêmement difficiles à micromanipulate. Ces cellules de culture de tissu ont généralement un cytosquelette cortical que « obtient de la manière » de la micromanipulation aiguille et chromosomes non plus n’est pas joignable par l’aiguille ou Marc de l’aiguille à travers la cellule, conduisant à une rupture de cellules et de la mort. Autres expérimentateurs qui utilisent la micromanipulation, et nous avons trouvé arthropodes cellules à se prêter à la micromanipulation. Les spermatocytes arthropodes sont facilement se propager sous une couche de Huilehalocarbone et semblent avoir un cytosquelette cortical beaucoup moins robuste qui sous-tendent la membrane cellulaire au cours d’une division cellulaire. Ainsi, les testicules arthropodes constituent une bonne source de cellules de division de méiose (spermatocytes) et de division mitotique des cellules (spermatogonies) avec des chromosomes facilement accessibles pour la micromanipulation. Une série de sectionnement d’un spermatocyte sauterelle fixé pendant une manipulation a révélé que l’aiguille pénètre jamais dans la membrane cellulaire ; la membrane cellulaire se déforme autour de l’aiguille (Nicklas R.B., communication personnelle). Les spermatocytes de plusieurs taxons d’insectes et araignées ont été micromanipulés avec succès, y compris les sauterelles, les Mantes priant, drosophiles, tipules, grillons, cercopes, papillons, araignées veuve noire, cave araignées et orb-weaving spiders 3,7,17,18,19,20,21,22. Des cellules cultivées, facteur de division mitotique des insectes peuvent être micromanipulés. Par exemple, les chromosomes en neuroblastes sauterelle dans une culture primaire ont des chromosomes qui peuvent être facilement micromanipulés2,23. Nous soupçonnons que la disposition cultivés lignées dérivées de drosophile et autres insectes seront également micromanipulatable, bien que nous n’avons pas testé la technique avec ces cellules. Nous allons montrer comment diviser des cellules de sauterelles et les grillons peut être préparé pour une micromanipulation. Grillons sont faciles à obtenir de la plupart des magasins pour animaux de compagnie à tout moment de l’année. Les sauterelles ne sont faciles à obtenir en été à moins que le chercheur a accès à une colonie de laboratoire, mais l’espèce utilisée (Melanoplus sanguinipes) a aplani facilement les cellules et longs, facile-à-manipuler les chromosomes.
Une autre raison pourquoi les expériences de micromanipulation ont été faites par une petite poignée de biologistes est que micromanipulateurs qui bougent bien les chromosomes sont rarement disponibles sur le marché. Nous avons constaté qu’un micromanipulateur piézoélectrique contrôlées par manette contrôle le mouvement de l’aiguille sans vibration, dérive, ou le décalage entre les mouvements de la manette et le déplacement de l’aiguille, mais les autres types de manipulateurs peuvent pousser aussi avec succès des chromosomes autour de la cellule. Les micromanipulateurs conçus par Ellis et Begg25,26 sont idéales pour la micromanipulation des chromosomes, bien qu’elles utilisent la technologie plus ancienne. Micromanipulateurs PIEZO-ELECTRIQUE sont actuellement disponibles et couramment utilisés en électrophysiologie ; Toutefois, ces micromanipulateurs ne sont pas généralement contrôlée par joystick. Contrôle de manette de jeu est essentielle pour le mouvement lisse d’une micromanipulation réussie, et donc une manette de jeu personnalisé doit être construite pour faire les micromanipulateurs PIEZO-ELECTRIQUE actuellement disponibles fonctionnent pour une micromanipulation de chromosome. Les micromanipulateurs piézoélectriques contrôlées par joystick qui fonctionnent le mieux ont contrôle de position directe, où le mouvement du levier de commande se traduit directement à un déplacement de l’aiguille.
Un micromanipulateur piézoélectrique nouvellement conçu peut être construit de pièces disponibles sur le marché qui peuvent être facilement remplacés et de quelques petits composants imprimés 3D, et il fonctionne bien pour le chromosome micromanipulation24. Le micromanipulateur n’a sensibilité réglable, positionnement manuel grossier et aucune vibration, dérive ou retard dans le mouvement de l’aiguille et le contrôle direct de position de l’aiguille. Les scientifiques peuvent construire le micromanipulateur à l’aide d’instructions disponibles en ligne24. Voici les méthodes de préparation d’une culture de cellules de spermatocytes primaires et pour micromanipulating les chromosomes dans les cellules de cette culture.
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Protocol
1. préparation de la Culture de cellules primaires Spermatocyte insectes Micromanipulation
- Préparation des lames
- Obtenir une lame de verre de 75 mm x 25 mm avec un trou circulaire de 20 mm de diamètre, découper au centre de la diapositive.
NOTE : Elles ont été coupées d’une seule feuille de verre à vitre à la taille d’une lame de verre avec un trou au centre. - Une lamelle de 25 x 25 mm #1.5 faire executer une flamme de bec Bunsen pour 2 s.
- Appliquez de la graisse sous vide sur le pourtour du trou dans la lame de verre
- Placer la lamelle sur le trou comme dans la Figure 1. Appuyez dessus et veillez à former un joint étanche.
- Retourner la lame de verre et remplir la dissection bien Huilehalocarbone.
- Obtenir une lame de verre de 75 mm x 25 mm avec un trou circulaire de 20 mm de diamètre, découper au centre de la diapositive.
- Préparation de la culture de spermatocyte pour l’affichage sur le microscope
Remarque : Nous décrivons ici la méthode de préparation de culture à l’aide de cellules sauterelle ou le grillon. Contenu des testicules d’autres arthropodes peut être cultivées à l’aide d’une méthode similaire.- Procurez-vous les grillons mâles subadultes (ou sauterelles). Placez un insecte vivant dans un réfrigérateur pendant environ 2 min à froid-l’anesthésier. À l’aide de ciseaux de dissection, rapidement couper à travers la surface dorsale parallèle à l’axe longitudinal de l’abdomen juste derrière l’aile des bourgeons. Manuellement, presser l’abdomen doucement pour pousser les testicules à travers la coupe dans l’exosquelette (Figure 2).
- À l’aide de pinces, placez les testicules isolés dans une cupule contenant Huilehalocarbone la dissection.
- Le cas échéant, Découvre les testicules sous un microscope à dissection. Divisez-les en petits morceaux à l’aide de la pince fine pointes, enlevant toute graisse couvrant les testicules et utilisez la pince fine pointes pour briser les testicules (figures 3 a et 3 b). Étaler le contenu des testicules en vertu de l’huile, sur la surface de la lamelle (Figure 3).
- Étaler le contenu des testicules jusqu'à ce que la partie propagation du testicule est à peine perceptible à l’oeil (Figure 3). Utilisent des puits de dissociation de chargés en huile supplémentaire si nécessaire.
2. micromanipulation
- Production de la microneedle
- Placez une extrémité d’un tube de verre (0,85 mm de diamètre extérieur, 0,65 mm de diamètre intérieur) dans la flamme d’un bec Bunsen. Tirer sur l’extrémité de la tubulure de verre de telle sorte qu’un angle de 150° est formé, et une zone d’extension du tube de verre étroit est créée. Casser le tube dans la région de mince afin que la région mince qui s’étend de l’angle est d’environ 10 mm de long (Figure 4 a).
- En utilisant une microforge (mesure selon Powell27 ou commercialement disponibles-voir la Table des matières), toucher la pointe de l’aiguille de verre pour le fil de platine chaud pour faire fondre le verre à l’extrémité. Forme un angle d’environ 45° entre l’aiguille et le fil de platine de la microforge (Figure 4 b). Tirez sur la vitre de l’incandescent, tout en coupant la chaleur au fil, formant une pointe fine de ≤1. 5 mm à l’extrémité de l’aiguille de verre.
NOTE : Le diamètre de pointe sera difficile à mesurer, mais une astuce de cette longueur est susceptible d’induire une aiguille souple mais ferme qui conviendra à la micromanipulation. Alternativement, un micropipettes pourrait servir à créer des tubes de verre avec un diamètre approprié (l’expérimentateur devra tester différentes recettes de traction pour produire une microneedle bien ferme mais souple pour le travail). L’aiguille pourrait être placé dans un support qui a la forme de la même façon à l’aiguille de manipulation créé selon la méthode décrite ci-dessus.
- Positionnement du micromanipulateur
- Placez la diapositive préparée sur la scène d’un microscope à contraste de phase inversée. Trouver les Division des cellules et centrer dans le champ de vision. Mettre l’accent sur les cellules en utilisant le grossissement le plus faible possible.
NOTE : Nous avons utilisé un objectif de contraste de phase X 16. - Placez le micro aiguille dans le porte aiguille sur le micromanipulateur.
- Positionner le micro aiguille dans le trajet optique du microscope manuellement afin que la pointe de l’aiguille est éclairée par la lumière (Figure 5 b).
- Concentrer le microscope plusieurs plans focaux au-dessus du plan dans laquelle se trouvent les cellules.
- Repositionner le micro aiguille en utilisant le levier de commande à une faible sensibilité plusieurs fois pour trouver l’ombre de l’aiguille dans les axes X et y. Continuer à réajuster la position jusqu'à ce que la position de l’extrémité est visible. Ajustez la position de l’aiguille le long de l’axe z jusqu'à ce que la pointe de l’aiguille est au point.
- Se recentrer sur les cellules, puis se concentrer le microscope au-dessus du plan de cellule afin que les cellules sont juste hors de discussion et invisible. Réajuster la position de l’aiguille pour que son extrémité soit mise au point dans ce plan focal.
- Ajustez le grossissement du microscope selon vos besoins.
NOTE : Nous avons utilisé un objectif 100 X 1.4 de contraste de phase ouverture numérique (NA) pour la micromanipulation. - Après en se concentrant sur les cellules à l’aide de l’objectif de grossissement supérieur, encore une fois se concentrer le microscope au-dessus du plan de cellule afin que les cellules sont juste hors de discussion et invisible. À l’aide d’un réglage de sensibilité plus élevé, réajuster la position de l’aiguille pour que sa pointe est au point et centré dans le plan focal au-dessus du plan dans laquelle se trouvent les cellules.
- Se recentrer sur les cellules, en ajustant leur position afin qu’elles restent dans le centre du champ de vision. L’aiguille est maintenant prêt pour la micromanipulation.
- Placez la diapositive préparée sur la scène d’un microscope à contraste de phase inversée. Trouver les Division des cellules et centrer dans le champ de vision. Mettre l’accent sur les cellules en utilisant le grossissement le plus faible possible.
- Micromanipulation des chromosomes
- En utilisant le même paramètre de sensibilité en ce qui concerne le positionnement fine à un fort grossissement, utilisez le joystick pour contrôler le micro aiguille et bouscule les chromosomes à l’intérieur de la cellule. Gardez la pointe de l’aiguille au-dessus du plan des cellules.
- Pour tirer ou déplacer un chromosome, se concentrer sur un chromosome près du sommet de la cellule.
Remarque : Ces chromosomes sont plus faciles à manipuler-manipuler les chromosomes proche de que la lamelle couvre-objet, il est probable que l’aiguille va moudre dans la lamelle, éclatement de la cellule et de mettre fin à l’expérience. - Ajuster l’axe z sur la manette pour mettre la pointe de l’aiguille en focus et puis déplacer l’aiguille pointe avec le joystick en X et Y. Placer l’extrémité de l’aiguille directement sur le chromosome pour être manipulés et le pousser dans la direction souhaitée afin de permettre le manipulateur à repositi sur le chromosome.
- Selon quelle distance le chromosome est poussé, soit appliquer une tension sur le chromosome ou appliquer une tension suffisante pour détacher un chromosome de la broche. Une fois qu’un chromosome est enlevé d’une broche, le placer n’importe où dans la cellule.
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Representative Results
La figure 6 montre une micromanipulation échantillon de 2 spermatocytes primaires adjacentes sauterelle dans plusieurs exemples des utilisations possibles de micromanipulation. Cette expérience a été faite à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversée,. 0:00 (les heures indiquées sont en min:s) image montre les deux cellules avant la manipulation. Un chromosome dans la cellule inférieure apparaît plus sous tension appliquée par l’aiguille de micromanipulation (0:05 ; noir flèche) et puis complètement détachée de la broche (0:10 ; noir flèche). Un chromosome dans la cellule inférieure (06:25 ; flèche jaune) est poussé vers le pôle 1 broche de cette cellule (07:05 ; flèche jaune) et puis s’installe à l’extérieur de la zone de la broche principale (07:10 ; zone jaune). Les deux chromosomes manipulés (flèches jaunes et noirs) dans cette expérience sont conservés de rattachement à la broche en étant continuellement poussé avec l’aiguille de micromanipulation afin d’éviter une formation de nouveaux attachements de broche. L’ombre projetée par l’aiguille de micromanipulation est visible en quelques images, mais la pointe de l’aiguille est rarement visible. Ces images montrent qu’il est possible de repositionner, tendez à et détacher un chromosome de la broche à l’aide de micromanipulation. Chromosomes peuvent être enlevés une broche dans leur prométaphase, métaphase et l’anaphase, bien que l’anaphase chromosomes sont extrêmement difficiles à détacher.
Figure 1 : Verre diapositive avec lamelle attachée. Une lamelle 25 mm x 25 mm, imprégnées de flamme est attachée à une lame de verre de 75 mm x 25 mm avec un trou circulaire de diamètre coupée dans le centre et scellé avec de la graisse sous vide de 20 mm. Notez l’absence de bulles visibles ou des lacunes dans la graisse sous vide sous la lamelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Retrait des testicules de cricket et de sauterelle. Testicules (flèche) peuvent être retirés du criquet mâle (Acheta domesticus-haut) ou une sauterelle (Melanoplus sanguinipes-bas) après une incision est faite sur l’abdomen de l’insecte, juste derrière les bourgeons d’aile (pointes de flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Préparation de la cellule se propager. (A) la plus grande partie des testicules d’un criquet est indiquée par la flèche. Le segment de testicules utilisé pour une seule diapositive est indiqué par la flèche. Echelle = 1 mm. (B) les testicules Grasshopper sont composées d’un certain nombre de tubules. En règle générale, nous avons utilisé 4 tubules d’une sauterelle mâle juvénile pour chaque diapositive, comme le montre cette image. Echelle = 1 mm. (C) pour soit les espèces, les testicules sont cassées à l’aide de pinces, et le contenu des segments des testicules est disséminé par Huilehalocarbone. Le contenu de testicules de propagation dans l’huile est affiché. Echelle = 10 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Une aiguille de micromanipulation formée à partir de verre étiré. (A), la forme générale de l’aiguille est un segment long, sans modification du verre tube (≥10 cm), avec un détour d’environ 150 ° environ 10 mm de l’extrémité (formée par étirage et plier le tube de verre dans la flamme du bec Bunsen). (B) le panneau indique l’aiguille placée dans le microforge. Les formes de l’aiguille (tête de flèche) un angle d’environ 60° avec le filament de fil de platine (flèche) avant chauffant. (C), la pointe de l’aiguille (tête de flèche) est formé après que le tube de verre courbé est touché à filament incandescent platine (flèche) dans la microforge et se détache. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Placement de l’aiguille dans le trajet optique microscope. (A), ce panneau affiche un avis du micromanipulateur. (B), ce panneau affiche une vue rapprochée de l’aiguille de micromanipulation placée dans le porte aiguille micromanipulateur, qui est un morceau de 3-d imprimés en plastique. (C), une pointe d’aiguille positionnée dans le trajet optique d’un microscope à contraste de phase inversée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Micromanipulation des chromosomes en deux spermatocytes primaires adjacentes sauterelle. Les temps sont indiqués dans min:s. la valeur 0:00 image montre les deux cellules avant la micromanipulation. Tension est appliquée sur le chromosome (indiqué par la flèche noire) à l’aide de l’aiguille de micromanipulation vers le pôle de l’axe supérieur de cette cellule (0:05). Le chromosome est détaché de la broche et poussé vers le poteau de pivot inférieur (0:10) et a déménagé à l’extérieur de la zone de l’axe principal (06:25, 07:05 et 07:10). Un chromosome de la cellule adjacente (06:25, flèche jaune) est poussé vers le pôle de l’axe supérieur dans cette cellule (07:05, flèche jaune) et ensuite déplacé en dehors de la masse de la broche principale (07:10, flèche jaune). Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Avec la pratique, de déplacer des chromosomes dans la cellule peut devenir une seconde nature. Les aiguilles qui sont suffisamment rigides et suffisamment mince pointe sont difficiles à « obtenir le don de » fabriquer, mais cette capacité est également livré avec la pratique. Les aiguilles qui sont si fines qu’elles déforment quand ils sont déplacés dans le Huilehalocarbone ne sera pas utiles pour pousser les chromosomes de la cellule. Les aiguilles qui sont tellement brutal que leurs conseils sont visibles et aussi grande que 1/3 de la largeur d’un chromosome (ou plus) sont très susceptibles de tuer la cellule. La création d’une aiguille suffisamment fine pousser des chromosomes, mais pas tellement émoussé quant à tuer la cellule est l’étape cruciale du protocole.
Succès entraîne généralement lorsque les organismes sains sont utilisés pour spermatocyte des préparatifs, et les chromosomes près de la surface supérieure de la cellule sont sélectionnés pour la micromanipulation. Les tentatives de manipulation des chromosomes près de la lamelle couvre-objet-surface de la cellule souvent entraîner moudre l’aiguille de micromanipulation dans la lamelle et perforation de la cellule, mettant ainsi fin à l’expérience. Si la cellule n’est pas percée ou sinon malsaines, la cellule doit survivre micromanipulation. La mort cellulaire est facilement diagnostiquée, comme les chromosomes agglomèrent très rapidement. Micromanipulés cellules survivent généralement par le biais de l’anaphase et la cytocinèse, et nous avons mené avec succès des expériences de micromanipulation longue de 6 h.
Bien qu’il existe une courbe d’apprentissage abrupte et l’obligation d’acquérir de l’équipement en prépare à micromanipulate, il y a beaucoup de valeur à pouvoir repositionner manuellement les composants cellulaires de manière précise. Comme indiqué ci-dessus, il n’y a aucune autre méthode actuellement disponible qui permet ce repositionnement précis des grandes structures cellulaires. Il y a une longue histoire d’utilisation de micromanipulation pour déplacer les structures dans la cellule. Exemples, avec belles figures du processus, de l’utilisation de micromanipulation pour mesurer les forces exercées sur l’anaphase I chromosomes8 et appliquer une tension aux chromosomes5 sont disponibles dans la littérature. En outre, beaucoup d’exemples de comment micromanipulation peut également être utilisée pour modifier la position d’autres structures dans les microtubules alvéolaire28,29, perturber les autres structures de la cellule comme l' enveloppe nucléaire13ou fusible les cellules adjacentes14,15 sont illustrées dans la littérature.
Plusieurs expériences de micromanipulation doivent être faites, comme la possibilité de repositionner manuellement les chromosomes et autres structures, d’appliquer des forces aux structures, et pour mesurer les forces sur des chromosomes différents stades de la division cellulaire conduira à une meilleure compréhension des processus cellulaires et la création de modèles mathématiques précis, prédictives des processus cellulaires. Les applications futures permettra une mesure facile des forces sur les chromosomes dans toutes les étapes de la division cellulaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Jessica Hall pour son précieux travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25 mm x 25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order--call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
References
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