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Bioengineering

विद्युत प्रवाहकीय पाड़ को मिलाना और स्टेम सेल देने के लिए

Published: April 13, 2018 doi: 10.3791/57367
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University School of Medicine, 2Stanford Stroke Center and Stanford University School of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल एक कोशिका संस्कृति प्रणाली के निर्माण का वर्णन करने के लिए एक प्रवाहकीय बहुलक पाड़ पर इन विट्रो बिजली की उत्तेजना और vivo में स्टेम सेल के आरोपण के बाद एक का उपयोग कर पाड़-बीज के लिए स्टेम कोशिकाओं के बोने की अनुमति न्यूनतम इनवेसिव तकनीक ।

Abstract

स्टेम सेल थेरेपी एक रोमांचक स्ट्रोक चिकित्सकीय के रूप में उभरा है, लेकिन इष्टतम वितरण विधि अस्पष्ट बनी हुई है । जबकि microinjection की तकनीक दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है स्ट्रोक मॉडल में स्टेम सेल देने के लिए, इस तकनीक को स्टेम कोशिकाओं में हेरफेर करने की क्षमता की कमी से पहले इंजेक्शन से सीमित है । इस पेपर विवरण स्टेम सेल डिलिवरी के लिए एक विद्युत प्रवाहकीय बहुलक पाड़ का उपयोग करने की एक विधि । स्टेम सेल एक प्रवाहकीय बहुलक पाड़ का उपयोग करने के विद्युत उत्तेजना स्टेम कोशिका कोशिका अस्तित्व में शामिल जीन बदल, भड़काऊ प्रतिक्रिया, और synaptic remodeling । विद्युत कंडीशनिंग के बाद, पाड़ पर स्टेम सेल एक बाहर मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा चूहा मॉडल में intracranially प्रत्यारोपित कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक शक्तिशाली तकनीक के लिए एक प्रवाहकीय बहुलक पाड़ के माध्यम से स्टेम सेल में हेरफेर और एक नया उपकरण बनाता है और स्टेम सेल आधारित चिकित्सा विकसित करने के लिए ।

Introduction

स्ट्रोक दुनिया में मौत का दूसरा प्रमुख कारण है और संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत का पांचवां प्रमुख कारण है । इन उच्च मृत्यु दर के बावजूद, स्ट्रोक रिकवरी के लिए उपचार वर्तमान में कोई व्यवहार्य चिकित्सा विकल्प वर्तमान में उपलब्ध1के साथ एक चुनौती रह । वर्तमान में के बारे में ३०० नैदानिक परीक्षण कोरोनरी स्ट्रोक, जिनमें से केवल ४० स्टेम कोशिकाओं का उपयोग के साथ काम कर रहे हैं । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि स्टेम सेल उपचार स्ट्रोक की मरंमत2,3पर एक लाभकारी प्रभाव है । Paracrine कारकों जैसे मस्तिष्क व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर (बीडीएनएफ) और thrombospondin-1 (THBS-1) प्रत्यारोपण मानव तंत्रिका जनक कोशिकाओं से जारी (hNPCs) में वृद्धि के साथ जुड़े तंत्र के माध्यम से बेहतर कार्यात्मक वसूली दिखाया है synapse गठन, angiogenesis, वृक्ष शाखाओं में बंटी और नए axonal अनुमानों, साथ ही प्रतिरक्षा प्रणाली4,5,6नियमन । हालांकि, स्टेम सेल के इष्टतम वितरण तरीकों मायावी रहते हैं ।

सफल मस्तिष्क को स्टेम सेल डिलीवरी एक चुनौती बनी हुई है । वर्तमान में, इंजेक्शन hydrogel और पॉलिमर मचान प्रणालियों स्टेम कोशिकाओं को वितरित करने के लिए शुरू किया गया है । इन वितरण विधियों प्रत्यारोपण के दौरान स्टेम सेल की रक्षा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हर्ष के बाद मेजबान की भड़काऊ प्रतिक्रिया और hypoxic शर्तों सहित स्ट्रोक पर्यावरण से संरक्षण की पेशकश7,8,9 , 10. हालांकि, सबसे अधिक इस्तेमाल किया सामग्री निष्क्रिय कर रहे हैं, जो लगातार मॉडुलन (यानी,11कोशिकाओं के विद्युत उत्तेजना) के उपयोग को सीमित करता है. विद्युत उत्तेजना एक क्यू कि भेदभाव को प्रभावित करता है, आयन चैनल घनत्व, और स्टेम कोशिकाओं के neurite वृद्धि12. के रूप में निष्क्रिय पॉलिमर की तुलना में, प्रवाहकीय पॉलिमर विद्युत उत्तेजना और स्टेम कोशिकाओं के हेरफेर के लिए एक वर्तमान की अनुमति ले जा सकते हैं2. हालांकि, सटीक तंत्र जो द्वारा विद्युत उत्तेजना ढा neurotrophic फैक्टर रिलीज (यानी, बीडीएनएफ और THBS-1) अभी भी पूरी तरह से पता लगाया नहीं है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक कोशिका संस्कृति एक प्रवाहकीय बहुलक पाड़, polypyrrole (PPy) से मिलकर प्रणाली का निर्माण करने के लिए कदम का वर्णन है, कि इन विट्रो विद्युत उत्तेजना के लिए अनुमति देता है । क्योंकि जिस तरह से कोशिका संस्कृति प्रणाली गढ़े में है, पेरि-infarct प्रांतस्था पर स्टेम सेल-बीज पाड़ के बाद आरोपण संभव है की है । इस प्रणाली के लिए, हम बिजली के एक कम समय अवधि के लिए पाड़ पर स्टेम कोशिकाओं आरोपण से पहले । विद्युत उत्तेजना के बाद, प्रवाहकीय बहुलक पाड़ कोशिकाओं को ले जाने सफलतापूर्वक एक ंयूनतम इनवेसिव विधि का उपयोग कर intracranially प्रत्यारोपित है ।

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Protocol

सभी स्टेम सेल और पशु प्रक्रियाओं है स्टैनफोर्ड स्टेम सेल अनुसंधान पर्यवेक्षण समिति द्वारा अनुमोदित और स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के प्रशासनिक पैनल द्वारा प्रयोगशाला पशु देखभाल पर (SCRO-६१६ और APLAC-३१९०९) थे ।

1. इतो शीशे का धंसा

  1. कांच के प्रवाहकीय पक्ष पर एक मास्किंग एजेंट रखकर इंडियम टिन ऑक्साइड (इतो)-कवर ग्लास स्लाइड तैयार करें ।
    नोट: अधिकांश वाणिज्यिक पारदर्शी टेप एक मास्किंग एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. अतिरिक्त मुखौटा एक ब्लेड का उपयोग कर निकालें, केवल अंतिम इतो डिजाइन के वांछित आकार कांच पर कवर छोड़ने ।
  2. नक़्क़ाशी समाधान तैयार करने के लिए एक धुएं के हुड के अंदर एक कांच के चोंच में HCl के 5% (v/v) नाइट्रिक एसिड और ४५% (वी/वी) का मिश्रण ।
    1. एक गर्म थाली और एक थर्मामीटर का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि नक़्क़ाशी समाधान के तापमान ७० डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है ।
  3. एक बार नक़्क़ाशी समाधान ७० डिग्री सेल्सियस तक पहुंचता है, 2 मिनट के लिए समाधान में नकाबपोश-इतो ग्लास स्लाइड जगह अतिरिक्त इतो परत को दूर करने के लिए ।
    नोट: टेप मास्किंग एसिड समाधान के लिए जोखिम से इतो परत की रक्षा करता है ।
  4. समाधान से स्लाइड निकालें और इसे कुल्ला करें (DI) H2O ।
  5. ध्यान से मुखौटा और उपाय एक मीटर का उपयोग कर प्रतिरोध को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें कि शेष इतो बरकरार है । वांछित धंसा क्षेत्र के Readouts लगभग 0 Ω होना चाहिए ।

2. Pyrrole समाधान की तैयारी

  1. एक १००० मिलीलीटर कांच की बोतल में, सोडियम dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) के ७० g को ६०० मिलीलीटर में डि एच2O में भंग कर रहा है ।
  2. एक बार NaDBS भंग कर दिया है, समाधान करने के लिए ०.२ मीटर pyrrole और DI एच2O के ३८६ मिलीलीटर की 14 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. एल्यूमीनियम पंनी और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान के साथ समाधान कवर ।

3. इतो ग्लास पर Polypyrrole के विद्युत

  1. NaDBS पूरी तरह से redissolved है जब तक कमरे के तापमान के लिए pyrrole समाधान गर्म ।
    नोट: इस बारे में 15 से 20 मिनट लगते हैं ।
  2. एक चोंच में pyrrole समाधान के 25 मिलीलीटर डालो ।
  3. एक मीटर के लिए धंसा इतो ग्लास कनेक्ट और स्लाइड pyrrole समाधान में जलमग्न ।
    1. सुनिश्चित करें कि 0 Ω प्रतिरोध के साथ पक्ष प्लैटिनम मेष संदर्भ इलेक्ट्रोड की ओर का सामना करना पड़ रहा है.
  4. एक मीटर का उपयोग कर इतो सतह पर PPy के विद्युत शुरू करने के लिए एक विद्युत वर्तमान लागू करें (वर्तमान 3 mA पर नियंत्रित/
  5. इतो गिलास को मीटर से हटा दें और अवशिष्ट surfactant को हटाने के लिए डि एच2O में electroplated-PPy धो लें ।
  6. धीरे एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर इतो गिलास से electroplated-PPy प्लेट अलग ।
    1. कमरे के तापमान पर PPy प्लेट की दुकान ।

4. Polydimethylsiloxane (PDMS) की तैयारी

  1. एक रंग और एक गरिष्ठ पकवान का प्रयोग, इलाज एजेंट के 2 जी के साथ आधार एजेंट के 18 ग्राम मिश्रण और २ १० सेमी x 8 सेमी गिलास molds में मिश्रण डालना ।
  2. 15-20 मिनट के लिए एक निर्वात चैंबर का उपयोग कर मोल्ड से बुलबुले निकालें ।
  3. 3 एच के लिए एक ७० डिग्री सेल्सियस ओवन में मोल्ड प्लेस ।
  4. एक बार ठंडा होने पर, PDMS को मोल्ड्स से निकालने के लिए एक चपटे रंग का इस्तेमाल करें ।

5. इन विट्रो विद्युत उत्तेजना चैंबर का निर्माण

  1. आटोक्लेव धातु प्लेटें (WxL, २.५ cm x १२.५ cm) और 1 घंटे के लिए १२० ° c पर वाल्व प्रवाहित करें ।
  2. टेम्पलेट के रूप में एक कक्ष स्लाइड का उपयोग करते हुए, PDMS के दो टुकड़े काटें ।
    नोट: PDMS का एक टुकड़ा सेल चैंबर के भीतर से दो आसपास के चौकों के कटआउट के साथ सेल चैंबर की परिधि के रूप में कार्य करता है । अंय PDMS टुकड़ा है चैंबर परिधि की एक रूपरेखा है ।
    1. अंदर सेल कक्ष बाहर कट इतना है कि यह वर्ग के आकार का है और सेल चैंबर के आकार से मेल खाता है । सुनिश्चित करें कि PDMS के दोनों टुकड़ों का समग्र आकार आयताकार है और चैंबर स्लाइड के मैच ।
  3. नीचे से ऊपर तक निंनलिखित के रूप में सामग्री परत: (1) धातु की थाली, (2) PDMS (कटआउट के बिना), (3) PPy प्लेट (सीधा PDMS करने के लिए), (4) PDMS (कटआउट के साथ), और (5) सेल चैंबर ।  
  4. तंत्र को एक साथ दबाना एक बार यह पूरी तरह से गठबंधन है ।
  5. कट २ ६० cm एक धातु के तार के टुकड़े और चांदी पेस्ट का उपयोग करने के लिए PPy प्लेट के प्रत्येक छोर कि चैंबर के बाहर से बहर एक तार देते हैं । सुनिश्चित करें कि तार काफी लंबे समय से एक मशीन के बाहर करने के लिए उपकरण से विस्तार कर रहे हैं ।
  6. एक बार चांदी पेस्ट ठीक है, मजबूत और epoxy के साथ तार कनेक्शन सील ।
    1. रिकॉर्ड एक मीटर का उपयोग कर सुनिश्चित करें कि लागू क्षेत्र प्रत्येक कक्ष में एक ही है बनाने के लिए प्रतिरोध ।
    2. आरोपण के लिए, तारों को हटा दें; कक्ष कक्षों और PDMS unclamp और फिर उंहें प्रवाहकीय पाड़ से अलग है । प्रत्यारोपित मचानों का आयाम लगभग 1 मिमी x 3 मिमी x ०.२५ मिमी है ।

6. PPy पर मानव तंत्रिका जनक कोशिकाओं (hNPCs) चढ़ाना

  1. 2 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के तहत इकट्ठे कक्षों निष्फल ।
    1. 1 घंटे के बाद, इकट्ठे कक्षों को ९० ° घुमाएं ।
  2. नसबंदी के बाद, कोट एक कोटिंग सब्सट्रेट के ८०० µ एल के साथ चैंबर के तल पर PPy की सतह और के लिए एक मशीन में PPy थाली पर जमना करने के लिए अनुमति देने के लिए ३७ ° c पर 5% CO 1 h.2
  3. 1 घंटे के बाद, कक्षों से supernatant निकालें और अच्छी तरह से DPBS + Ca के 1 मिलीलीटर + मिलीग्राम के साथ धीरे कुल्ला ।
    नोट: इस कोटिंग सब्सट्रेट की टुकड़ी का कारण होगा के रूप में जबरदस्ती PPy की सतह धोने से बचें.
  4. ताजा सेल मीडिया का प्रयोग, यांत्रिक अलग कर देना कोमल pipetting के साथ एक ऊतक संस्कृति की थाली से कक्षों के साथ प्रयोग के लिए प्रसंस्कृत कोशिकाओं ।
    नोट: सेल ९०-१००% पृथक्करण पर धाराप्रवाह होना चाहिए ।
  5. hNPC 5 मिनट के लिए ८००० x g पर केंद्रापसारक का उपयोग कर छर्रों ले लीजिए ।
  6. किसी hemocytometer का उपयोग करना, १००,००० कक्षों/cm2के किसी वॉल्यूम पर कक्षों को गिनना और पुनर्स्थगित करना ।
  7. प्लेट १००,००० कोशिकाओं को प्रत्येक कक्ष में अच्छी तरह से (१००,००० कोशिकाओं/
  8. 5% CO 2 में ३७ ° c पर चैम्बर्स के लिए लौटें।

7. hNPCs की विद्युत उत्तेजना

  1. कक्षों पर कोशिकाओं बोने के बाद एक दिन, एक तरंग जनरेटर का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को विद्युत उत्तेजना लागू होते हैं ।
  2. उत्तेजना से पहले, प्रत्येक चैंबर से पुराने मीडिया को अच्छी तरह से हटाने और ताजा मीडिया के ८०० µ एल के साथ भरने ।
  3. मीडिया के बाद बदल गया है, कक्ष मशीन में वापस जगह है, तारों की मशीन से बाहर का विस्तार, और एक तरंग जनरेटर के लिए उन्हें देते हैं
  4. 1 एच के लिए १०० हर्ट्ज के साथ ± ४०० एमवी में एक वर्ग तरंग संकेत के साथ कोशिकाओं को उत्तेजना लागू करें ।
  5. उत्तेजना के बाद, तारों को हटाने और एक मशीन में एक और दिन के लिए मंडलों मशीन 5% सह के साथ ३७ ° c पर सेट2।
  6. निर्माता के प्रोटोकॉल का अनुसरण करने वाले सेल व्यवहार्यता और मात्रात्मक रीयल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT-पीसीआर) सहित बाद में जैविक विश्लेषण करें ।

8. Vivo में PPy आरोपण

  1. बाहर मध्य मस्तिष्क धमनी (dMCA) टी कोशिका की कमी वयस्क पुरुष नग्न चूहों (NIH-्नू २३० ± 30 जी) पर रोड़ा स्ट्रोक मॉडल के रूप में पहले2वर्णित प्रदर्शन । एक सप्ताह के बाद dMCA रोड़ा आरोपण प्रदर्शन ।
  2. एक दिन पहले सर्जरी करने के लिए, अपने पिंजरे के पानी में चूहों को एम्पीसिलीन (1 मिलीग्राम/एमएल) दे ।
  3. Anesthetize एक प्रेरण कक्ष में चूहे का उपयोग कर ०.५-3% मिलीग्राम/isoflurane के द्वारा प्रशासित सांस लेना ।
  4. पैर की अंगुली चुटकी पलटा प्रतिक्रिया की कमी से चूहे की anesthetization की पुष्टि करें ।
    1. जबकि पशु संज्ञाहरण के तहत है, अपनी झिल्ली का रंग, श्वास पैटर्न, और मलाशय तापमान हर 15 मिनट की निगरानी करने के लिए जारी है ।
  5. एक बार anesthetization की पुष्टि की है, सूखापन को रोकने के लिए चूहे की आंखों पर कृत्रिम आँसू लागू होते हैं ।
  6. सुनिश्चित करें कि अपूतित तकनीक बाँझ दस्ताने का उपयोग करके इस प्रक्रिया के दौरान बनाए रखा है, और एक बाँझ सर्जिकल कपड़े13. एक बाँझ क्षेत्र के भीतर बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों रखें.
  7. जबकि चूहा संज्ञाहरण के तहत है, बाईं प्रांतस्था के ऊपर एक craniectomy ड्रिल । बाडी खोलें ।
    1. एक माइक्रो पतली शल्य चिकित्सा सुई का उपयोग कर मस्तिष्क से बाडी मेटर निकालें ।
  8. में इन विट्रो प्रणाली से प्रवाहकीय पाड़ों प्रत्यारोपण पर चूहे प्रांतस्था ।
    नोट: हमारे प्रयोगों के लिए, हम hNPC चढ़ाना के बाद इन विट्रो 3 दिन में से मचान प्रत्यारोपित ।
    1. मुख्य रूप से स्ट्रोक घावों के लिए औसत दर्जे का penumbral प्रांतस्था पर प्रत्यारोपण रखें ।
  9. के बाद पाड़ रखा है, प्रत्यारोपण पर जगह surgicel त्वचा बंद करने के साथ आंदोलन को रोकने के लिए ।
  10. टांका घाव बंद और चमड़े के साथ चूहों सुई buprenorphine SR के साथ एक खुराक में 1 मिलीग्राम/kg stereotaxic सर्जरी और dMCA रोड़ा के साथ जुड़े दर्द का प्रबंधन करने के लिए.
  11. एक वसूली पिंजरे में चूहे प्लेस के रूप में यह चेतना को पुनः प्राप्त ।
    1. कभी पशु उपेक्षित छोड़ देते हैं, जबकि वह बेहोश है ।
    2. यह पूरी तरह से चेतना प्राप्त की है जब तक जानवर दूसरों के साथ जगह नहीं है ।
  12. शरीर के वजन में कमी सहित दर्द के लक्षण के लिए दैनिक जानवरों की निगरानी, कम भोजन/पानी का सेवन, कमी ग्रूमिंग/मैला कोट, घटी हुई/सहज गतिविधि, असामान्य मुद्रा, निर्जलीकरण/त्वचा टेंट, धंसा आंखें, छुपा, स्व-विकृति, तेजी से श्वास, खुले मुंह श्वास, हिल, कांप, कंपन, और वोकलिज़ेशन ।
    1. जानवरों की निगरानी दैनिक जब तक यह प्रतीत होता है कि वे खा रहे हैं, पीने, सौंदर्य, और वजन बढ़ने; और फिर साप्ताहिक वजन के बाद ।
  13. सीओ2 साँस लेना और euthanization के एक माध्यमिक पुष्टि के माध्यम से जल्दी euthanization (के रूप में पशु सामान्य ऑक्सीजन की आपूर्ति के बाद सह2 साँस लेना नहीं होगा पुनर्जीवित करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए) किसी भी जानवर है कि प्रतीत होता है खाने के लिए हो जाएगा, पीने और प्रारंभिक शल्य प्रक्रिया के बाद वजन बढ़ने; दर्द में प्रकट होता है; या एक से अधिक अपेक्षित मोटर प्रांतस्था घाटे के कारण व्यवहार परीक्षणों को पूरा करने में असमर्थ प्रतीत होता है ।

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Representative Results

योजनाबद्ध चित्रा 1 में दिखाया hNPCs और संभावित बहाव अनुप्रयोगों के विद्युत उत्तेजना के समग्र कार्यप्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है. स्टेम सेल थेरेपी में एक मौजूदा सीमा है कि स्टेम कोशिकाओं को एक कठोर बाद सूजन और कोरोनरी स्थितियों सहित प्रत्यारोपण पर्यावरण के संपर्क में हैं । इन कठिन परिस्थितियों की संभावना उनके चिकित्सीय प्रभावकारिता14,15की सीमा । एक प्रवाहकीय पाड़ का उपयोग इस वातावरण से hNPCs की रक्षा के लिए बिजली की कंडीशनिंग के माध्यम से hNPCs चिकित्सकीय लाभ में वृद्धि हो सकती है । इस स्टेम सेल डिलिवरी तकनीक में पहला कदम एक प्रवाहकीय विद्युत दृष्टिकोण2,16का उपयोग कर पाड़ के विकास है । हम पाड़ों और hNPCs के साथ बिजली के जीर्णोद्वार विशेषताओं को अनुकूलित किया है । नियंत्रण एक ऊतक संस्कृति की थाली पर हो उत्तेजित स्टेम कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया ।

विभिंन वोल्टेज के लिए बिजली की उत्तेजना की सुरक्षा निर्धारित करने के लिए और पूर्व शर्त प्रभावकारिता को अधिकतम मूल्यांकन किया गया । यह सुनिश्चित करने के लिए कि लागू क्षेत्र प्रत्येक कक्ष में एक ही है, इकट्ठे चैंबर के प्रतिरोधकता एक मीटर का उपयोग कर मापा गया था (Resistances (ओम, Ω) चैंबर के लगभग थे 10 kΩ, और प्रतिरोधकता ≈ 3 Ωm). वाणिज्यिक विक्रेता के अनुसार, इस्तेमाल किया hNPCs सामांय संस्कृति प्रणालियों में कोई महत्वपूर्ण cytotoxicity दिखाया है । hNPCs के साथ या बिजली उत्तेजना के लिए जोखिम के बिना सेल व्यवहार्यता परख के साथ दाग थे (Live: ग्रीन; मृत: लाल) (चित्र 2) । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि hNPCs विद्युत उत्तेजना के बाद व्यवहार्य थे (± ४०० mV, १०० हर्ट्ज के लिए 1 ज). के लिए सेल व्यवहार्यता परख मांय, हम सेल व्यवहार्यता एक resazurin परख का उपयोग परीक्षण किया । परिणाम भी hNPCs पर विद्युत उत्तेजना का कोई महत्वपूर्ण cytotoxicity का प्रदर्शन ।

हमारे पिछले vivo में डेटा का प्रदर्शन किया है कि paracrine कारकों hNPCs से जारी (SD56, NPCs भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पंन) एक जोखिम के साथ विद्युत उत्तेजना के बाद वसूली में सुधार स्ट्रोक2। आगे उंमीदवार का पता लगाने के लिए स्ट्रोक वसूली में महत्वपूर्ण है कि hNPC (Aruna बायोमेडिकल, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पंन NPCs), बीडीएनएफ और THBS-1 से जारी कर रहे है मूल्यांकन किया गया में जाना जाता है । इन कारकों का व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है और न्यूरॉन में अपनी भूमिका की वृद्धि में सेल के लिए सेल में सहभागिता17,18. बीडीएनएफ और THBS-1 के लिए transcriptome परिवर्तन पर विद्युत उत्तेजना की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए, qRT-पीसीआर बीडीएनएफ और THBS के साथ एक गृह व्यवस्था जीन के रूप में GAPDH-1 जीन सहित प्रदर्शन किया गया था । कुल आरएनए के लगभग 1 µ जी रिवर्स-सीडीएनए में निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार लिखित था । सामान्यीकृत गुना-परिवर्तन अनुपात ΔΔCt विधि द्वारा PPy और hNPCs पर hNPCs में जीन अभिव्यक्ति की तुलना PPy पर विद्युत उत्तेजना के लिए एक जोखिम के साथ की गणना की गई । सांख्यिकीय विश्लेषण बीडीएनएफ और THBS के जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण नियमों को दिखाया-समूहों के बीच 1 कि बिजली के आश्रित उत्तेजना थे (पी ≤ ०.०१) (चित्रा 3) । इस डेटा का सुझाव है कि अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु के बिना hNPC प्रभावकारिता अधिकतम संभव है ।

Figure 1
चित्र 1 . इन विट्रो विद्युत उत्तेजना के लिए प्रवाहकीय बहुलक पाड़ प्रणाली । (क) PPy प्लेट के ऊपर एक स्लाइड चैम्बर रखा गया है । (ख) योजनाबद्ध PPy की सतह पर चढ़ाया hNPCs के साथ इन विट्रो विद्युत उत्तेजना चैम्बर के निर्माण से पता चलता है. प्रवाह वाल्व स्लाइड चैंबर, PDMS, PPy, और धातु की थाली एक साथ पकड़ करने के लिए उपयोग किया जाता है । (ग) चैंबर की छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . के साथ या विद्युत उत्तेजना के बिना hNPCs में सेल व्यवहार्यता परख । (एक) बार ग्राफ लाइव सेल का प्रदर्शन Calcein के साथ दाग-हूं । प्रस्तुत डाटा मतलब ± S.D. हैं; n = 4. (ख) कोशिका व्यवहार्यता परख resazurin का उपयोग कर । बार ग्राफ से पता चलता है वहां hNPCs पर विद्युत उत्तेजना का कोई cytotoxicity था; n = 4. (ग) सेल व्यवहार्यता परख के पहले और बाद में विद्युत उत्तेजना उपचार के चित्र । ग्रीन सिग्नल जीवित कोशिकाओं (Calcein-am) इंगित करता है, जबकि लाल संकेत मृत कोशिकाओं (EtHD-1) इंगित करता है । ES विद्युत उत्तेजना इंगित करता है । ES + या-कोशिकाओं पर उपस्थिति या बिजली की उत्तेजना के अभाव को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . जीन अभिव्यक्ति बिजली की उत्तेजना के साथ बदल जाता है । बार ग्राफ बीडीएनएफ के जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का प्रदर्शन (क) और THBS1 (ख) hNPCs में (* * इंगित करता है सांख्यिकीय के बीच महत्वपूर्ण विद्युत से अधिक है और अंय सभी समूहों, p < 0.01, त्रुटि पट्टियां दिखाएं S.D.; n = 4, एक-तरफ़ा ANOVA ). नकारात्मक नियंत्रण जहां कोशिकाओं एक नियमित रूप से ऊतक संस्कृति की थाली पर संस्कृति थे इंगित करता है । ES + या-कोशिकाओं पर उपस्थिति या बिजली की उत्तेजना के अभाव को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

बढ़ते सबूत एक उपंयास स्ट्रोक थेरेपी के रूप में स्टेम सेल के वादे का प्रदर्शन किया है । यह वादा करने के लिए एक प्रमुख के साथ बेडसाइड को स्टेम सेल चिकित्सकीय अग्रिम प्रयास में हुई है कम से ४० चल रहे या पूर्ण नैदानिक परीक्षण । स्ट्रोक पैथोलॉजी एक अनूठा स्नायविक विकार है कि खुद को बख्शी कोशिका चिकित्सा स्टेम क्योंकि तीव्र अपमान के बाद, वहां कोई neurodegenerative प्रक्रिया वसूली को रोकने है प्रदान करता है । स्टेम सेल के सटीक तंत्र-बढ़ाया स्ट्रोक वसूली अस्पष्ट बनी हुई है । Angiogenesis, synaptogenesis, और synaptic remodeling सभी के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है । जब बीडीएनएफ और THBS-1 जैसे synapse गठन के लिए महत्वपूर्ण अणुओं को हटा दिया जाता है, स्ट्रोक वसूली6,19बिगड़ा हुआ है । hNPCs कई पशु मॉडल20,21में स्ट्रोक के बाद कार्यात्मक वसूली में सुधार हुआ है । hNPCs प्रभाव का तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं रहता है, और इन कोशिकाओं के लिए आदर्श वितरण पद्धति अज्ञात है । एक प्रणाली है कि एक महत्वपूर्ण hNPCs से जारी अणुओं में हेरफेर करने की अनुमति देता है विकसित करके, एक अभिंन वसूली तंत्र को अलग और अनुकूलन स्टेम सेल थेरेपी में मदद कर सकते हैं ।

मस्तिष्क को सफल कोशिका प्रसव एक चुनौती बनी हुई है. वर्तमान में, प्रौद्योगिकियों के एक नंबर के लिए स्टेम सेल9,10के अस्तित्व और एकीकरण में सुधार करने के लिए स्तंभ कोशिकाओं को वितरित करने के लिए विभिन्न सामग्री मचान प्रणालियों का उपयोग कर विकसित किया गया है । हालांकि, इन सामग्रियों के निष्क्रिय विशेषताओं के कारण, यह उनके प्रत्यारोपण के बाद स्टेम कोशिकाओं को मिलाना मुश्किल है ।

यह लेख एक PPy पाड़ का उपयोग कर एक विधि का वर्णन करने के लिए बिजली के रूप में hNPCs के transcriptome हेरफेर बीडीएनएफ और THBS के ऊपर से दिखाया-हमारे qRT-पीसीआर डेटा में 1 । हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि hNPCs पर VEGFA अभिव्यक्ति में वृद्धि के बाद विद्युत उत्तेजना में सुधार कार्यात्मक वसूली स्ट्रोक के बाद2। यहाँ हम प्रदर्शित करते हैं कि अतिरिक्त neurotrophic कारकों जैसे बीडीएनएफ और THBS-1 भी एक अलग hNPC सेल लाइन में बिजली की उत्तेजना के लिए जोखिम के बाद संग्राहक रहे हैं, दिखा रहा है कि हमारे सिस्टम कई सेल लाइनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।

के निर्माण के दौरान इन विट्रो विद्युत उत्तेजना चैंबर में , यह महत्वपूर्ण है कि धातु के तार पूरी तरह से PPy प्लेट सिल्वर पेंट और epoxy का उपयोग करने के लिए जुड़ा हुआ है । यह कनेक्शन ध्वनि नहीं है, तो यह भी एक ही पैरामीटर के साथ बिजली के क्षेत्रों बदलती कारण होता है । इसके अलावा, टाइंस मीडिया मचान प्रणाली के विधानसभा के बाद रिसाव हो सकता है । इस समस्या को हल करने के लिए, वैक्यूम चर्बी PDMS और PPy प्लेट के बीच की जगह सील करने के लिए लागू किया जा सकता है देखभाल के साथ कोशिका बोने की सतह के लिए लागू नहीं है । एक PPy प्लेट की गैर पारदर्शी प्रकृति के कारण सीमा है कि मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ ' कोशिकाओं को प्रभावित करने की जांच सीमित है ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि का लाभ कोशिकाओं के यंत्रवत परिवर्तन निर्धारित करने में मदद करने के लिए hNPCs के मॉडुलन के लिए अनुमति देता है. वर्तमान में, विद्युत मॉडुलन पारंपरिक hydrogel या निष्क्रिय मचान प्रणालियों का उपयोग कर नहीं किया गया है. विद्युत PPy पाड़ का उपयोग उत्तेजना के बाद, hNPCs बहुलक सतह से हटाने के बिना एक vivo में मॉडल को दिया जा सकता है । स्टेम सेल अनुप्रयोगों के आगे अध्ययन रोग मॉडल के लिए तरीकों का विकास हमें बेहतर अनुवाद अनुप्रयोगों डिजाइन करने के लिए अनुमति देता है । विद्युत कंडीशनिंग दृष्टिकोण, प्रवाहकीय बहुलक प्रणाली द्वारा संभव बनाया, विभिंन प्रकार के सेल के लिए लागू किया जा सकता है और एक सेल पर बिजली की उत्तेजना के प्रभाव की बेहतर समझ के लिए अनुमति देता है । इन विट्रो में कोशिकाओं का अनुकूलन करने की क्षमता और फिर आगे हेरफेर के बिना (जैसे passaging या हटाने) इन विट्रो में स्ट्रोक के रूप में vivo रोग राज्यों में जोड़तोड़ के परीक्षण के लिए अनुमति देता है । अंतिम उद्देश्य ऐसी वर्णित प्रवाहकीय बहुलक पाड़ के रूप में नई तकनीक, का उपयोग करने के लिए स्ट्रोक चिकित्सकीय अग्रिम और स्ट्रोक वसूली तंत्र की समझ में सुधार करने के लिए है ।

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Disclosures

लेखकों को इस काम के साथ घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

qRT-पीसीआर मशीन के इस्तेमाल के लिए हम डॉ कत् Andreasson (न्यूरोलॉजी और न्यूरोलॉजिकल साइंस डिपार्टमेंट, स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी) का शुक्रिया अदा करते हैं । काम स्वास्थ्य अनुदान K08NS098876 (P.M.G.) और स्टैनफोर्ड स्कूल ऑफ मेडिसिन डीन Postdoctoral फैलोशिप (शास) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FGF-Basic Invitrogen CTP0261 20 ng/mL for working media
Matrigel Corning cb40234a 1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) EMD Millipore LIF1010 10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg Fisherbrand NC0162601
Hydrochloric acid Fisherbrand SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical Fisherbrand SA95
ITO Glass Delta Technologies CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate Sigma 289957-1KG
Pyrrole Sigma 131709-500ML Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers Thermo Sci Nuc  125658 Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1" McMaster-Carr  1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G Electron Microscopy Sciences  1264214 Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red Genesse  25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit Aruna Biomedical  ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit Aruna Biomedical   hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD McMaster-Carr  5330K22
Multimeter Keysight  E3641A
Wavefoam generator Keysight 33210A-10MHz
Pt meshes Sigma-Aldrich  298107-425MG Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fisher Scientific  L3224
BDNF Thermo Fisher Scientific  Hs02718934_s1
THBS1 Thermo Fisher Scientific  Hs00962908_m1
GAPDH Thermo Fisher Scientific  Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250) Qiagen 74106
QIAshredder (250) Qiagen 79656
RNase-Free DNase Set (50) QIAGEN 79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns BIORAD 1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermo Fisher Scientific  4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture eSutures.com 683G
Isoflurane Henry Schein 29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System VetEquip 901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat Ethicon 1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat Stoelting 51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves Fisherbrand 19-063-130
Sterile Drape Medline DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades Fisherbrand 53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300 Fisherbrand 17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4484642
Frazier Micro Dissecting Hook Harvard Apparatus 52-2706

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References

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इंजीनियरिंग अंक १३४ Pyrrole विद्युत उत्तेजना तंत्रिका जनक सेल प्रवाहकीय बहुलक स्ट्रोक स्टेम सेल
विद्युत प्रवाहकीय पाड़ को मिलाना और स्टेम सेल देने के लिए
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Oh, B., Levinson, A., Lam, V., Song, S., George, P. Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells. J. Vis. Exp. (134), e57367, doi:10.3791/57367 (2018).

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