Summary
Ce protocole décrit la fabrication d’un système de culture cellulaire pour permettre à l’ensemencement des cellules souches sur un échafaudage de polymère conducteur pour in vitro la stimulation électrique et subséquent en vivo l’implantation de l’échafaudage graines cellules souches en utilisant un technique mini-invasive.
Abstract
Thérapie de cellules souches a émergé comme une course passionnante thérapeutique, mais la méthode de livraison optimale reste floue. Alors que la technique de microinjection a été utilisée pendant des décennies pour fournir des cellules souches dans des modèles de course, cette technique est limitée par le manque de capacité à manipuler les cellules souches avant l’injection. Ce livre présente en détail une méthode d’utilisation d’un échafaudage de polymère conductrice pour la livraison de cellules souches. La stimulation électrique des cellules souches à l’aide d’un échafaudage de polymère conducteur modifie les gènes de la cellule souches impliquées dans la survie cellulaire, réponse inflammatoire et remodelage synaptique. Après préconditionnement électrique, les cellules souches sur l’échafaud sont transplantés de données dans un modèle de rat occlusion distale artère cérébrale moyenne. Ce protocole décrit une technique puissante pour manipuler des cellules souches par un échafaudage de polymère conducteur et crée un nouvel outil pour développer la thérapie axée sur les cellules souches.
Introduction
L’AVC est la deuxième cause de décès dans le monde et la cinquième cause de décès aux États-Unis. Malgré ces taux de mortalité élevé, les traitements pour la récupération de l’AVC restent actuellement un défi avec aucune des options viables médicaux actuellement disponible1. On compte actuellement environ 300 essais cliniques traitant des accidents vasculaires cérébraux ischémiques, dont 40 seulement utiliser les cellules souches. Des études antérieures ont montré que les cellules souches ont un effet bénéfique sur AVC réparation2,3. Facteurs paracrines comme facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et la thrombospondine-1 (INCULPER-1) libérés par les cellules progénitrices neurales humaines transplantées (hNPCs) ont montré amélioré la récupération fonctionnelle par le biais de mécanismes associés à une augmentation Synapse formation, angiogenèse, ramifications dendritiques et nouvelles projections axonales, ainsi que moduler le système immunitaire4,5,6. Cependant, les méthodes de livraison optimal des cellules souches demeurent insaisissables.
Livraison réussie des cellules souches au cerveau reste un défi. Actuellement, hydrogel injectable et systèmes d’échafaudage polymères ont été introduites pour fournir des cellules souches. Ces méthodes de livraison protègent les cellules souches au cours de la transplantation ainsi qu’offrent une protection contre l’environnement hostile de post-accident vasculaire cérébral dont la réponse inflammatoire de l’hôte et des conditions d’hypoxie7,8,9 , 10. Cependant, les matériaux couramment utilisés sont inertes, qui limite l’utilisation de la modulation continue (c.-à-d., stimulation électrique) des cellules11. La stimulation électrique est une piste qui influe sur la différenciation, densité de canaux d’ion et la croissance des neurites des cellules souches12. Par rapport aux polymères inertes, les polymères conducteurs peuvent transporter un courant permettant la stimulation électrique et la manipulation des cellules souches2. Toutefois, le mécanisme précis par lequel la stimulation électrique module libération du facteur neurotrophique (c.-à-d. BDNF et INCULPER-1) n’est pas encore complètement exploré.
Dans ce protocole, nous décrivons les étapes pour construire un système de culture cellulaire, constitué d’un échafaudage de polymère conducteur, polypyrrole (PPy), qui permet pour in vitro la stimulation électrique. En raison de la manière dont le système de culture cellulaire est fabriqué, implantation ultérieure de l’échafaudage de cellules souches semées sur le cortex péri-infarctus est possible. Pour ce système, nous préconditionner électriquement des cellules souches sur l’échafaud pour un court laps de temps avant l’implantation. Après une stimulation électrique, l’échafaud de polymère conducteur transportant les cellules est correctement implanté données à l’aide d’une méthode peu invasive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures d’animaux et de cellules souches ont été approuvées par le Comité de surveillance de recherche de cellules souches de Stanford et de la Commission Administrative de l’Université de Stanford sur Laboratory Animal Care (SCRO-616 et APLAC-31909).
1. la gravure du verre ITO
- Préparer l’indium tin oxyde (ITO)-lame de verre couverte en plaçant un agent masquant sur le côté conducteur de la vitre.
NOTE : Les bandes transparentes plus commerciales peuvent servir comme un agent masquant.- Retirez le masque excès à l’aide d’une lame, laissant seulement la forme désirée de la conception finale de ITO couvert sur le verre.
- Mélanger 5 % (v/v) d’acide nitrique et de 45 % (v/v) de HCl dans un bécher de verre à l’intérieur d’une hotte aspirante pour préparer la solution de décapage.
- Utiliser une plaque chauffante et un thermomètre pour s’assurer que la température de la solution de gravure est à 70 ° C.
- Une fois que la solution de décapage atteint 70 ° C, placer la diapositive masquée-ITO verre dans la solution pendant 2 minutes pour enlever la couche d’ITO excédentaire.
NOTE : Masquage ruban protège la couche d’ITO de l’exposition à une solution d’acide. - Retirer la lame de la solution et rincer avec désionisée (DI) H2O.
- Retirer délicatement la résistance masque et mesure à l’aide d’un multimètre pour s’assurer que l’OTI restant est intact. Affichage de la zone décapée souhaitée devrait être environ 0 Ω.
2. préparation de la Solution de Pyrrole
- Dans une bouteille en verre 1000 mL, dissoudre 70 g de sodium dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) dans 600 mL de DI H2O.
- Une fois que le NaDBS est dissous, ajoutez 14 mL de 0,2 M pyrrole et 386 mL de DI H2O à la solution.
- Couvrir la solution avec du papier aluminium et conserver à 4 ° C.
3. dépôt électrolytique de Polypyrrole sur verre ITO
- Chauffer la solution de pyrrole à température ambiante jusqu'à ce que NaDBS est redissous entièrement.
Remarque : Cela prend environ 15 à 20 minutes. - Verser 25 mL de la solution de pyrrole dans un bécher.
- Connectez le verre dépoli de ITO à un multimètre et plonger la lame dans la solution de pyrrole.
- Faire en sorte que le 0 résistance Ω fait face vers l’électrode de référence de platine maille.
- Appliquer un courant électrique pour ouvrir la galvanoplastie de PPy sur la surface de ITO à l’aide d’un multimètre (courant contrôlé à 3 mA/cm2 pour 4 heures).
- Retirez le verre ITO le multimètre et laver plaqué-PPy DI H2O pour supprimer l’agent tensio-actif résiduel.
- Doucement, retirer la plaque plaqué-PPy diagonalement ITO à l’aide d’une lame de rasoir.
- Stocker la plaque PPy à température ambiante.
4. préparation du polydiméthylsiloxane (PDMS)
- À l’aide d’une spatule et un plat de peser, mélanger 18 g d’agent de base avec 2 g de salaison et versez le mélange dans des moules de verre deux 10 x 8 cm.
- Retirer les bulles de moules à l’aide d’une chambre à vide pendant 15-20 minutes.
- Placer les moules dans un four à 70 ° C pendant 3 h.
- Une fois refroidi, utilisez une spatule plate pour retirer le PDMS les moules.
5. fabrication de la chambre de Stimulation électrique In Vitro
- Autoclave, les plaques de métal (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) et débit vannes à 120 ° C pendant 1 heure.
- À l’aide d’une diapositive de chambre comme gabarit, couper deux morceaux de PDMS.
NOTE : Une seule pièce de PDMS sert le périmètre de la chambre de cellules avec des découpes de deux carrés contigus au sein de la chambre de la cellule. L’autre morceau PDMS est un plan du périmètre de la chambre.- Couper l’intérieur chambre de cellule afin qu’elle soit carrée en forme et correspond à la forme de la chambre de la cellule. Veiller à ce que la forme globale des deux pièces du PDMS est rectangulaire et correspond à celui de la diapositive de la chambre.
- Les matériaux de couche comme suivant de bas en haut : (1) Plaquemétallique, PDMS (2) (sans découpes), (3) PPy plaque (perpendiculaire au PDMS), (4) le PDMS (découpes) et chambre de cellules (5).
- Fixer l’appareil ensemble une fois qu’il est parfaitement aligné.
- Coupez deux morceaux de 60 cm d’un fil métallique et pâte d’argent permet d’attacher un fil à chaque extrémité de la plaque de PPy qui fait saillie à l’extérieur de la chambre. Veiller à ce que les fils sont assez longs pour s’étendre de l’appareil à l’extérieur d’un incubateur.
- Une fois que la pâte d’argent est guérie, renforcer et rendre étanche la liaison métallique avec revêtement époxy.
- Enregistrer la résistance à l’aide d’un multimètre pour s’assurer que le champ appliqué est le même dans chaque chambre.
- Pour l’implantation, enlever les fils ; les chambres de la cellule de desserrage et PDMS, puis les séparent de l’échafaud conductrice. La dimension des échafaudages implantés est environ 1 x 3 x 0,25 mm.
6. placage humain cellules progénitrices neurales (hNPCs) sur PPy
- Stériliser les chambres assemblés sous la lumière UV pendant 2 heures.
- Après 1 heure, faire pivoter l’assemblage chambres de 90°.
- Après stérilisation, recouvrir la surface de PPy au fond de la chambre avec 800 µL d’un substrat de revêtement et laisser le substrat se solidifier sur la plaque de PPy dans un incubateur à 37 ° C à 5 % de CO2 pendant 1 h.
- Après une heure, retirer le surnageant de chambers et rincer doucement avec 1 mL de SPD + Ca + Mg / puits.
Remarque : Évitez de laver la surface du PPy avec force, car cela provoquerait le détachement du substrat enduit. - À l’aide de milieux cellulaires fraîches, mécaniquement se dissocient les cellules cultivées pour une utilisation avec les chambres d’une plaque de culture tissulaire avec douceur de pipetage.
Remarque : Les cellules doivent être anastomosé de 90-100 % à la dissociation. - Recueillir des granulés hNPC par centrifugation à 8000 x g pendant 5 minutes.
- Utilisant un hémocytomètre, compter et remettre en suspension les cellules à un volume de 100 000 cellules/cm2.
- Plaque de 100 000 cellules dans chaque chambre bien (100 000 cellules/cm2 dans 1 mL de médias).
- Retour des chambres dans l’incubateur à 37 ° C à 5 % de CO2.
7. électrostimulation de hNPCs
- Un jour après l’ensemencement les cellules dans les chambres, utilisez un générateur de signaux pour appliquer une stimulation électrique aux cellules.
- Avant la stimulation, supprimer les anciens médias dans chaque chambre de bien et de reconstituer avec 800 µL de supports neufs.
- Après changement de médias, replacez les chambres dans l’incubateur, étendre les fils hors de l’incubateur et les attacher à un générateur de signaux
- Appliquer la stimulation aux cellules avec un signal carré à ±400 mV avec 100 Hz pendant 1 h.
- Après la stimulation, enlever les fils et incuber les chambres pour un autre jour dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
- Effectuer des analyses biologiques ultérieures dont la viabilité cellulaire et quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) suivant le protocole du fabricant.
8. in Vivo PPy Implantation
- Effectuer des modèles de temps de l’occlusion distale artère cérébrale moyenne (dMCA) sur des lymphocytes T-deficient rats nus mâles adultes (NIH-RNU 230 ± 30 g) comme décrit précédemment2. Effectuer l’occlusion implantation une semaine post-dMCA.
- Un jour avant l’opération, donner ampicilline (1 mg/mL) pour les rats dans l’eau de leur cage.
- Anesthésier le rat dans une chambre d’induction à l’aide 0.5 - 3 % mg/kg d’isoflurane administré par inhalation.
- Confirmer anesthetization du rat par l’absence de réaction réflexe de la toe pincée.
- Alors que l’animal est sous anesthésie, continuer à suivre sa membrane couleur, mode de respiration et la température rectale toutes les 15 minutes.
- Une fois qu’anesthetization est confirmée, appliquer des larmes artificielles sur les yeux du rat pour prévenir le dessèchement.
- S’assurer qu’une technique aseptique est maintenue au cours de cette procédure en utilisant des gants stériles et un drapé chirurgical stérile13. Garder les instruments chirurgicaux stériles dans un champ stérile.
- Bien que le rat soit sous anesthésie, percer une craniectomie au-dessus du cortex gauche. Ouverture de la dure-mère.
- Retirez la dure-mère du cerveau à l’aide d’une aiguille mince chirurgicale.
- Les échafaudages conductrices du système in vitro sur le cortex de rat de l’implant.
NOTE : Pour nos expériences, nous avons implanté échafaudages de in vitro lendemain 3 hNPC placage.- Placer l’implant principalement sur la pénombre cortex médial à la lésion de l’accident vasculaire cérébral.
- Après que l’échafaudage est placé, placez hémostatique sur l’implant pour empêcher tout mouvement de fermeture de la peau.
- Suture de la plaie fermée et injecter par voie sous-cutanée les rats avec buprénorphine SR à la dose de 1 mg/kg pour gérer la douleur associée à la chirurgie stéréotaxique et occlusion de la dMCA.
- Placez le rat dans une cage de récupération car il reprend conscience.
- Ne jamais laisser l’animal sans surveillance alors qu’il est inconscient.
- Ne pas placer l’animal avec les autres jusqu'à ce qu’il a pris pleinement conscience.
- Surveiller les animaux tous les jours des signes de douleur, y compris la perte de poids de corps, absorption réduite de nourriture/eau, pelage hirsute/toilettage réduite, diminue/augmente l’activité spontanée, posture anormale, déshydratation cutanée sous la tente, les yeux enfoncés, masquage, automutilation, respiration rapide, respiration bouche ouverte, tics, tremblements, tremblements et vocalisation.
- Surveiller les animaux tous les jours jusqu'à ce qu’il semble qu’ils sont manger, boire, toilettage et prendre du poids ; et puis toutes les semaines après la prise de poids.
- Euthanasie au début par l’inhalation de CO2 et une confirmation secondaire d’euthanasie (pour s’assurer que l’animal ne sera pas revivre en raison de l’inhalation de2 CO d’oxygène normale d’alimentation post a) se produira à tout animal qui semble être de ne pas manger, boire et prise de poids après l’intervention chirurgicale initiale ; apparaît dans la douleur ; ou semble incapable de terminer les tests comportements en raison d’un plus grand que prévu le déficit du cortex moteur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le schéma de la Figure 1 représente le flux de travail global de la stimulation électrique des hNPCs et des éventuelles applications en aval. Une limitation de courant dans la thérapie de cellules souches, c’est que les cellules souches sont exposés à un environnement d’après la transplantation dur notamment l’inflammation et conditions ischémiques. Ces conditions difficiles susceptibles de limitent leur efficacité thérapeutique14,15. L’utilisation d’un échafaudage conductrice pour protéger les hNPCs de cet environnement peut augmenter hNPCs les bienfaits thérapeutiques par le biais de préconditionnement électrique. La première étape de cette technique de livraison de cellules souches est le développement d’un échafaudage de conducteur à l’aide d’un revêtement électrolytique approche2,16. Nous avons caractérisé la biocompatibilité des échafaudages et optimisé les caractéristiques électriques de préconditionnement avec hNPCs. Contrôles ont été définis comme des cellules souches non stimulées, cultivées sur une plaque de culture de tissus.
Des tensions différentes ont été évaluées afin de déterminer l’innocuité de la stimulation électrique et pour maximiser l’efficacité de préconditionnement. Pour s’assurer que le champ appliqué est le même dans chaque chambre, la résistivité de chambre assemblé a été mesurée à l’aide d’un multimètre (résistances (Ohm, Ω) des chambres étaient environ 10 kΩ et resistivity≈3 Ωm). Selon le vendeur commercial, les hNPCs utilisés n’ont montré aucune cytotoxicité significative dans les systèmes de culture normale. hNPCs avec ou sans exposition à une stimulation électrique ont été colorées avec les analyses de viabilité de cellules (vivantes : vert ; Dead : red) (Figure 2). Ces résultats indiquent que les hNPCs étaient viables après la stimulation électrique (±400 mV, 100 Hz pendant 1 h). Pour valider l’analyse de viabilité de cellules, nous avons effectué essais de viabilité cellulaire à un dosage de résazurine. Les résultats ne démontrent également aucune cytotoxicité significative de la stimulation électrique sur hNPCs.
Nos données in vivo précédentes ont démontré que facteurs paracrines libérés de hNPCs (SD56, PNJs, dérivés de cellules souches embryonnaires), avec une exposition à une stimulation électrique améliorent la récupération après la course2. Pour explorer davantage les facteurs de candidat connues pour être importante dans la récupération de l’AVC qui sortent de hNPC (Aruna biomédicale, PNJs, dérivés de cellules souches embryonnaires), BDNF et INCULPER-1 ont été évaluées. Ces facteurs ont été intensivement étudiés en raison de leur rôle dans la croissance neuronale et augmentent des interactions cellule-cellule17,18. Pour étudier l’efficacité de la stimulation électrique sur les modifications du transcriptome de BDNF et INCULPER-1, qRT-PCR a été réalisée notamment des gènes BDNF et INCULPER-1 avec GAPDH comme un gène de ménage. Environ 1 µg d’ARN total a été inverse-transcrit en ADNc selon le protocole du fabricant. Pli-changement normalisée rapports ont été calculés par la méthode ΔΔCt, en comparant l’expression des gènes en hNPCs sur PPy et hNPCs sur PPy avec une exposition à une stimulation électrique. L’analyse statistique a montré upregulations significatives dans l’expression génique de BDNF et INCULPER-1 entre les groupes qui étaient électriquement dépendant de la stimulation (p ≤0.01) (Figure 3). Ces données suggèrent que l’optimisation n’est possible de maximiser l’efficacité de hNPC sans la mort cellulaire importante.
Figure 1 . In vitro système d’échafaudage polymère conducteur pour une stimulation électrique. (A) une chambre de diapositive est placée au dessus de la plaque PPy. (B) le schéma montre la fabrication de la chambre de stimulation électrique en vitro avec hNPCs plaqué sur la surface de PPy. Vannes de débit sont utilisés pour maintenir la chambre de diapositive, PDMS, PPy et Plaquemétallique ensemble. (C) Image de la chambre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Analyse de viabilité de cellules en hNPCs avec ou sans stimulation électrique. (A) graphique à barres montrant des cellules vivantes tachée de calcéine-am. Les données présentées sont moyenne ± S.D. ; n = 4. (B) analyse de viabilité de cellules à l’aide de résazurine. Diagramme à barres indique il n’y avait aucune cytotoxicité de la stimulation électrique sur hNPCs ; n = 4. (C) Images de la viabilité cellulaire de dosage avant et après traitement de stimulation électrique. Signal vert indique des cellules vivantes (calcéine-am), alors que le signal rouge indique les cellules mortes (EtHD-1). ES indique une stimulation électrique. ES + ou - indique la présence ou l’absence de stimulation électrique sur les cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Modifications de l’expression génique avec électro-stimulation. Graphique à barres montrant plier changements dans les expressions de gènes de BDNF (A) et THBS1 (B) à hNPCs (** indique statistiquement significative entre les groupes électriquement préconditionnés et tous les autres, p < 0,01, erreur barres montrent S.D. ; n = 4, ANOVA à ). Négatif indique que le contrôle, où les cellules sont cultivées sur une plaque de vitroplants ordinaire. ES + ou - indique la présence ou l’absence de stimulation électrique sur les cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plus en plus évident a démontré la promesse des cellules souches comme une thérapie de nouveaux accidents vasculaires cérébraux. Cette promesse a entraîné un effort majeur pour faire progresser la thérapeutique de cellules souches au chevet du malade au moins 40 essais cliniques en cours ou achevés. Pathologie de la course propose un trouble neurologique unique qui se prête à la thérapie de cellules souches, parce qu’après l’insulte aiguë, il n’y a aucun processus neurodégénératif empêchant la récupération. On ne sait pas le mécanisme exact de la récupération de cellules souches améliorées des accidents vasculaires cérébraux. Angiogenèse, synaptogenèse et remodelage synaptique ont tous démontrés important. Lorsque les molécules importantes pour la formation des synapses comme BDNF et INCULPER-1 sont supprimées, accident vasculaire cérébral récupération est réduite de6,19. hNPCs ont amélioré la récupération fonctionnelle après un AVC dans plusieurs modèles animaux20,21. Les mécanismes de la hNPCs effet reste pas entièrement comprise, et la méthode de livraison idéal pour ces cellules est inconnue. En développant un système qui permet de manipuler les molécules importantes libérés de hNPCs, on peut aider à différencier les mécanismes de récupération intégrale et d’optimiser la thérapie de cellules souches.
Livraison réussie de cellule du cerveau reste un défi. Actuellement, un certain nombre de technologies ont été développé à l’aide de systèmes d’échafaudage de différents biomatériaux pour fournir des cellules souches pour améliorer la survie et l’intégration de cellules souches9,10. Toutefois, en raison des caractéristiques inertes de ces matériaux, il est difficile de moduler des cellules souches après leur transplantation.
Cet article décrit une méthode utilisant un échafaudage PPy pour manipuler électriquement le transcriptome de hNPCs, comme en témoigne l’upregulation de BDNF et INCULPER-1 dans nos données qRT-PCR. Notre étude précédente a montré qu’une augmentation de l’expression de VEGFA sur hNPCs après l’exposition à une stimulation électrique amélioré récupération fonctionnelle après la course2. Nous démontrons que neurotrophiques supplémentaires facteurs tels que le BDNF et INCULPER-1 sont aussi modulés après exposition à une stimulation électrique dans une lignée de cellules de différentes hNPC, montrant que notre système peut être utilisé avec plusieurs lignées cellulaires.
Au cours de la fabrication de la chambre de stimulation électrique in vitro , il est essentiel que le fil métallique est bien connecté à PPy plaque à l’aide d’époxy et peinture argentée. Si cette connexion n’est pas bonne, elle provoque des champs électriques variables même avec les mêmes paramètres. En outre, tantôt médias peuvent s’écouler après l’assemblage du système de génération de modèles automatique. Pour résoudre ce problème, la graisse sous vide peut être appliqué pour sceller l’espace entre le PDMS et la plaque PPy avec soin, ne pas s’appliquer à la surface de la cellule-ensemencement. Une des limites en raison de la nature opaque de la plaque PPy sont que vérification confluence des cellules avec la microscopie photonique standard est limité.
L’avantage de la méthode décrite dans le présent protocole permet pour la modulation de hNPCs pour aider à déterminer les changements mécanistes des cellules. Actuellement, modulation électrique n’a pas été approchée à l’aide d’hydrogel classique ou systèmes d’échafaudage inerte. Après stimulation électrique à l’aide de l’échafaud PPy, les hNPCs peuvent être livrés sans enlèvement de la surface du polymère à un modèle in vivo . Développement de méthodes pour une étude plus approfondie des demandes de cellules souches, les modèles de maladies nous permet d’améliorer la conception applications translationnelles. L’approche de préconditionnement électrique, rendu possible par le système de polymère conducteur, peut être appliquée à différents types de cellules et permet de mieux comprendre l’impact de la stimulation électrique sur une cellule. La possibilité d’optimiser les cellules in vitro et ensuite sans plus de manipulation (par exemple le passage ou la suppression) permet de tester de ces manipulations in vitro dans in vivo états pathologiques comme l’accident vasculaire cérébral. Le but ultime est d’utiliser de nouvelles techniques, telles que l’échafaud de polymère conducteur décrit, pour avancer la thérapeutique des maladies et améliorer la compréhension des mécanismes de recouvrement des accidents vasculaires cérébraux.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer avec ce travail.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Kati Andreasson (département de neurologie et des sciences neurologiques, l’Université de Stanford) pour une utilisation de la machine qRT-PCR. Le travaux ont été subventionnés par les instituts nationaux de santé subventions K08NS098876 (pour P.M.G.) et bourse de recherche postdoctorale du doyen de l’école de médecine de Stanford (au B.O.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 20 ng/mL for working media |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 dilution |
| LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10 ng/mL for working media |
| Sylgard 184 silicone 3.9 kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA56-4 | |
| Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| Sodium dodecylbenzenesulfonate | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | Protect pyrrole solution from light and room temperature |
| 8 well glass slide chambers | Thermo Sci Nuc | 125658 | Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions |
| Flat-Surface Bracket, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | Electron Microscopy Sciences | 1264214 | Mix two parts (1:1) in plastic plate |
| DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red | Genesse | 25-508C | |
| AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| Multimeter | Keysight | E3641A | |
| Wavefoam generator | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt meshes | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | Reference electrode with dimensions, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | Thermo Fisher Scientific | Hs02718934_s1 | |
| THBS1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00962908_m1 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02758991_g1 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | |
| QIAshredder (250) | Qiagen | 79656 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns | BIORAD | 1708891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4369510 | |
| 7-8 Week Old, male, RNU Rats | NCI-Frederick | ||
| 4-0 Ethicon Silk Suture | eSutures.com | 683G | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Surgicel Original Absorbable Hemostat | Ethicon | 1952 | |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat | Stoelting | 51600 | |
| Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves | Fisherbrand | 19-063-130 | |
| Sterile Drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern Scalpel Blade Series 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting Hook | Harvard Apparatus | 52-2706 |
References
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- George, P. M., et al. Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery. Biomaterials. 142, 31-40 (2017).
- Steinberg, G. K., et al. Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study. Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).
- George, P. M., Steinberg, G. K. Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
- Schabitz, W. R., et al. Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis. Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).
- Liauw, J., et al. Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).
- Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype. Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).
- Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
- Ballios, B. G., et al. A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation. Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).
- Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel. Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).
- Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. Implant Biomaterials: A Comprehensive Review. World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).
- Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair. Front Hum Neurosci. 9, (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Abdelwahid, E., et al. Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair. Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).
- Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- George, P. M., et al. Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics. Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).
- Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells. J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).
- Lopes, N., et al. Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling. Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).
- Ploughman, M., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats. Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).
- Baker, E. W., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model. Sci Rep. 7 (1), 10075 (2017).
- Bacigaluppi, M., et al. Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes. J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).
