Summary
Este protocolo descreve a fabricação de um sistema de cultura de células para permitir a propagação de células-tronco em um andaime de polímero condutor para estimulação elétrica em vitro e subsequentes na vivo implantação da célula-tronco-semeado andaime usando um técnica minimamente invasiva.
Abstract
Terapia de células-tronco tem emergido como um excitante curso terapêutica, mas o método de entrega ideal permanece obscuro. Enquanto a técnica de microinjeção tem sido usada há décadas para fornecer células-tronco em modelos stroke, esta técnica é limitada pela falta de habilidade para manipular as células-tronco antes da injeção. Este documento detalha um método do uso de um andaime de polímero eletricamente condutivo para a entrega de células-tronco. Estimulação elétrica de células-tronco usando um andaime de polímero condutor altera os genes da célula tronco envolvidos na sobrevivência celular, resposta inflamatória e remodelamento sináptico. Após pré-condicionamento elétrico, as células-tronco no andaime são transplantadas intracraniano em um modelo de rato de oclusão de artéria cerebral média distal. Este protocolo descreve uma técnica poderosa para manipular as células-tronco através de um andaime de polímero condutor e cria uma nova ferramenta para desenvolver a terapia baseada em células-tronco.
Introduction
Derrame é a segunda principal causa de morte no mundo e a quinta causa principal de morte nos Estados Unidos. Apesar destas altas taxas de morte, tratamentos para recuperação de acidente vascular cerebral atualmente permanecem um desafio com sem opções viáveis de médicos actualmente disponíveis1. Existem atualmente cerca de 300 ensaios clínicos lidando com traços isquêmicos, dos quais somente 40 utilizam células-tronco. Estudos anteriores demonstraram que as terapias de células-tronco têm um efeito benéfico sobre o curso reparo2,3. Parácrina fatores como fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e thrombospondin-1 (THBS-1) lançado a partir de células progenitoras neurais humanas transplantadas (hNPCs) têm mostrado recuperação funcional melhorada através de mecanismos associados com um aumento na sinapse formação, angiogênese, ramificações dendríticas e novas projeções axonal, bem como modulando o sistema imunológico4,5,6. No entanto, os métodos de entrega ideal das células-tronco permanecem indescritíveis.
Entrega de células-tronco bem sucedida para o cérebro continua a ser um desafio. Atualmente, hidrogel injetável e sistemas poliméricos andaimes foram introduzidos para fornecer células-tronco. Esses métodos de entrega protegem transplante de células-tronco, bem como oferecem proteção contra o ambiente áspero de acidente vascular cerebral incluindo resposta inflamatória do hospedeiro e as condições de hipóxia7,8,9 , 10. no entanto, os materiais mais comumente usados são inertes, que limita o uso de modulação contínua (ou seja, estimulação elétrica) das células11. Estimulação elétrica é uma sugestão que influencia a diferenciação e densidade de canais de íon axônio consequência de células-tronco12. Em comparação com os polímeros inertes, polímeros condutores podem transportar um atual permitindo a estimulação elétrica e manipulação de células-tronco2. No entanto, o mecanismo preciso pelo qual estimulação elétrica modula a liberação de fator neurotrophic (i.e., BDNF e THBS-1) é ainda não totalmente explorado.
Este protocolo, descreveremos os passos para construir um sistema de cultura de células consistindo de um andaime de polímero condutor, polipirrol (PPA), que permite a estimulação elétrica em vitro . Por causa da maneira em que o sistema de cultura de células é fabricado, a posterior implantação de células-tronco-semeado cadafalso para o córtex peri-infarto é possível. Para este sistema, temos condição eletricamente as células-tronco no cadafalso por um curto período de tempo antes da implantação. Após a estimulação elétrica, o andaime de polímero condutor carregando as células é implantado com sucesso intracraniano, usando um método minimamente invasivo.
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Protocol
Todas as células-tronco e procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de supervisão de pesquisa de células-tronco de Stanford e pelo painel administrativo da Universidade de Stanford em cuidado de Animal de laboratório (SCRO-616 e APLAC-31909).
1. gravura de vidro de ITO
- Preparar o óxido da lata do indium (ITO)-lâmina de vidro coberta pela colocação de um agente de mascaramento no lado do condutor do vidro.
Nota: Mais comerciais fitas transparentes podem ser usadas como um agente de mascaramento.- Remover a máscara em excesso, usando uma lâmina, deixar apenas a forma desejada do design final ITO coberto no vidro.
- Combine 5% (v/v) de ácido nítrico e 45% (v/v) de HCl num copo de vidro dentro de uma coifa para preparar a solução de gravura.
- Usar um prato quente e um termômetro para garantir que a temperatura da solução de condicionamento é mantida a 70 ° C.
- Uma vez que a solução de gravura chega a 70 ° C, coloque a lâmina de vidro de mascarados-ITO na solução por 2 minutos remover a camada de ITO em excesso.
Nota: Mascaramento de fita protege a camada de ITO de exposição a solução ácida. - Retire o slide da solução e enxágue com deionizada (DI) H2O.
- Remova cuidadosamente a máscara e medida de resistência usando um multímetro para garantir que os restante ITO está intacto. Leituras da área desejada gravada devem ser de aproximadamente 0 Ω.
2. preparação da solução de pirrol
- Uma garrafa de vidro de 1000 mL, dissolver 70 g de dodecylbenzenesulfonate de sódio (NaDBS) em 600 mL de DI H2O.
- Uma vez que o NaDBS é dissolvido, adicione 14 mL de pirrol 0,2 M e 386 mL de DI H2O para a solução.
- Cobrir a solução com papel alumínio e armazene a 4 ° C.
3. galvanização de polipirrol em vidro de ITO
- Aquecer a solução de pirrol à temperatura até NaDBS é totalmente evapora.
Nota: Isto leva cerca de 15 a 20 minutos. - Despeje uma proveta 25 mL da solução de pirrol.
- Conectar o vidro de ITO gravado a um multímetro e mergulhe o slide a solução de pirrol.
- Certifique-se de que o lado com a resistência de Ω 0 é virada para o eléctrodo de referência de malha de platina.
- Aplica uma corrente elétrica para iniciar a galvanização do PPA na superfície de ITO, usando um multímetro (corrente controlada em 3 mA/cm2 para 4 horas).
- Remova o multímetro e lave galvanizada-PPA em DI H2O surfactante residual de remover o vidro de ITO.
- Suavemente retire a chapa galvanizada-PPA do vidro de ITO, usando uma lâmina de barbear.
- Armazene a placa PPA à temperatura ambiente.
4. preparação do Polydimethylsiloxane (PDMS)
- Usando uma espátula e um prato de pesagem, misturar 18 g de agente de base com 2 g de agente de cura e despeje a mistura em moldes de vidro dois 10 x 8 cm.
- Remova as bolhas de moldes utilizando uma câmara de vácuo para 15-20 minutos.
- Coloque os moldes em um forno de 70 ° C por 3 h.
- Uma vez arrefecido, use uma espátula plana para remover o PDMS de moldes.
5. fabricação da câmara de estimulação elétrica em Vitro
- Autoclave a placas de metal (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) e fluxo de válvulas a 120 ° C por 1 hora.
- Usando um slide da câmara como um modelo, corte dois pedaços de PDMS.
Nota: Um pedaço de PDMS serve como o perímetro da câmara de célula com recortes de dois quadrados contíguos de dentro da câmara de célula. O outro pedaço PDMS é o contorno do perímetro da câmara.- Cortar o interior câmara de célula para que ele seja quadrado em forma de e coincide com a forma da câmara de célula. Certifique-se que a forma geral de ambas as partes de PDMS é retangular e correspondências do slide a câmara.
- Os materiais da camada seguinte de baixo para cima: (1) placa, de Metal (2) PDMS (sem recortes), prato (3) PPA (perpendicular ao PDMS), (4) PDMS (com recortes) e câmara de celular (5).
- Fixe o aparelho juntos uma vez que ele é totalmente alinhado.
- Corte dois pedaços de 60 cm de um fio de metal e use o colar de prata para anexar um fio para cada extremidade da placa PPA que se projeta do lado de fora da câmara. Certifique-se de que os fios são tempo suficiente para estender do aparelho para o exterior de uma incubadora.
- Uma vez que o colar de prata está curado, reforçar e selar a conexão do fio com epóxi.
- A resistência usando um multímetro para certificar-se de que o campo aplicado é o mesmo em cada câmara de registro.
- Para implantação, retire os fios; desapertar as câmaras de célula e PDMS e, em seguida, eles separam o andaime condutora. A dimensão dos andaimes implantado é de aproximadamente 1 x 3 x 0,25 mm.
6. chapeamento humano neurais progenitoras (hNPCs) no PPA
- Esterilize as câmaras montadas sob luz UV durante 2 horas.
- Depois de 1 hora, gire o montado câmaras de 90°.
- Após a esterilização, reveste a superfície do PPA na parte inferior da câmara com 800 µ l de um substrato de revestimento e permitir que o substrato solidificar na placa PPA na incubadora a 37 ° C em 5% de CO2 por 1h.
- Depois de 1 hora, retire o sobrenadante das câmaras e lave delicadamente com 1 mL de DPBS + Ca + Mg por bem.
Nota: Evite lavar a superfície do PPA com força, porque isso poderá provocar o desprendimento do substrato do revestimento. - Usando a mídia de células frescas, mecanicamente dissocia pilhas cultivadas para uso com as câmaras de uma placa de cultura de tecido com suave pipetagem.
Nota: As células devem ser confluente de 90-100% em cima de dissociação. - Coletar hNPC pelotas usando centrifugação a 8000 x g, durante 5 minutos.
- Usando um hemocytometer, contar e ressuspender as células em um volume de 100.000 células/cm2.
- Placa de 100.000 células em cada câmara bem (100.000 células/cm2 em 1 mL de mídia).
- Câmaras de retornar a incubadora a 37 ° C em 5% CO2.
7. eletroestimulação de hNPCs
- Um dia após a semeadura as células sobre as câmaras, use um gerador de forma de onda para aplicar estimulação elétrica para as células.
- Antes da estimulação, remover a velha mídia de cada câmara bem e reabasteça com 800 µ l de mídia fresca.
- Depois que a mídia é alterada, colocar câmaras de volta para a incubadora, estender os cabos fora da incubadora e anexá-los a um gerador de forma de onda
- Aplica o estímulo para as células com um sinal de onda quadrada em mV ±400 com 100 Hz por 1h.
- Após a estimulação, retire os fios e incubar as câmaras para outro dia em uma incubadora que defina a 37 ° C com 5% de CO2.
- Realizar análise biológica subsequente, incluindo a viabilidade celular e reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR) seguindo o protocolo do fabricante.
8. na Vivo PPy implantação
- Executar modelos de stroke de oclusão de artéria cerebral média distal (dMCA) na deficiência de células T ratos nus macho adulto (NIH-RNU 230 ± 30 g) como descrito anteriormente2. Realize a oclusão de post-dMCA de uma semana de implantação.
- Um dia antes da cirurgia, dê ampicilina (1 mg/mL) para os ratos em sua água de gaiola.
- Anestesiar o rato em uma câmara de indução usando 0,5 - 3% mg/kg de isoflurano administrado por inalação.
- Confirme anesthetization do rato pela falta de reflexo resposta pitada de dedo do pé.
- Enquanto o animal está sob anestesia, continue a monitorar sua membrana cor, padrão de respiração e temperatura retal a cada 15 minutos.
- Uma vez confirmada anesthetization, aplica lágrimas artificiais aos olhos do rato para evitar ressecamento.
- Garantir a manutenção técnica asséptica durante este procedimento, usando luvas estéreis e um pano cirúrgico estéril13. Manter estéril instrumentos cirúrgicos dentro de um campo estéril.
- Enquanto o rato está sob anestesia, perfure uma craniectomia acima o córtex esquerdo. Abra a dura-máter.
- Remova a dura-máter do cérebro usando uma agulha fina micro cirúrgica.
- Implante os andaimes condutoras do sistema in vitro para o córtex de rato.
Nota: Para nossos experimentos, implantamos andaimes em vitro dia 3 após hNPC chapeamento.- Coloque o implante principalmente no córtex penumbral medial à lesão de acidente vascular cerebral.
- Após o andaime é colocado, coloque surgicel sobre o implante para impedir a movimentação com o fechamento da pele.
- Sutura ferida fechada e injectar por via subcutânea os ratos com buprenorfina SR a uma dosagem de 1 mg/kg para controlar a dor associada com cirurgia estereotáxica e oclusão de dMCA.
- Coloque o rato em uma gaiola de recuperação como ele recobra a consciência.
- Nunca abandone o animal enquanto está inconsciente.
- Não coloque o animal com os outros até totalmente ganhou consciência.
- Monitorar os animais diariamente para sinais de dor, incluindo perda de peso corporal, ingestão de comida/água diminuiu, casaco de aliciamento/despenteado reduzido, aumento/diminuição da atividade espontânea, postura anormal, desidratação/pele acampar, olhos encovados, escondido, auto-mutilação, respiração rápida, respiração de boca aberta, tremendo, tremendo, tremor e vocalização.
- Monitorar os animais diariamente, até parece que eles estão comendo, bebendo, aliciamento e ganhando peso; e então semanal após o ganho de peso.
- Eutanásia precoce através da inalação de CO2 e uma confirmação secundária de eutanásia (assegurar o animal não reviverá devido por inalação de oxigênio normal abastecimento post CO2 ) ocorrerá a qualquer animal que aparenta não estar comendo, bebendo e ganho de peso após o procedimento cirúrgico inicial; aparece na dor; ou parece incapaz de concluir os testes comportamentais devido a um maior que o esperado déficit do córtex motor.
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Representative Results
O diagrama mostrado na Figura 1 representa o fluxo de trabalho geral da estimulação elétrica de hNPCs e potenciais aplicações a jusante. Uma limitação atual na terapia de células-tronco é que as células-tronco são expostas a um ambiente áspero do pós-transplante incluindo inflamação e condições isquêmicas. Estas condições difíceis prováveis limitam sua eficácia terapêutica14,15. O uso de um andaime condutora para proteger hNPCs este ambiente pode aumentar hNPCs benefícios terapêuticos através de pré-condicionamento elétrica. O primeiro passo nesta técnica de entrega de células-tronco é o desenvolvimento de um andaime condutora usando uma galvanoplastia abordagem2,16. Nós caracterizado a biocompatibilidade de andaimes e otimizado características elétricas de pré-condicionamento com hNPCs. Controles foram definidas como células-tronco unstimulated crescidas numa placa de cultura de tecidos.
Tensões diferentes foram avaliadas para determinar a segurança da estimulação elétrica e para maximizar a eficácia de pré-condicionamento. Para garantir que o campo aplicado é o mesmo em cada câmara, a resistividade da câmara montada foi medida usando um multímetro (resistências (ohms, Ω) das câmaras foram aproximadamente 10 kΩ e resistivity≈3 Ωm). De acordo com o fornecedor comercial, os hNPCs usados mostraram citotoxicidade não significativa nos sistemas de cultura normal. hNPCs com ou sem exposição à estimulação elétrica foram corados com ensaios de viabilidade celular (Live: verde; Mortos: vermelho) (Figura 2). Estes resultados indicam que os hNPCs eram viáveis após a estimulação elétrica (mV ±400, 100 Hz por 1h). Para validar o ensaio da viabilidade celular, realizamos testes de viabilidade celular usando um ensaio de resazurina. Os resultados demonstram também não citotoxicidade significante de estimulação elétrica na hNPCs.
Nossos dados na vivo anteriores demonstraram que fatores parácrina lançados de hNPCs (SD56, NPCs, derivadas de células-tronco embrionárias) com uma exposição à estimulação elétrica melhoram a recuperação após acidente vascular cerebral2. Para explorar ainda mais fatores de candidato conhecidos por ser importante na recuperação do curso que são liberados de hNPC (Aruna biomédica, NPCs, derivadas de células-tronco embrionárias), foram avaliados BDNF e THBS-1. Esses fatores têm sido extensivamente estudados devido ao seu papel em consequência neuronal e aumentam em interações de célula para célula17,18. Para investigar a eficácia da estimulação elétrica no transcriptoma alterações para BDNF e THBS-1, qRT-PCR foi realizada incluindo genes BDNF e THBS-1 com GAPDH como um gene de limpeza. Aproximadamente 1 µ g de RNA total foi reverso-transcritos em cDNA de acordo com o protocolo do fabricante. Dobra-mudança normalizado rácios foram calculados pelo método de ΔΔCt comparando a expressão gênica em hNPCs no PPA e hNPCs no PPA com uma exposição à estimulação elétrica. A análise estatística mostrou upregulations significativo na expressão gênica de BDNF e THBS-1 entre os grupos que eram eletricamente estimulação dependente (≤0.01p ) (Figura 3). Este dados sugerem que a otimização é possível maximizar a eficácia de hNPC sem morte celular significativa.
Figura 1 . In vitro sistema de andaime de polímero condutor para estimulação elétrica. (A) uma câmara de slide é colocada no topo da placa PPA. (B) o esquema mostra a fabricação da câmara de estimulação elétrica em vitro com hNPCs chapeado na superfície do PPA. Válvulas de fluxo são usadas para segurar a câmara do slide, PDMS, PPA e placa de metal juntos. (C) a imagem da câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Ensaio da viabilidade celular em hNPCs com ou sem estimulação elétrica. (A) manchado de gráfico de barras demonstrando células vivas com calceína-am. Os dados apresentados são média ± D.P.; n = 4. (B) ensaio da viabilidade celular usando resazurina. Gráfico de barras mostra que não havia nenhuma citotoxidade de estimulação elétrica em hNPCs; n = 4. (C) imagens de viabilidade celular ensaio antes e após o tratamento de estimulação elétrica. Sinal verde indica células vivas (calceína-am), Considerando que o sinal vermelho indica células mortas (EtHD-1). ES indica estimulação elétrica. ES + ou - indica a presença ou ausência de estimulação elétrica em células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Alterações de expressão de gene com estimulação elétrica. Gráfico de barras demonstrando dobre mudanças em expressões de gene de BDNF (A) e THBS1 (B) em hNPCs (* * indica estatisticamente significativa entre os grupos eletricamente instintiva e todas as outras, p < 0,01, mostrar barras de erro S.D.; n = 4, ANOVA One-Way ). Negativo indica que o controle onde as células foram cultivadas em uma placa de cultura de tecido normal. ES + ou - indica a presença ou ausência de estimulação elétrica em células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Crescentes evidências tem demonstrado a promessa de células-tronco como uma terapia de romance, acidente vascular cerebral. Esta promessa resultou em um grande esforço para avançar terapêutica de células-tronco para o lado da cama, pelo menos 40 ensaios clínicos em curso ou já concluídos. Patologia de curso oferece um único distúrbio neurológico que se presta a terapia de células-tronco, porque após o insulto agudo, não há nenhum processo neurodegenerativas, impedindo a recuperação. O mecanismo exato de recuperação do curso avançado células-tronco permanece obscuro. Angiogênese, sinaptogênese e remodelamento sináptico têm todos demonstrados ser importante. Quando moléculas importantes para a formação de sinapse como BDNF e THBS-1 são removidas, recuperação de acidente vascular cerebral é prejudicada6,19. hNPCs melhoraram a recuperação funcional após acidente vascular cerebral em vários modelos animais20,21. Os mecanismos de hNPCs o efeito permanece não totalmente compreendidas, e desconhece-se o método de entrega ideal para essas células. Através do desenvolvimento de um sistema que permite manipular as moléculas importantes libertadas do hNPCs, um pode ajudar a diferenciar os mecanismos de recuperação integral e otimizar a terapia de células-tronco.
Entrega de célula bem sucedido para o cérebro continua a ser um desafio. Atualmente, algumas tecnologias foram desenvolvidas usando sistemas de andaimes de biomaterial diferentes para fornecer células-tronco para melhorar a sobrevivência e a integração de células-tronco9,10. No entanto, devido às características inertes destes materiais, é difícil modular as células-tronco após seu transplante.
Este artigo descreve um método usando um andaime PPy eletricamente manipular a transcriptoma de hNPCs, como mostrado pelo upregulation de BDNF e THBS-1 em nossos dados de qRT-PCR. Nosso estudo anterior revelou que um aumento na expressão de VEGFA na hNPCs após a exposição ao estímulo elétrico melhorado recuperação funcional após AVC2. Aqui vamos demonstrar que essa neurotrophic adicional fatores tais como BDNF e THBS-1 também são modulados após exposição à estimulação elétrica em uma linha de celular de diferentes hNPC, mostrando que nosso sistema pode ser usado com numerosas linhas de célula.
Durante a fabricação da câmara de estimulação elétrica em vitro , é fundamental que o metal é completamente ligado à placa PPA usando epóxi e tinta prateada. Se esta conexão não é som, faz com que diferentes campos elétricos nem com os mesmos parâmetros. Além disso, às vezes a mídia pode vazar após a montagem do sistema de andaimes. Para resolver esse problema, graxa de vácuo pode ser aplicada para selar o espaço entre o PDMS e a placa de PPA com cuidado para não aplicar na superfície da célula-semeadura. Uma limitação devido à natureza não-transparente da placa PPA é que verificando a confluência das células com microscopia de luz padrão é limitado.
A vantagem do método descrito neste protocolo permite a modulação da hNPCs para ajudar a determinar as mudanças mecanicistas das células. Atualmente, modulação elétrica não foi abordada utilizando hidrogel convencional ou sistemas de andaime inerte. Após a estimulação elétrica usando o andaime do PPA, o hNPCs pode ser entregue sem a remoção da superfície do polímero para um modelo in vivo . Desenvolver métodos para um estudo mais aprofundado modelos doença de aplicações de células-tronco nos permite melhor design aplicações translacionais. A abordagem de pré-condicionamento elétrica, possibilitada pelo sistema de polímero condutor, pode ser aplicada a diferentes tipos de células e permite a melhor compreensão do impacto da estimulação elétrica em uma célula. A capacidade de otimizar as células em vitro e então, sem mais manipulação (como passagem ou remoção) permite testes destas manipulações em vitro na vivo Estados de doença como acidente vascular cerebral. O objectivo final é utilizar novas técnicas, como o andaime de polímero condutor descrito, para avançar a terapêutica do acidente vascular cerebral e melhorar a compreensão dos mecanismos de recuperação de acidente vascular cerebral.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse, para declarar-se com este trabalho.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Kati Andreasson (departamento de Neurologia e ciência neurológica, Universidade de Stanford) para uso da máquina qRT-PCR. O trabalho foi apoiado pela nacional institutos de saúde subsídios K08NS098876 (para P.M.G.) e Postdoctoral Fellowship do reitor de Stanford School of Medicine (ao b.o. n).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 20 ng/mL for working media |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 dilution |
| LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10 ng/mL for working media |
| Sylgard 184 silicone 3.9 kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA56-4 | |
| Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| Sodium dodecylbenzenesulfonate | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | Protect pyrrole solution from light and room temperature |
| 8 well glass slide chambers | Thermo Sci Nuc | 125658 | Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions |
| Flat-Surface Bracket, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | Electron Microscopy Sciences | 1264214 | Mix two parts (1:1) in plastic plate |
| DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red | Genesse | 25-508C | |
| AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| Multimeter | Keysight | E3641A | |
| Wavefoam generator | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt meshes | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | Reference electrode with dimensions, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | Thermo Fisher Scientific | Hs02718934_s1 | |
| THBS1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00962908_m1 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02758991_g1 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | |
| QIAshredder (250) | Qiagen | 79656 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns | BIORAD | 1708891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4369510 | |
| 7-8 Week Old, male, RNU Rats | NCI-Frederick | ||
| 4-0 Ethicon Silk Suture | eSutures.com | 683G | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Surgicel Original Absorbable Hemostat | Ethicon | 1952 | |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat | Stoelting | 51600 | |
| Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves | Fisherbrand | 19-063-130 | |
| Sterile Drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern Scalpel Blade Series 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting Hook | Harvard Apparatus | 52-2706 |
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