Summary
Bu iletişim kuralı bir iletken polimer iskele vitro elektriksel stimülasyon ve kök hücre numaralı seribaşı iskele kullanarak sonraki vivo içinde implantasyon için üzerinde kök hücrelerin tohum izin vermek için bir hücre kültür sistemi imalatı açıklar bir minimal invaziv tekniği.
Abstract
Kök hücre tedavisi heyecan verici bir kontur olarak terapötik çıkmıştır ama en uygun Teslimat yöntemi belirsizdir. Mikroenjeksiyon tekniği kök hücre kontur modellerinde sunmak için yıllardır kullanılan iken, bu teknik enjeksiyon önce kök hücre işleme yeteneği eksikliği ile sınırlıdır. Bu kağıt bir elektriksel olarak iletken polimer iskele kök hücre teslim için kullanma yöntemi ayrıntıları. Bir iletken polimer iskele kullanarak kök hücrelerin elektriksel stimülasyon kök hücrenin genler hücre hayatta kalma, inflamatuar yanıt ve sinaptik remodeling yer değiştirir. Elektrik Önkoşullanma sonra iskele üzerinde kök hücre intracranially distal orta serebral arter tıkanıklığı sıçan modelinde nakledilen. Bu iletişim kuralı bir iletken polimer iskele üzerinden kök hücre işlemek için güçlü bir teknik anlatılmaktadır ve daha fazla kök hücre tabanlı terapisi geliştirmek için yeni bir araç oluşturur.
Introduction
İnme dünyada ölüm ikinci önde gelen nedenidir ve ölüm beşinci önde gelen nedenidir Amerika Birleşik Devletleri olduğunu. Bu yüksek ölüm oranlarını rağmen tedaviler inme kurtarma için şu anda bir sorun yok uygun tıbbi seçenekler mevcut1kalır. Orada şu anda yaklaşık 300 klinik çalışmalarda hangi kök hücreler sadece 40 kullanmak iskemik inme ile ilgili. Önceki çalışmalarda kök hücre tedavileri kontur onarım2,3üzerinde yararlı bir etkisi olduğunu ortaya koymuştur. Parakrin faktörler beyin kaynaklı Nörotrofik faktör (BDNF) ve Transplante insan nöral progenitör hücre (hNPCs) yayımlanan trombospondin-1 (THBS-1) gibi bir artış ile ilgili mekanizmalar yoluyla geliştirilmiş fonksiyonel iyileşme göstermiştir oluşumu, anjiogenez, dendritik dallanma ve yeni aksonal projeksiyonlar sinaps gibi bağışıklık sistemi4,5,6modülasyonlu. Ancak, kök hücrelerin en uygun teslimat yöntemlerinin zor kalır.
Başarılı kök hücre teslim beyin için bir meydan okuma olarak kalır. Şu anda, enjekte edilebilir hidrojel ve polimerik İskele sistemleri kök hücre sunmak için getirilmiştir. Bu teslim yöntemi kök hücre nakli sırasında korumak hem de ana bilgisayarın inflamatuar yanıt ve hipoksik koşullar7,8,9 gibi sert inme sonrası çevre koruma , 10. ancak, en yaygın olarak kullanılan malzemeler hangi hücreleri11sürekli Modülasyon (Yani, elektriksel stimülasyon) kısıtlar etkisiz,. Elektriksel stimülasyon farklılaşma, iyon kanal yoğunluğu ve kök hücre12neurite akıbet etkiler bir ipucudur. İnert polimerler ile karşılaştırıldığında, elektriksel stimülasyon ve kök hücre2manipülasyon için geçerli bir izin iletken polimerler taşıyabilir. Ancak, hangi tarafından Nörotrofik faktör sürümü (Yani, BDNF ve THBS-1) elektriksel stimülasyon modüle kesin mekanizması hala tam keşfedilmeden.
Bu protokol için bir iletken polimer iskele, vitro için elektriksel stimülasyon sağlar polypyrrole (PPy), oluşan bir hücre kültür sistemi oluşturmak için adımları açıklar. Hangi hücre kültür sistemi fabrikasyon olduğunu şekilde nedeniyle, peri-enfarktüsü korteks üzerine kök hücre numaralı seribaşı iskele sonraki implantasyonu mümkündür. Bu sistem için biz elektrikle kök hücre iskele üzerinde kısa bir süre önce implantasyon için yaygõn. Elektriksel stimülasyon hücreleri taşıyan iletken polimer iskele intracranially minimal invaziv bir yöntem kullanarak başarılı bir şekilde yerleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm kök hücre ve hayvan yordamlar Stanford'un kök hücre araştırma Gözetim Komitesi tarafından ve laboratuvar hayvan bakım (SCRO-616 ve APLAC-31909) Stanford Üniversitesi'nin Yönetim Panel tarafından kabul edildi.
1. gravür Ito cam
- İndiyum kalay oksit (ITO) hazırlamak-cam iletken yan tarafa bir maskeleme ajanı yerleştirerek kaplı cam kaymak.
Not: Çoğu ticari şeffaf bantlar bir maskeleme ajanı olarak kullanılabilir.- Bir bıçak kullanarak aşırı maskesi kaldırmak için yalnızca istediğiniz şekli son ITO tasarım bırakarak cam kaplı.
- Nitrik asit (v/v) %5 ve % 45'i (v/v) HCl bir duman başlık içinde bir cam ölçek büyütme çözüm hazırlamak için birleştirir.
- Çözüm aşındırma sıcaklık 70 ° C'de korunur emin olmak için elektrikli Ocak ve bir termometre kullanın
- 70 ° C Dağlama çözüm ulaştıktan sonra maskeli-ITO cam slayt 2 dakika fazla ITO kat kaldırmak çözüm içine yerleştirin.
Not: Bant maskeleme asit solüsyonu maruz ITO katman korur. - Slayt çözümden kaldırmak ve deiyonize (DI) H2ile O. durulayın
- Kalan ITO sağlam olduğundan emin olmak için bir multimetre kullanarak maske ve ölçü direnç dikkatli bir şekilde çıkarın. Sonuçlar istenilen kazınmış alanının yaklaşık 0 Ω olmalıdır.
2. Pyrrole çözüm hazırlanması
- 1000 mL cam şişe 70 g sodyum dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) 600 mL DI H2O. geçiyoruz.
- Bir kez NaDBS çözülür, 14 mL 0,2 M pyrrole ve DI H2O 386 mL ekleyin.
- Alüminyum folyo ile çözüm kapak ve 4 ° C'de depolayın
3. galvanik Polypyrrole ITO camına,
- NaDBS tamamen redissolved kadar oda sıcaklığında pyrrole çözümünü sıcak.
Not: Bu yaklaşık 15-20 dakika sürer. - 25 mL pyrrole çözeltisi bir kabı dökün.
- Kazınmış ITO cam için bir multimetre bağlanmak ve slayt pyrrole çözüm içine daldırın.
- 0 Ω direnci ile yüzün Platin kafes referans elektrot doğru dönük olduğundan emin olun.
- Bir elektrik akımı bir multimetre (3 mA/cm2 ' de 4 saat boyunca kontrollü akım) kullanarak ITO yüzeyinde PPy galvanik başlatmak için geçerlidir.
- ITO cam multimetre ve yıkama alaşımlı-PPy kalan yüzey aktif kaldırmak için DI H2O kaldırın.
- Yavaşça bir jilet kullanarak ITO cam alaşımlı PPy tabaktan ayırın.
- PPy plaka oda sıcaklığında saklayın.
4. Polydimethylsiloxane (PDMS) hazırlanması
- Bir spatula ve tartmak çanak kullanarak, temel Aracısı 18 g kür Ajan 2 g ile mix ve iki 10 cm x 8 cm cam kalıpları içine karışımı dökün.
- Kabarcıklar vakum odası 15-20 dakika kullanarak kalıplar kaldırın.
- Kalıpları 3 h 70 ° C fırında yerleştirin.
- Soğutmalı sonra düz bir spatula PDMS kalıpları kaldırmak için kullanabilirsiniz.
5. Vitro elektriksel stimülasyon odası imalatı
- Otoklav metal levhalar (WxL, 2.5 cm x 12,5 cm) ve akışı vanalar 120 ° C'de 1 saattir.
- Odası slayt şablon olarak kullanıp, iki adet PDMS kesti.
Not: Tek parça PDMS hücre odası çevre kesik iki bitişik kareler içinde hücre odası ile hizmet vermektedir. Diğer PDMS odası 's çevre bir taslağını parçasıdır.- Kesmek iç hücre odası böylece kare şeklinde ve hücre odası şeklinde eşleşir. PDMS iki adet genel şekli dikdörtgen ve odası slayt uygun emin olun.
- Malzeme--dan dip aşağıdakine üst olarak katman: (1) Metal plaka, (2) PDMS (olmadan kesik), (3) PPy plaka (PDMS için dikey), PDMS (4) (ile kesik) ve (5) hücre odası.
- Bir kez tam olarak hizalanır aparatı birlikte kelepçe.
- Bir metal tel iki 60 cm parçalar koparıp ve gümüş hamur odası dışarıdan protrudes PPy plaka her sonu için bir kablo bağlamak için kullanın. Teller cihaz bir kuluçka dışa doğru genişletmek yeterince uzun olduğundan emin olun.
- Bir kez gümüş Yapıştır tedavi güçlendirmek ve epoksi ile tel bağlantı mühür.
- Direnç uygulanan alanını her odasında aynı olduğundan emin olmak için bir multimetre kullanarak kaydedin.
- İmplantasyon için kabloları çıkarın; hücre odaları unclamp ve iletken iskele PDMS ve sonra onları ayrı. İmplante iskele yaklaşık 1 x 3 x 0,25 mm boyuttur.
6. insan nöral progenitör hücre (hNPCs) PPy kaplama
- UV ışık altında birleştirilmiş chambers sterilize etmek için 2 saat.
- 1 saat sonra monte döndürün 90 ° Odaları.
- Sterilizasyon sonra PPy odası alt kaplama substrat 800 µL ile yüzey kat ve 1 h için % 5 CO2 37 ° C'de bir kuluçka PPy tabakta kuvvetlendirmek belgili tanımlık substrate sağlar.
- 1 saat sonra süpernatant odaları kaldır ve yavaşça DPBS + Ca + Mg 1 mL de başı ile durulayın.
Not: Bu kaplama substrat dekolmanı neden olur gibi zorla PPy yüzey yıkama kaçının. - Taze hücre medyayı kullanarak, mekanik olarak kültürlü hücreler nazik pipetting ile doku kültürü plaka chambers ile kullanmak için ayırmak.
Not: Hücreleri % 90-100 birleşmesi ayrılma üzerine olmalıdır. - Santrifüjü kullanarak de 8000 x g 5 dakika hNPC granül toplamak.
- Bir hemasitometre kullanarak, say ve hücreleri 100.000 hücreler/cm2ses seviyesinde resuspend.
- Her odaya iyi (100.000 hücreler/cm2 ' medya 1 mL) 100.000 hücreleri plaka.
- Kuluçka makinesi %5 37 ° C'de Chambers dönmek CO2.
7. elektrik hNPCs uyarılması
- Bir gün chambers, hücrelerdeyse tohum sonra bir dalga formu jeneratör elektrik stimülasyonu hücrelere uygulamak için kullanın.
- Stimülasyon önce eski medya de her odasından kaldırın ve taze medya 800 µL ile doldurmak.
- Medya değiştirildikten sonra odaları da kuluçka yerleştirin, kuluçka makinesi dışında teller genişletmek ve onları bir dalga formu jeneratör takmak
- Bir kare dalga sinyali için 1 h 100 Hz ile ±400 mV, hücrelerle stimülasyon uygulanır.
- Stimülasyon sonra kabloları çıkarın ve odaları ile % 5 CO237 ° C'de ayarla bir kuluçka başka bir gün için kuluçkaya.
- Hücre canlılığı ve nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) üreticinin protokol sonrası dahil olmak üzere sonraki biyolojik çözümlemesi gerçekleştirin.
8. içinde Vivo PPy implantasyon
- Distal orta serebral arter (dMCA) tıkanıklığı felç modelleri T hücre eksikliği üzerinde gerçekleştirmek yetişkin erkek çıplak rats (NIH-RNU 230 ± 30 g) olarak açıklanan daha önce2. İmplantasyon bir hafta sonrası dMCA tıkanıklığı gerçekleştirin.
- Bir gün önce ameliyat, onların kafes suda sıçanlar için Ampisilin (1 mg/mL) ver.
- Fareyi kullanarak bir indüksiyon odası içinde anestezi 0.5 - % 3 mg/kg isoflurane inhalasyon yolu ile yönetilen.
- Anesthetization farenin burun çimdik refleks yanıt alınamaması tarafından onaylayın.
- Hayvan anestezi altında olmakla birlikte, onun membran renk, nefes desen ve rektal sıcaklık 15 dakikada izlemeye devam edin.
- Anesthetization onayladıktan sonra suni gözyaşı kuruluğu önlemek için fare gözünü uygulanır.
- Aseptik teknik steril eldiven ve steril cerrahi örtüsü13kullanarak bu yordamı sırasında korunur emin olun. Steril cerrahi aletlerin steril alan içinde tutun.
- Fareyi anestezi altında olmakla birlikte, kraynektomi yukarıda sol korteks matkap. Beyin zarı açın.
- Dura mater beyin cerrahi mikro-ince iğne kullanarak kaldırın.
- Sıçan korteks vitro sisteminden iletken iskele implant.
Not: bizim deneyler için iskele vitro gün 3 hNPC kaplama sonra implante.- İmplant öncelikle halkalı korteks üzerinde medial kontur lezyon için yerleştirin.
- İskele yerleştirildikten sonra surgicel hareket cilt kapatma ile önlemek için implant üzerine getirin.
- Yara kapa ve subkutan buprenorfin SR, stereotaksik cerrahi ve dMCA tıkanıklığı ile ilgili ağrı yönetmek için 1 mg/kg doz ile farelere enjekte dikiş.
- Bilinci yerine gibi fare kurtarma kafese koyun.
- Asla baygın durumdayken hayvan çalıştırın.
- O tamamen bilinç kazanmıştır kadar başkaları ile hayvan koymayın.
- Hayvanlar günlük vücut kilo kaybı, düşük gıda/su alımı, azaltılmış bakım/dağınık ceket, spontan aktivite azaldı/arttı, anormal postür, dehidratasyon/cilt çadır, batık gözler, gizleme, öz sünneti de dahil olmak üzere ağrı belirtileri için izlemek, Hızlı solunum, açık ağızlı nefes, seğirmesi, titreyen, tremor ve seslendirme.
- Onlar yeme, içme, damat ve kilo olduğunu görünene kadar hayvanlar her gün izlemek; ve sonra haftalık sonra kilo.
- CO2 inhalasyon ve euthanization (hayvan değil normal oksijen kaynağı yazı CO2 inhalasyon nedeniyle canlandırmak sağlamak için) bir ikincil onay ile erken euthanization içme yemek değil, görünür herhangi bir hayvan gerçekleşir ve ilk cerrahi işlem sonrası kilo; acı içinde görünür; veya davranış testleri büyük bir motor korteks açığı beklenenden daha nedeniyle tamamlayamadı görünür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 ' de gösterilen şematik genel iş akışını hNPCs ve potansiyel aşağı akım uygulamaları elektriksel stimülasyon ve temsil eder. Bir geçerli kök hücre tedavisi, kök hücre iltihabı ve iskemik koşulları gibi sert bir sonrası nakli ortamına maruz kısıtlamadır. Bu zor koşullar büyük olasılıkla onların tedavi edici etkinliği14,15sınırlayın. Bu ortamdan hNPCs korumak için bir iletken iskele kullanımı elektrik Önkoşullanma aracılığıyla hNPCs terapötik yararları çoğaltmak. Bu kök hücre teslim teknik ilk adımda electroplating bir yaklaşım2,16kullanarak bir iletken iskele gelişmedir. İskele Biyouyumluluk karakterize ve elektrik Önkoşullanma özellikleri hNPCs ile optimize edilmiştir. Denetimleri bir doku kültürü plaka üzerinde yetiştirilen unstimulated kök hücre olarak tanımlanmış.
Çeşitli voltaj elektriksel stimülasyon güvenliği belirlemek ve preconditioning etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için değerlendirildi. Uygulanan alanını her odasında aynı olduğundan emin olmak için birleştirilmiş odası direnci bir multimetre kullanılarak ölçüldü (Dirençleri chambers (Ohm, Ω) yaklaşık 10 kΩ ve resistivity≈3 Ωm idi). Ticari satıcıya göre kullanılan hNPCs normal kültür sistemlerinde önemli hiçbir sitotoksisite göstermiştir. hNPCs veya elektriksel stimülasyon maruz olmadan hücre canlılığı deneyleri ile lekeli (Live: yeşil; Ölü: kırmızı) (Şekil 2). Bu sonuçlar hNPCs elektriksel stimülasyon (±400 mV, 1 h için 100 Hz) sonra uygun olduğunu gösterir. Hücre canlılığı tahlil doğrulamak için test hücre canlılığı resazurin tahlil kullanarak gerçekleştirilen. Sonuçları da hNPCs üzerinde elektriksel stimülasyon yok önemli sitotoksisite göstermektedir.
Bizim önceki vivo içinde veri parakrin faktörler bir maruz kalma elektrik stimülasyonu ile hNPCs (SD56, embriyonik kök hücrelerden türetilmiş NPCs) serbest vuruş2sonra kurtarma geliştirmek gösterdi. Daha fazla hNPC (Biyomedikal Aruna embriyonik kök hücrelerden türetilmiş NPCs) üzerinden yayımlanan inme kurtarma önemli olduğu bilinen aday faktörler keşfetmek için BDNF ve THBS-1 değerlendirildi. Bu faktörler nedeniyle rolünü nöronal yapılan kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve hücre-hücre etkileşimleri17,18' artırın. BDNF ve THBS-1 transcriptome değişiklikler üzerinde elektriksel stimülasyon etkinliğini araştırmak için qRT-PCR ile GAPDH bir temizlik gen olarak BDNF ve THBS-1 gen dahil olmak üzere gerçekleştirildi. Toplam RNA'ın yaklaşık 1 µg cDNA üreticinin protokolüne göre içine ters transkripsiyonu. Normalleştirilmiş kat-değişim oranları gen ekspresyonu PPy üzerinde hNPCs ve PPy üzerinde hNPCs bir maruz kalma elektrik stimülasyonu ile karşılaştırma ΔΔCt yöntemi ile hesaplanmıştır. İstatistiksel analiz BDNF ve THBS-1 gen ekspresyonu elektriksel stimülasyon bağımlı (p ≤0.01) olan gruplar arasında önemli upregulations gösterdi (şekil 3). Bu veriler bu optimizasyon önemli hücre ölümü olmadan hNPC etkinliğini en üst düzeye çıkarmak mümkün olduğunu göstermektedir.
Resim 1 . Vitro iletken polimer iskele sistemi elektrik stimülasyonu için. (A) bir slayt odası PPy plaka üstüne yerleştirilir. (B) şematik vitro elektriksel stimülasyon odası imalatı PPy yüzey kaplama hNPCs gösterir. Akış vanaları slayt odası, PDMS, PPy, tutun ve plaka birlikte metal için kullanılır. (C) görüntü odasının. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Hücre canlılığı tahlil hNPCs veya elektriksel stimülasyon olmadan. (A) canlı hücre gösteren çubuk grafiği lekeli Calcein-am ile. Sunulan verinin ortalama ± SD vardır; n = 4. (B) resazurin kullanarak canlılığı tahlil hücre. Çubuk grafik üzerinde hNPCs elektriksel stimülasyon yok sitotoksisite gösterir; n = 4. (C) hücre canlılığı görüntülerini elektriksel stimülasyon işlemden önce ve sonra tahlil. Kırmızı sinyal ölü hücreleri (EtHD-1) gösterir, ancak yeşil sinyal canlı hücreleri (Calcein-am) gösterir. ES elektriksel stimülasyon gösterir. ES + veya - hücreleri üzerinde elektrik stimülasyonu olup gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Gen ifade değişikliklerle elektriksel stimülasyon. BDNF (A) ve THBS1 gen ifadelerde kat değişiklikleri gösteren çubuk grafik (B) hNPCs, (** elektriksel olarak preconditioned ve tüm diğer gruplar, p arasında istatistiksel olarak anlamlı gösterir < 0,01, hata çubukları Haritayı S.D.; n = 4, tek yönlü ANOVA ). Negatif nerede hücreleri normal doku kültürü tabağa kültürlü denetimi gösterir. ES + veya - hücreleri üzerinde elektrik stimülasyonu olup gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanıt büyüyen kök hücre vaadi bir roman kontur terapi olarak göstermiştir. Bu söz kök hücre therapeutics yatağımın en az 40 tamamlanmış veya devam eden klinik çalışmalar ile ilerlemek için önemli bir çalışma sonuçlandı. Kontur patoloji çünkü akut hakaret sonra kurtarma engelleyen hiçbir nörodejeneratif işlem ödünç vermek kendisi için kök hücre tedavisi benzersiz bir nörolojik bozukluk sunmaktadır. Kök hücre gelişmiş inme kurtarma tam mekanizmasının belirsizdir. Anjiogenez, synaptogenesis ve sinaptik remodeling tüm önemli olduğu gösterilmiştir. BDNF ve THBS-1 gibi synapse oluşumu için önemli moleküller kaldırılır, inme kurtarma Engelli6,19yaşında. hNPCs fonksiyonel iyileşme çok sayıda hayvan modelleri20,21darbede sonra düzeldi. HNPCs mekanizmaları tam olarak anlaşılır kalır etkisi ve bu hücreler için ideal Teslimat yöntemi bilinmiyor. Bir hNPCs yayımlanan önemli moleküller işlemek izin veren bir sistem geliştirerek, bir integral kurtarma mekanizmaları ayırt etmek ve kök hücre tedavisi en iyi duruma getirmek yardımcı olabilir.
Başarılı hücre teslim beyin için bir meydan okuma olarak kalır. Şu anda, bir dizi teknolojilere kök hücreleri hayatta kalma ve entegrasyon kök hücre9,10artırmak için teslim etmek için farklı biomaterial İskele sistemleri kullanılarak geliştirilmiştir. Ancak, bu malzemelerin etkisiz özellikleri nedeniyle, kök hücre onların nakli sonra modüle zordur.
Bu makalede, elektrikle hNPCs transcriptome BDNF ve THBS-1 upregulation bizim qRT-PCR veri tarafından gösterildiği gibi işlemek için bir PPy iskele kullanarak bir yöntem. Bizim önceki çalışmada elektriksel stimülasyon maruz kaldıktan sonra VEGFA ifade hNPCs üzerinde bir artış fonksiyonel iyileşme kontur2sonra geliştirilmiş ortaya. Burada biz BDNF ve THBS-1 de bir farklı hNPC hücre satırı elektriksel stimülasyon maruz kaldıktan sonra sistemimiz çok sayıda hücre hatları ile kullanılabilir gösterilen modülasyonlu gibi o ek Nörotrofik faktörler göstermek.
Vitro elektriksel stimülasyon odası imalatı sırasında metal tel tamamen gümüş boya ve epoksi kullanarak PPy plakasına bağlı olduğu önemlidir. Bu bağlantı ses ise, hatta aynı değiştirgelerle değişen elektrik alanlar neden olur. Ayrıca, zaman zaman medya iskele sistemi derleme sonra sızıntı. Bu sorunu gidermek için PDMS ve PPy plaka itina ile hücre tohum yüzeye uygulamamayı arasındaki boşluğu kapatmak için vakum yağ uygulanabilir. Bir saydam olmayan yapısı nedeniyle PPy plaka hücrelerin confluency standart ışık mikroskobu ile kontrol sınırlı olduğunu kısıtlamasıdır.
Bu protokol için açıklanan yöntemin avantajı hNPCs modülasyon için hücrelerin mekanik değişiklikleri belirlemek için izin verir. Şu anda, elektrik modülasyon konvansiyonel hidrojel veya inert İskele sistemleri kullanarak yaklaştı olmuştu değil. PPy iskele kullanarak elektriksel stimülasyon sonra hNPCs in vivo modeline polimer yüzey kaldırma olmadan teslim edilebilir. Daha fazla hastalık modelleri kök hücre uygulamaları çalışma yöntemleri geliştirme bize translasyonel uygulamalar için daha iyi tasarım sağlar. İletken polimer sistem tarafından mümkün kılan elektrik preconditioning yaklaşım, farklı hücre tipleri için uygulanabilir ve bir hücre elektriksel stimülasyon etkisini daha iyi anlamak için sağlar. Hücreleri vitro optimize etmek ve daha sonra işleme (örneğin, passaging veya kaldırma) daha fazla yeteneği in vivo hastalık durumlarında inme gibi bu vitro manipülasyonlar test etmek için izin verir. Nihai amacı kontur therapeutics ilerlemek ve inme kurtarma mekanizmaları anlayış geliştirmek için açıklanan iletken polimer iskele gibi yeni teknikleri kullanmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar yok bu iş ile bildirmek için çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Dr. Kati Andreasson (Nöroloji ve nörolojik bilimler, Stanford Üniversitesi) qRT-PCR makinesi kullanımı için teşekkür ederiz. İş Ulusal kurumları K08NS098876 sağlık hibe (için P.M.G.) ve Stanford Tıp Fakültesi Dekan'ın doktora sonrası bursu (için Bo) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 20 ng/mL for working media |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 dilution |
| LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10 ng/mL for working media |
| Sylgard 184 silicone 3.9 kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA56-4 | |
| Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| Sodium dodecylbenzenesulfonate | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | Protect pyrrole solution from light and room temperature |
| 8 well glass slide chambers | Thermo Sci Nuc | 125658 | Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions |
| Flat-Surface Bracket, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | Electron Microscopy Sciences | 1264214 | Mix two parts (1:1) in plastic plate |
| DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red | Genesse | 25-508C | |
| AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| Multimeter | Keysight | E3641A | |
| Wavefoam generator | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt meshes | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | Reference electrode with dimensions, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | Thermo Fisher Scientific | Hs02718934_s1 | |
| THBS1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00962908_m1 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02758991_g1 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | |
| QIAshredder (250) | Qiagen | 79656 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns | BIORAD | 1708891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4369510 | |
| 7-8 Week Old, male, RNU Rats | NCI-Frederick | ||
| 4-0 Ethicon Silk Suture | eSutures.com | 683G | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Surgicel Original Absorbable Hemostat | Ethicon | 1952 | |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat | Stoelting | 51600 | |
| Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves | Fisherbrand | 19-063-130 | |
| Sterile Drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern Scalpel Blade Series 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting Hook | Harvard Apparatus | 52-2706 |
References
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- George, P. M., et al. Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery. Biomaterials. 142, 31-40 (2017).
- Steinberg, G. K., et al. Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study. Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).
- George, P. M., Steinberg, G. K. Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
- Schabitz, W. R., et al. Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis. Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).
- Liauw, J., et al. Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).
- Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype. Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).
- Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
- Ballios, B. G., et al. A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation. Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).
- Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel. Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).
- Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. Implant Biomaterials: A Comprehensive Review. World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).
- Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair. Front Hum Neurosci. 9, (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Abdelwahid, E., et al. Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair. Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).
- Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- George, P. M., et al. Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics. Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).
- Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells. J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).
- Lopes, N., et al. Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling. Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).
- Ploughman, M., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats. Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).
- Baker, E. W., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model. Sci Rep. 7 (1), 10075 (2017).
- Bacigaluppi, M., et al. Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes. J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).
