Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية متسلسلة

Published: September 12, 2018 doi: 10.3791/57373
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Department of Biology and Earth Science, Biochemistry and Molecular Biology Program, Otterbein University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

Summary

هنا نقدم البروتوكولات للمبتدئ الباحثين لبدء فينوتيبينج لجنس البكتيرية الهامة عقاقيري متسلسلة.

Abstract

ستريبتوميسيتيس هي بكتيريا التربة الخيطية المنتمين للأسرة في اللغات أكتينوباكتيريا التي يتم العثور عليها في جميع أنحاء العالم، وتنتج مجموعة واسعة من المضادات الحيوية وغيرها من نواتج الأيض الثانوية. وهو كويليكولور متسلسلة نوع تتسم جيدا، غير ممرضة قابلة لمجموعة متنوعة من التحليلات في المختبر. استخدام phenotyping الأساليب الموصوفة هنا كويليكولور س. كطراز ستريبتومايسيت؛ الأساليب غير المنطبقة على جميع أعضاء هذا جنس كبيرة، فضلا عن بعض أكتينوميسيتيس ارتباطاً وثيقا. فينوتيبينج ضروري لوصف الأنواع الجديدة من متسلسلة محددة في البيئة، وأيضا خطوة أولى حيوية في وصف سلالات متحولة المعزولة حديثا من متسلسلة. إجادة اللغة فينوتيبينج مهم للباحثين الجديد العديد من الذين يدخلون ميدان بحوث متسلسلة ، الذي يتضمن دراسة التنمية البكتيرية وانقسام الخلية والعزل الصبغي ورسول الثاني يشير إلى. Crowdsourcing مؤخرا من اكتشاف المضادات الحيوية من خلال عزل جراثيم التربة الجديدة قد أدى ازدياد حاجة إلى التدريب في فينوتيبينج للمعلمين الجديدة في مجال بحوث متسلسلة وكلية أو مدرسة ثانوية الطلاب. ويصف هذه المخطوطة أساليب إكثار السلالة البكتيرية وتخزينها، وتوصيف من خلال الفحص المجهري والبصرية. بعد قراءة هذه المادة، الباحثين جديدة (مختبرات تعليم علم الأحياء المجهرية والعلماء مواطن) ينبغي أن تكون قادرة على التعامل مع الضغوط متسلسلة وتبدأ التجارب البصرية توصيف.

Introduction

ستريبتوميسيتيس بكتيريا التربة إيجابية والخيطية معروفة بقدرتها على إنتاج مجموعة متنوعة من نواتج الأيض الثانوية، بما في ذلك ما يزيد على ثلثي المضادات الحيوية المتاحة تجارياً، كذلك كما المضادة للورم، العقاقير المضادة فيروس نقص المناعة البشرية، ومكافحة الطفيليات 1. س. كويليكولور هو العضو الأكثر وراثيا تتسم2،جنس3 والأنواع المستخدمة في الأساليب الموصوفة هنا. وقد س. كويليكولور دورة الحياة معقدة التي تبدأ الإنبات بوغ مفرد، تتقدم إلى الميسليوم الخضري واسعة النطاق، والتفريع ينمو في المتوسط أجار. كما تمضي حياتها، تتشكل خيوط الجوي كسر التوتر السطحي من الميسليوم الركيزة، وأخيراً تنقسم إلى سلاسل طويلة من الخلايا التي يتم تحويلها في نهاية المطاف إلى أبواغ ناضجة، مصطبغة غراي. تشتت هذه الجراثيم شكلت حديثا يشكل بداية دورة الحياة المقبلة4.

بسبب نمط معقد من التمايز، كويليكولور س. يقدم نموذجا ممتازا لدراسة التطور الجرثومي. تاريخيا، الطفرات تؤدي إلى كتل اثنين المراحل الرئيسية للتنمية وتتمخض تعمل بصرية متميزة. يتم حظر طفرات (أصلع) bld لتشكيل الميسليوم الجوي وتؤدي إلى عدم وجود الميسليوم جوي غامض إضفاء مظهر مستعمرة "أصلع". تحول دون طفرات في تشكيل بوغ ونضوج يشار إليها كطفرات مبادرة الخوذ البيضاء (أبيض) نظراً لأنها تفشل عادة لإنتاج مستويات البرية من نوع من الصباغ سبور رمادي والميسليوم الجوي لا تزال بيضاء. يتم تثبيط طفرات أخرى مثيرة للاهتمام في إنتاج المضادات الحيوية، انقسام الخلية، والعزل الصبغي أو غيرها من العمليات الهامة54،.

وعلى الرغم من اكتشاف العديد من الجينات التنموية في الأنواع متسلسلة ، هناك العديد من أكثر يعتقد أنها موجودة استناداً إلى عدم تشبع شاشات المسخ. مختبراتنا مواصلة تحديد الجينات الإنمائية الجديدة باستخدام نظام ينقول المصغر بأننا قد شيدت. رواية سلالات متحولة معزولة في تجارب عشوائية الطفرات مع لدينا ينقول الخضوع للفحص المظهرية تحديد الدور المحتمل لكل اكتشاف الجينات الجديدة6،7. أساليب فينوتيبينج البكتيرية الموصوفة هنا ذات الصلة بطفرات متسلسلة معزول بواسطة ينقول الطفرات8،،من910،،من1112، 13 وغيرها من الأساليب العشوائية، مثل المواد الكيميائية والبنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الطفرات14، فضلا عن تشييد الموجه الطفرات مثل الحذف الجينات باستخدام ريكومبينيرينج15،16 أو تحرير التكنولوجيا17،،من1819 والطفرات20الجينوم كريسبر-Cas9 (تجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر).

وعندما تصبح المقاومة للمضادات الحيوية بين مسببات الأمراض أكثر انتشارا، تصبح الحاجة إلى المضادات الحيوية الجديدة يزداد إلحاحا21،22. "المبادرة العالمية الصغيرة" (أو مؤسسة) هو العلم والتكنولوجيا، والهندسة والرياضيات (الجذعية) فعالية التعلم23 والبحوث الاستراتيجية24 لمكافحة المقاومة للمضادات الحيوية من خلال crowdsourcing من طلاب الجامعات، وأكثر مؤخرا من طلاب المدارس الثانوية. دعم دورات العمل ويتضمن تحديد جراثيم التربة الجديدة التي تنتج رواية المضادات الحيوية (http://www.smallworldinitiative.org). ويعتقد أن مصدرا رئيسيا للمضادات الحيوية غير المكتشفة سوف تستمر لتكون متسلسلة الأنواع الموجودة في مجموعة واسعة من التربة والمياه الموائل25،،من2627،28، ،من 2931. مؤخرا، اكتشف المختبر وعمل الآخرين وتتميز الإشارات الجينات في متسلسلة من الأنواع التي تنظم مورفولوجيا والتنمية، بما في ذلك إنتاج المضادات الحيوية7،32، 33. التغييرات في هذه الجينات يؤدي إلى تغيير في مقدار وتوقيت للمضادات الحيوية التي تنتجها. سيظل فينوتيبينج المهرة من الأنواع الجديدة وطفرات جديدة منتجة للمضادات الحيوية الهامة. جديد من المعلمين والطلاب أصبحت المساهمين الرئيسيين في مجال اكتشاف الأدوية، التدريب في فينوتيبينج البكتيرية أمر ضروري لنجاح هؤلاء الأفراد المبتدئين. وعلاوة على ذلك، هذه التجارب أصعب للمدرسة الثانوية الجذعية أو جامعة الميكروبيولوجيا مختبرات التعليم. وهي تمثل تظاهرة مبادئ الجينية الميكروبية الأساسية في مختبر تدريس الإعداد.

Protocol

1-إعداد الصكوك ووسائط الثقافة والحلول وأطباق بيتري

  1. اﻷوتوكﻻف المسواك في كوب 50 مل مغطاة برقائق الألومنيوم لإبقاء العقيمة.
  2. تعقيم جميع البضائع الجافة التي سيتم استخدامها (نصائح، والعصي، والأواني الزجاجية، إلخ) في اﻷوتوكﻻف.
    ملاحظة: تنبيه! اتبع جميع توجيهات السلامة لنموذج اﻷوتوكﻻف المستخدمة. أجهزة اﻷوتوكﻻف خطرا للتفجيرات، وحروق من البخار والاتصال مع الأسطح الساخنة والمواد ووسائل الإعلام. لسلامة اﻷوتوكﻻف، قم بعرض "الاستخدام السليم لأجهزة اﻷوتوكﻻف"34.
  3. إعداد MS أجار (دقيق فول الصويا المانيتول (SFM))14 -تنمو الثقافات.
    1. إضافة 5 غ من دقيق الصويا و 5 غ من أجار إلى قارورة 1 لتر.
    2. حل 5 غ المانيتول في 250 مل ماء الصنبور والاستغناء عن في قارورة تحتوي على دقيق الصويا واجار.
    3. إضافة التوصيل الرغوة وإحباط لفتح قارورة والاوتوكلاف في 121 درجة مئوية، 15 رطل/بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
      تنبيه: تتلخص هذه الوسيلة بسهولة. استخدام قارورة التي يمكن أن تعقد على الأقل أربع مرات الحجم الفعلي لمرض التصلب العصبي المتعدد أجار يجري يعقم. يمكن استخدام طنجرة ضغط قياسي بدلاً من اﻷوتوكﻻف مع اعتبارات السلامة مماثلة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام فرن الميكروويف تعقيم وسائط الإعلام والمواد إذا لم يكن الوصول إلى اﻷوتوكﻻف ممكن35،36. مدرسي المدارس الثانوية قد ترغب أيضا في التعاون مع الكليات المحلية أو الجامعات الوصول إلى إمدادات يعقم.
    4. وسائط باردة حتى مريحة بما يكفي للتعامل. كن حذراً لا بارد لفترة طويلة جداً لأن أجار يتصلب في درجة حرارة أقل من 50 درجة مئوية.
    5. صب أجار مرض التصلب العصبي المتعدد من قارورة في أطباق بتري معقمة حتى أسفل كل طبق بيتري تقريبا نصف كاملة (حوالي 25 مل من وسائل الإعلام كل طبق بيتري). واسمحوا أن يصلب قبل استخدام لوحات أجار. تخزين لوحات أجار في كيس من بلاستيك في درجة حرارة الغرفة حتى المطلوبة.
      ملاحظة: لوحات أجار قد أيضا تكون مخزنة في ثلاجة، خاصة إذا كان هناك حاجة للمضادات الحيوية في وسائل الإعلام.

2-خط متسلسلة على لوحات للنشر

  1. سلالات متسلسلة متواصلة على لوحات أجار MS للمستعمرات واحدة باستخدام أسلوب قياسي، مثل رباعي خط الأسلوب كما هو موضح في ساندرز، 201237.
    ملاحظة: كما يمكن حلقة إينوكولاتينج أو المسواك العقيمة. اختياري: يشيع استخدام وسائل الإعلام الأخرى للأنواع متسلسلة ، مثل R2YE، والحد الأدنى من وسائل الإعلام14.
  2. احتضان لوحات في 30 درجة مئوية.
  3. ريستريك لوحات بانتقاء مستعمرة واحدة كل 4 – 6 أيام. كمستعمرات العمر يصبحون عرضه للطفرات العشوائية.

3. إنشاء مخزون Mycelial والغليسيرول لتخزين البكتيرية

ملاحظة: قد إنشاء مخزون Mycelial لجميع سلالات متسلسلة ، بما في ذلك مبادرة الخوذ البيضاء وسلالات bld ، وطفرات الإنمائية الأخرى التي غير قادر على إكمال تبوغ.

  1. مسرات المستعمرات 15 – 20 في 200 – 500 ميليلتر من الجلسرين 20% استخدام قضيب وتد خشبي عقيمة.
  2. نقل الملاط متعطنين المستعمرات إلى أنبوب ثقافة الثلاجة 1.5 مل، باستخدام ميكروبيبيتي أو ماصة نقل العقيمة.
    ملاحظة: يتم تغطية أساسيات استخدام ميكروبيبيتي في أماكن أخرى38.
  3. إضافة والغليسيرول 20% ما يكفي لجعل وحدة التخزين النهائي 1 مل وتخلط برفق. تخزين العينات في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تنبيه! استخدام قفازات السلامة المبردة ومعطف مختبر لحماية الجلد من الاتصال مع البرد القارس. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام ثلاجة-20 درجة مئوية مع انخفاض محتمل في وقت التخزين طويل الأجل. تجنب الإفراط تجميد والغاء تمديد صلاحية.

4-إنشاء مخزون بوغ والغليسيرول لسلالات قادرة على تبوغ

ملاحظة: مخزونات بوغ هي الأفضل للاستمرار على المدى الطويل ولكن فقط قابلة للتنفيذ لسلالات قادرة على إكمال تبوغ.

  1. نشر 100 ميليلتر المواد متعطنين (من الخطوة 3.1) على صفيحة أجار للحصول على حشيش المتلاقية النمو37.
    ملاحظة: يظهر انتشار الطلاء في ساندرز37 (تعديل: الدوار غير مطلوب.). اللوحة يمكن أن تحول يد واحدة أثناء استخدام اليد الأخرى للتحرك الناشرة في لطيف ذهابا وإيابا الحركة عبر وسائل الإعلام أجار.
    1. بيبيت 100 ميليلتر من متعطنين الميسليوم إلى مركز صفيحة أجار مرض التصلب العصبي المتعدد.
    2. تعقيم الزجاج أو المعدن نشر أداة جزئيا غمر في الإيثانول 70% وتمرير الناشرة مرة واحدة ببطء من خلال لهب موقد بنسن لسرعة التبخر الإيثانول.
      تنبيه: الإيثانول من الاشتعال. لا تضع الناشرة المشتعلة في الإيثانول أو السماح بهبوط المشتعلة من الإيثانول إلى الوقوع في الطبق الإيثانول. بدلاً من ذلك، استخدم مسحه القطن معقمة المتاح لانتشار البكتيريا على اللوحة، التي لا تتطلب أي الإيثانول أو لهب.
    3. دورة أجار MS لوحة مع يد واحدة، بينما استخدام نسخة احتياطية والحركة المنصوص عليها لتطعيم اللوحة مع الناشرة العقيمة.
    4. احتضان لمدة 5-7 أيام عند 30 درجة مئوية حتى تصبح السلالة sporulated جيدا.
      ملاحظة: سوف تختلف أوقات الحضانة تبعاً للأنواع والسلالة.
  2. إضافة 2 مل من المحلول الملحي المعقم (0.8% كلوريد الصوديوم) إلى مركز المتلاقية حشيش متسلسلة الخلايا التي مرت بها تبوغ.
  3. حصاد جراثيم بلطف فرك سطح الميسليوم مع عقيمة تطعيم حلقة (أو برعم القطن)، ببطء التحرك نحو حافة العشب.
  4. بيبيت المالحة التي تحتوي على الجراثيم في أنبوب مخروطي 15 مل. دوامة قوة لاقتحام سلاسل سبور الخلايا الفردية.
  5. الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 2,500 تقريبا x ز.
  6. بيبيت المادة طافية وتجاهل. تفريق بيليه بوغ بالانفعالات دوامة قوية في كمية صغيرة من السائل المتبقي.
  7. ريسوسبيند الجراثيم في 1 مل الجلسرين 20% برسم الحل صعودا وهبوطاً مع ماصة.
  8. نقل المخزون بوغ والغليسيرول لأنبوب الثلاجة 1.5 مل. مخزن في-80 درجة مئوية.
    تحذير: استخدام قفازات السلامة المبردة ومعطف مختبر لحماية الجلد من الاتصال مع البرد القارس. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام ثلاجة-20 درجة مئوية مع تخفيض محتمل للبقاء في وقت التخزين طويل الأجل. تجنب الإفراط تجميد والغاء تمديد صلاحية.

5-تؤدي الطفرات

  1. تؤدي الطفرات استناداً إلى النتائج المرجوة المشار إليها في مقدمة واستعرضتها مؤخرا بالتز، 201639.
    ملاحظة: لن تحتاج بعض التجارب phenotyping الطفرات، مثل النية في التعرف على أنواع جديدة من البيئة. وتشمل أساليب الطفرات العشوائية استخدام الأشعة فوق البنفسجية، ينقول8،،من910،11،،من1213أو14من المواد الكيميائية. موقع الموجه الطفرات15،،من1617،،من1819،20 تقنيات يمكن استخدامها لخلق طفرات نقطة محددة، الحذف، أو أنواع أخرى من الطفرات.

6-مقارنة وتسجيل المظهر المرئي

  1. يحيط علما مورفولوجيا مستعمرة لكل متحولة بالمقارنة مع سلالة البرية من نوع الأصل بعد streaking جميع سلالات كما في الخطوة 2. قارن عزل جديدة للأنواع المدروسة جيدا، مثل كويليكولور س أو س. فينيزويلاي، عندما وصف أنواع متسلسلة جديدة. ملاحظة الخصائص (الشكل 1) مثل الشكل الأساسي، السطحية من مستعمرة (غامض، أصلع، التجاعيد، إلخ)، العتامة، والارتفاع وتصبغ (التمييز بين الخضري الميسليوم والميسليوم الجوية المتوسطة المحيطة بها).
  2. قم بتسمية أجار مرض التصلب العصبي المتعدد السلالات البرية من نوع ومتحولة لوحة والانتصارات في أنماط آسفين (الشكل 1). كن حذراً من أن يمس لا سلالة سلالة أخرى لتجنب التلوث المتبادل. ملاحظة التاريخ والوقت التي هي السنة اللهب أثناء الضغوط على اللوحة. احتضان اللوحات في 30 درجة مئوية.
  3. مكان نمت أطباق بيتري الملونة أو ورق أبيض مجانسة الخلفية. الكتابة على الورق اسم السلالة، والتاريخ ودرجة حرارة الحضانة، والوقت من أول لوحة streaking. تأخذ الرقمية صورة (ق) من اللوحة المعلومات الأخيرة مكتوب على خلفية الورقة بحيث يتم تصغير الارتباك.
    ملاحظة: الكتابة يمكن اقتصاص من الصورة في وقت لاحق إذا كان يمكن استخدامها لإعداد الشكل.

7-إجراء الفحص المجهري مرحلة التباين

  1. تعقيم ملاقط الغسيل في الإيثانول 70% وثم يمر لهب موقد بنسن تتبخر في الإيثانول. السماح لتبرد.
  2. تعقيم كوفيرسليبس بالغسيل في الإيثانول 70% ومن ثم السماح لهم الجافة في طبق بتري معقم.
  3. إعداد رفع ساترة للنمو الجرثومي لفحصها.
    1. تلتقط ساترة عقيمة مع ملاقط معقمة ومكان ساترة على صفيحة أجار مرض التصلب العصبي المتعدد التي يكون فيها النمو البكتيرية كثيفة. اضغط على الجزء الخلفي ساترة بلطف مع ملاقط لضمان نقل كافية من الجراثيم البكتيرية وجوي الميسليوم.
  4. التقاط ساترة من اللوحة ووضعه حيث تواجه الجانب مع مواد الخلية نحو سطح شريحة المجهر، مع انخفاض 15 ميليلتر من والغليسيرول 50% أعدت في المياه للتركيب. تقليل فقاعات الهواء عن طريق وضع ساترة بزاوية 45° إلى الشريحة والسماح لها تقع على والغليسيرول 50%.
  5. (اختياري) الختم مع مسح الأظافر للمحافظة على الشريحة.
  6. إجراء الفحص المجهري التباين المرحلة كما وصفها فروهليش40 في فترات زمنية مختلفة خلال دورات الحياة.
    ملاحظة: يسمح التصوير المتكرر لإجراء تحليل أكثر اكتمالا والقدرة على الكشف عن حالات التأخير في عملية التنمية. كرر الملاحظات التأكد من دقتها وإمكانية تكرار نتائج بشكل مستقل.
    1. ضع الشريحة المعدة في مرحلة مجهر وإضافة قطره زيت الغمر إلى مركز بكشف الغطاء. قم بتدوير المرحلة X 100 الهدف في مكان وتعيين البرج مكثف للإعداد المرحلة "مطابقة" الصحيح. وتركز الصورة باستخدام مقبض تسوية غرامة فقط بمجرد العدسة الهدف على اتصال النفط.
    2. دراسة عدة حقول النظر تمييز اختلافات ملحوظة واتساقا بين سلالات متحولة ونوع البرية، مثل القدرة على شكل جراثيم وبوغ الحجم والشكل والعدد الكلي للجراثيم (انظر الشكل 2).
      ملاحظة: تشمل البدائل للتباين مرحلة الفحص المجهري تدخل فرق التباين (DIC) مجهرية40 وتقنيات المصبوغة بسيطة لاستخدامه مع الحقل مشرق مجاهر41، مثل صبغة الكريستال البنفسجي.

8-إجراء الفحص المجهري الأسفار

  1. تعقيم الملقط بالغسيل في الإيثانول 70% ومن ثم تشغيل عن طريق لهب موقد بنسن.
  2. تلتقط ساترة عقيمة مع ملاقط معقمة ومكان على صفيحة أجار MS حيث يتجلى النمو الجرثومي. لمس الجزء الخلفي من ساترة بلطف مع ملاقط لضمان نقل كافية من الجراثيم البكتيرية وخيوط الجوي.
  3. التقاط ساترة من اللوحة ووضعه حيث تواجه الجانب مع مواد الخلية، على البطاقات لسهولة التلاعب ساترة.
  4. الفيضانات في ساترة مع الميثانول المثلج (~ 300 ميليلتر ساترة2 20 x 20 مم) والسماح لها تماما من الهواء الجاف.
    تنبيه: من الميثانول مطفر. تجنب الاتصال المباشر مع الجلد.
  5. أغسل ساترة ثلاث مرات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)42 قبل صرفها بلطف وإزالة الحل.
  6. إضافة 15 ميليلتر من 100 ميكروغرام/مل يوديد Propidium و/أو مترافق 10 ميكروغرام/مل القمح-جرثومة-أجلوتينين إلى fluorescein isothiocyanate (WGA-فيتك) قدم في الجلسرين 50% على شريحة مجهر مسمى.
    ملاحظة: يوديد Propidium بقع الحمض النووي الحمراء للكشف عن الكروموسومات الحمض النووي الموقع بينما فيتك وغ البقع الخلية جدار أخضر.
  7. عكس ساترة الوجه للأسفل على قطره من الفلورسنت وصمة عار على الشريحة الزجاجية. (اختيارياً) ختم مع طلاء الأظافر واضحة للحفاظ على الشريحة.  كما الصبغات حساسة للضوء، احتضان لمدة 15 دقيقة في غرفة مظلمة أو الخافتة.
  8. مراقبة الشرائح تحت عدسة هدف X 100 استخدام مرحلة التباين أو المجهر DIC مجهزة ابيفلوريسسينسي الإثارة مكعبات يوديد propidium (تعيين عامل التصفية 'تكساس الأحمر' أو ماكسيما الإثارة/الانبعاثات نانومتر 535/617) وفيتك (فيتك تصفية مجموعة أو 490/525 نانومتر ماكسيما الإثارة/الانبعاثات).
  9. ضع الشريحة على خشبة المسرح والتركيز باستخدام المقابض التكيف الخشنة وغرامة.
  10. مراقبة الأسفار كما هو موضح في مكان آخر من43.
  11. استخدام حزمة برامج تحليل صور حرة التي يمكن أن تساعد في التعرف على الجراثيم مع انخفاض كثافة fluorescence44.

Representative Results

تجارب phenotyping الأولية اللازمة لوصف أنواع جديدة وسلالات ويمكن استخدامها كنهج المجاملة للسلالات وتجارب التهجين الحمض النووي الحمض النووي التي يتم استخدامها لوصف الأنواع الجديدة. طفرات متسلسلة الناتجة عن الطفرات العشوائية في أساليب مثل الكيميائية والأشعة فوق البنفسجية، أو يتم تحديد الطفرات ينقول عادة من خلال الشاشات المرئية المباشرة، وعلى لوحات أجار. ويتم فحص المستعمرات من متسلسلة للتغييرات في النمط الظاهري بالمقارنة مع سلالة البرية من نوع، والوالدين. على سبيل المثال، الميسليوم جوي ملونة أخف قد تشير إلى مستوى أقل من الصبغة الرمادية الناجمة عن عيب في تبوغ، أو الافتقار إلى مظهر غامض إرشادي لكتلة في تشكيل الميسليوم الجوي (الشكل 1). ستريبتوميسيتيس العديد من إنتاج المضادات الحيوية المصطبغة في الميسليوم الخضري أو أجار المحيطة بها. كويليكولور س. ينتج اثنين من المضادات الحيوية المصطبغة فضلا عن اثنين منها غير مصطبغة. أكتينورهودين مضاد حيوي مصطبغة الأزرق وهو أونديسيلبروديجيوسين المضادات الحيوية مصطبغة أحمر45. ثم يتم نشر السلالات التي مرت بشاشات مستعمرة البصرية الأولية من streaking للمستعمرات واحدة.

بعد تحديد هوية بصرية يحتمل أن تكون مثيرة للاهتمام طفرات، سلالات تخضع للفحص المجهري. المرحلة--تباين مجهرية مناسبة خاصة لدراسة طفرات متسلسلة لعيوب الإنمائية، باستخدام سلالة البرية من نوع كعنصر تحكم (الشكل 2). عادة إنتاج نوع البرية كويليكولور س. المستعمرات الميسليوم جوي قبل حوالي يومين نمو عند 30 درجة مئوية في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد، وسلاسل طويلة من جراثيم قبل ثلاثة أيام نمو. وسوف تقدم دورة الحياة قليلاً أبطأ أو أسرع في أنواع أخرى من وسائل الإعلام. من الضروري أن يتم تحليلها طفرات ظروف النمو نفسه كنوع البرية عند استخلاص النتائج بشأن العيوب التنموية والتأخير. قد تنتج طفرات أصلع جراثيم بعد النمو المطولة في أجار وسائط الإعلام. فئة من طفرات يشار إلى طفرات الأبيض قد تتأخر أما لتشكيل بوغ، تشير إلى انخفاض في وفرة الجراثيم المنتجة، إنتاج جراثيم بعيوب الشكل و/أو الحجم، أو ببساطة إنتاج مستويات أدنى من الصباغ بوغ ناضجة، والرمادي46 . قد يتأخر طفرات أخرى التحقيق فيها حتى الآن أو تسارع في تطور دورة الحياة مثل طفرات المتأثرة لتراكم إشارات الجزيئات (مثلاً، GMP دي دوري47).

متابعة بسيطة لتقنية مجهرية الخفيفة الموصوفة أعلاه مجهرية الفلورية استخدام يوديد propidium وصمة عار الصبغية الحمض النووي نوكليويدس وجنين القمح فلوريسسينتلي المسمى أجلوتينين بوصمة عار جدار الخلية سيتا تبوغ. الجراثيم التي تفتقر إلى كروموسوم ستكون خالية من يوديد propidium الأحمر تلطيخ، بينما الجراثيم التي تحتوي على الحمض النووي أقل من المعتاد ويمكن تحديد إذا كان يبدو أنها قد انخفضت تلطيخ (الشكل 3). يمكن أن تستخدم أجلوتينين جرثومة القمح وصمة عار جدار الخلية ويمكن ملاحظة الاختلافات في جدار الخلية تلطيخ أنماط (أي، عيوب انقسام الخلية). في سلالة الرقم 4 البرية من النوع من أنواع المستخدمة مؤخرا كنموذج آخر من س. فينيزويلاي، ستريبتومايسيت بسبب سرعة دورة الحياة والقدرة على سبورولاتي في45من السائل، قد تم ملطخة إلى فيتك وغ توضيح صفيف مثل سلم سيبتا الشعبة التي ينظر إليها عادة وقت مبكر خلال تبوغ.

استراتيجيات phenotyping الأولى الموصوفة هنا ينبغي أن يسفر عن ما يلي: 1) تحديد سلالات متحولة من اهتمام لمزيد من الدراسة؛ 2) اكتساب المعارف حول المسخ المحددة حديثا والدور المحتمل للجينات التي قد تم تحور؛ 3) بوضع سلسلة لاحقة من الخطوات التجريبية التالية التي يمكن استخدامها لزيادة توضيح دور الجينات في السؤال. في حالة ستريبتومايسيت محددة حديثا من البيئة، الباحث سوف اكتساب المعرفة للأنواع الجديدة المحتملة مقارنة بالفعل تتميز الأنواع من متسلسلة.

Figure 1
الشكل 1: صورة فوتوغرافية للوحة أجار الممثل يدل تعمل مستعمرة عيانية من س. كويليكولور. لوحة أجار يبين غامض، سلالة رمادية المظهر المرئي الميسليوم الجوي للبرية من نوع كويليكولور س. MT1110 (وزن) بالمقارنة مع طفرات الإدراج ينقول عشوائية مختلفة مع تعمل التنموية. أما تفتقر إلى طفرات الميسليوم جوي [أصلع (bld)] أو الميسليوم جوية مع انخفاض بوغ تصبغ [الأبيض (whi)]. طفرات ينقول تم إنشاؤها باستخدام Tn5 مصغرة للإدراج الطفرات6،7. السلالات كانت تزرع في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد لمدة 5 أيام في 30 درجة مئوية. طبق بيتري قطر 100 ملم.

Figure 2
الشكل 2: ميكروجرافس التباين مرحلة عرض ممثل الجوية خيوط للمسخ س. كويليكولور الأبيض سلالات ينقول العشوائية التي تحتوي على الإدراج الطفرات. (أ) تظهر هي ممثلة البري نوع خيوط جوي التي شهدت انقسامات الخلية متزامن، متباعدة بانتظام، المنتجة بالتساوي على شكل وحجم الجراثيم (MT1110). (ب–و) وتظهر اللوحات المتبقية تعمل مجهرية مختلفة إلى حد كبير من طفرات الأبيض المختلفة التي كانت معزولة عن طريق الطفرات ينقول عشوائي. تظهر لوحة ب خيوط جوية التي مرت لا تبوغ، ولكن بدلاً من ذلك قد أنتجت المناطق المنتفخة داخل الشعيرة. تشير الأسهم طويلة في ج ود، وواو إلى جراثيم طبيعي الكبيرة التي تتميز بها طفرات MIC42 و MIC43 و TH49. يشير السهم القصير في لوحة د إلى مثال من حجرة بوغ تفكيك. تظهر لوحة ه المقصورات أصغر مقيدة جزئيا التي نموذجية من سلاسل سبور تنتجها المسخ TH10. السلالات كانت تزرع في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد لمدة 5 أيام في 30 درجة مئوية. طفرات لا علاقة لها بما هو مبين في الشكل 1. بوغ نوع البرية هو حوالي 1.1 ميكرون على محور طويل. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: ميكروجرافس الممثل عرض كروموسوم متحولة كويليكولور س. تعمل التفرقة. (أ) بالرسم التخطيطي التمثيل يظهر مظهر المصبوغة البرية من نوع، ومتباعدة بشكل منتظم نموذجي لسلسلة من الجراثيم (كل بوغ تحتوي على الحمض النووي الكروموسومات) مقارنة بنمط المصبوغة المتقطع للمسخ الذي يعرض الكروموسوم عيب التفرقة. (ب) تبين كل زوج من الألواح بوغ نفس السلسلة لاحظ التباين التدخل التفاضلية (DIC) الصورة على اليسار وتظهر صورة fluorescence الملطخة يوديد propidium على الحق. تتم مقارنة النمط الظاهري البرية من نوع (، ب) هما طفرات الإدراج ينقول عشوائية (جو دال و هاء، واو). تشير الأسهم إلى جراثيم تخلو من الحمض النووي. السلالات كانت تزرع في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد لمدة 5 أيام في 30 درجة مئوية. طفرات سيظهر لا علاقة لها بتلك التي في الشكل 1 و الشكل 2. مقياس بار = 1 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: صورة مجهرية Fluorescence فنزويلا س. البرية من نوع السلالة ملطخة وغ فيتك. (A) بمخطط خيوط الجوي يظهر السلس مع لا المسافات البادئة، وأي علامات مرئية من تبوغ استخدام الفحص المجهري مرحلة التباين بالمقارنة مع صفيف مثل سلم لتلطيخ جدار الخلية التي تشير إلى مرحلة مبكرة من تبوغ بدأت في هذه الشعيرة نفس استخدام وغ فيتك تحت مجهر الأسفار. (ب) ميكروجرافس من البرية من نوع س. فينيزويلاي. () خيوط الجوي السلس موجودة بين سلاسل من الجراثيم. (ب) داخل الميسليوم يظهر في لوحة أ، أحد خيوط الجوي في مرحلة مبكرة من التنمية تمتلك مجموعة مثل سلم من ترسب جدار الخلية. تشير الأسهم إلى تشكيل متباعدة بانتظام عبر الجدران ملطخة فيتك وغ أن تطوير شكل متزامن ضمن خيوط جوي واحد كما أنه يخضع تبوغ المرتبطة تنمويا. وقد نمت السلالة على أجار MYM MYM (التوسيم، واستخراج الشرق Y، واستخراج البديل م) عن ح 38 في 30 درجة مئوية. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

نقدم هنا البروتوكولات لبداية الباحثين متسلسلة الشروع في إجراء دراسات بما في ذلك الخطوات اللازمة لنشر السلالات وإعداد الأرصدة للتخزين على المدى الطويل. ثم يصف لنا البروتوكولات لتوصيف المرئية والمجهرية من سلالات متسلسلة . بعض الخطوات الأولية النموذجية في طفرات إنمائية phenotyping: 1) الفحص البصري للمستعمرات متحولة مقارنة بنوع البرية المستعمرات في أجار المتوسطة؛ 2) مجهرية مرحلة التباين؛ و 3) الأسفار مجهرية من خيوط فطرية جوي سبوروجينيك. استناداً إلى النمط الظاهري المعروضة في هذه الخطوات الثلاث، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات زيادة تمييز النمط الظاهري لسلالة معينة.

التجارب الأولية phenotyping تستخدم عادة لوصف الأنواع الجديدة، وتحديد طفرات فائدة، وجزئياً تميز طفرات وتبدأ تبين دور نموذجي لجين معين على النمط الظاهري للمسخ التي تم تحديدها أساس. الأساليب الموصوفة هنا سبق استخدامها في المختبرات تحديد وتوصيف مجموعة متنوعة واسعة من طفرات متسلسلة ، بما في ذلك الذين يعانون من عيوب في انقسام الخلية48،49، التدريس في الجامعات 50 , 51 , 52 , 53 , 54وتبوغ55،56، الميسليوم الجوي تشكيل57،58، إنتاج المضادات الحيوية59، والثاني رسول مما يشير إلى47والعزل الصبغي 60-هذه التقنيات هي الخطوات الأولى حيوية لتحديد النمط الظاهري طفرات بشكل عام والكشف عن كمية كبيرة من معلومات هامة عن الأدوار للجينات للفائدة. الأساليب التي يمكن أن تمتد بسهولة إلى الأنواع الأخرى من متسلسلة وقد استخدمت فعلا لوصف سلالات من غريس س. س. فنزويلا، الجرب س.والعديد من ستريبتوميسيتيس الأخرى. ومن المتوقع البروتوكولات الفيديو الموضحة هنا بمثابة مورد هام للباحثين الجديد دخول مجالات بحوث متسلسلة ، كما هو الحال في مجال اكتشاف الأدوية. ويشمل ذلك المعلمين الجديدة الذين يعملون على مكافحة الأزمة المقاومة للمضادات الحيوية، وتثقيف عدد لا يحصى من الباحثين الطلاب الجامعيين الجديد الانضمام إلى جهود crowdsourcing المبادرة العالمية الصغيرة.

يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام الفصول الدراسية الكليات والمدارس الثانوية بالإضافة إلى مختبرات الأبحاث، بإدخال التعديلات المذكورة في الفيديو والنص باستخدام التقنيات الموضحة هنا. الطلاب في الوحدة نمطية مجهرية سنة أولى في كلية فنون الحرة صغيرة كانت قادرة على متتالية السلالات، والتقاط صور فوتوغرافية رقمية من السلالات التي تزرع في وسائل الإعلام أجار، وإجراء الفحص المجهري والمرحلة-على النقيض من الأسفار، التي توجت بتقديم مجموعة أرقام نصب منصة متعددة في نهاية الوحدة النمطية 3 أسابيع، يمثلون 15 ح العمل بالمعمل. حوالي 160 من طلاب السنة الأولى مسؤولة عن فينوتيبينج الأولى من 320 ينقول رواية طفرات. شارك طلاب البحوث الجامعية في المؤسسات الثلاث في فينوتيبينج الأولى من طفرات إضافية وتوصيف اللاحقة لكثير من السلالات. وتوضح البيانات الشاملة التي تم الحصول عليها في فترة قصيرة نسبيا من الزمن، قيمة البروتوكولات المذكورة هنا. تم تخزين مئات طفرات إضافية كمخزون mycelial والغليسيرول لتوصيف المستقبل.

في أعقاب التجارب الأولية الموضحة هنا، يجوز مجموعة متنوعة من الأساليب لتوسيع نوعية المعلومات المتصلة بسلالات فائدة. إذا كانت الطفرة غير معروف، وينبغي استخدام أسلوب التنميط لتحديد نوع و/أو موقع من الطفرة. على سبيل المثال، ينقول عشوائية الطفرات البرية من نوع الكروموسوم6،،من78،9،10،11،12،13 النتائج في المستعمرات التي ينبغي أن يخضع لها الأولية شاشات المظهرية مثل التي ورد وصفها أعلاه. ثم ينبغي أن تحدد موقع ينقول استخدام تقنية مثل معكوس بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (إيبكر)61. تحديد النمط الوراثي لطفرات المكتشفة حديثا خطوة هامة بعد توصيف الأولية.

وتشمل بعض أساليب متقدمة تستخدم عادة لتحليل phenotyping اللاحقة التي يمكن ذكرها في الفصول الدراسية أو استكشافها من خلال إجراء مزيد من البحوث البروتين الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) وضع علامات لتحديد أنماط الترجمة لبروتين الاهتمام، تحليل تعبير الجينات مثل الحقيقي الوقت PCR الكمي (qPCR) وأنماط التعبير الجيني العالمي البرية من نوع مقابل المسخ عبر "تسلسل الحمض النووي الريبي" (الرنا-seq). Phenotyping مهارات مطلوبة أيضا لتحليل التكامل الوراثية. في تجربة تكامل، هو عرض النسخة البرية من نوع من الجينات إلى سلالة تحور لتحديد ما إذا كان اليل المضافة حديثا يمكن أن تعوض عن فقدان الوظيفة اليل تحور. مقارنة النمط الظاهري سلالة تستكمل المسخ الأصلي والوالدين، لا بد من السلالة البرية من نوع.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يود المؤلفون الاعتراف بجامعة أوتيربين لزمالات البحث الطالب الجامعي والطلاب جوائز صندوق البحوث جفك و SGK؛ وهبت النصب التذكاري الأستاذ جيلبرت هاء ميلز أوتيربين جائزة برنامج التفرغ وقسم علم الأحياء وعلم الأرض كلية البحوث والمنح الدراسية تمنح جائزة لمجلس الطعون المشترك. ومنح جفك و SGK بيرت وجين القرن هبت طالب صندوق البحوث في مجال العلوم. الكتاب يود أيضا أن نعترف بامتنان جامعة دوكين تمول "البحوث الجامعية برنامج زمالات" جفك و SGK. طلاب البحوث الجامعية السابقة جونياتا، ريان جونسون ودريبر ليندسي ساهمت الصور مجهرية للأرقام 2 و 3، على التوالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50% Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Immersion Oil (Type DF) Cragille  16482
Lens Paper Fisherbrand 11-995
Sterile Water GeneMate G-3250-1L
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP
Toothpicks (flat) Target 081-22-1957
Pipette Tips (10 mL) GeneMate P-1240-10
Pipette Tips (200 mL) GeneMate P-1240-200Y
Pipette Tips (1,250 mL) GeneMate P-1240-1250
Wooden Applicators 6'' Solon Care 070809
Cotton Swabs Fisherbrand 23-400-124
Soy Flour  Bob's Red Mill  1516C164
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-1KG
Agar Sigma-Aldrich A1296-1KG
Glycerol 100% VWR amresco life science  0854-1L
0.8% NaCl (Saline) Sigma-Aldrich SLBB9000V
1.2 mL freezer tube NEST 606101
Ultra low (-80 °C) freezer SO-LOW U85-18
Cryo Safety Gloves Bel-Art H13201
Petri dishes  Sigma-Aldrich P5856-500EA
Cover slips #1.5 Thomas Scientific 64-0721
Slides Carolina 63-2010
Autoclave Tuttnauer 2540E
Phase-Contrast Microscope  Olympus BX40
Forceps Carolina Biological 624504
Bunsen Burner Carolina Biological 706706
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1L-R
PBS (phosphate buffer saline) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
WGA-FITC Biotium 29022-1
Clear nail polish OPI 22001009000
ImageJ NIH Free Software
100 mL beaker Pyrex USA 1000-T
1 L beaker Carolina Biological 721253
1 L flask Fisherbrand S63274
250 mL flask Pyrex USA 4980
100 mL graduated cylinder Carolina Biological 721788
500 mL graduated cylinder  Carolina Biological 721792
Stir Bar Fisher Scientific 22-271825
Centrifuge Eppendorf 5810R
Camera for Microscope Olympus DP72
Nitrile Examination Gloves (Med) Bio Excell 71011002
Vortex Mixer Carolina Biological 701077

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barka, E. A., et al. Taxonomy, physiology, and natural products of Actinobacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 1-43 (2015).
  2. Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (2), 141-147 (2002).
  3. Redenbach, M., et al. A set of ordered cosmids and a detailed genetic and physical map for the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome. Mol. Microbiol. 21 (1), 77-96 (1996).
  4. McCormick, J. R., Flardh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36 (1), 206-231 (2012).
  5. Flardh, K., Buttner, M. J. Streptomyces morphogenetics: dissecting differentiation in a filamentous bacterium. Nat. Rev. Microbiol. 7 (1), 36-49 (2009).
  6. Bennett, J. A. Molecular Genetic analysis of division and development in Streptomyces coelicolor. , Ph.D. Dissertation (2007).
  7. Hull, T. D., et al. Cyclic Di-GMP phosphodiesterases RmdA and RmdB are involved in regulating colony morphology and development in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 194 (17), 4642-4651 (2012).
  8. Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo Tn5-based transposon mutagenesis of streptomycetes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 83 (5), 979-986 (2009).
  9. Xu, Z., et al. Large-Scale Transposition Mutagenesis of Streptomyces coelicolor Identifies Hundreds of Genes Influencing Antibiotic Biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
  10. Fernandez-Martinez, L. T., et al. A transposon insertion single-gene knockout library and new ordered cosmid library for the model organism Streptomyces coelicolor A3(2). Antonie Van Leeuwenhoek. 99 (3), 515-522 (2011).
  11. Gehring, A. M., Nodwell, J. R., Beverley, S. M., Losick, R. Genomewide insertional mutagenesis in Streptomyces coelicolor reveals additional genes involved in morphological differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (17), 9642-9647 (2000).
  12. Bishop, A., Fielding, S., Dyson, P., Herron, P. Systematic insertional mutagenesis of a streptomycete genome: a link between osmoadaptation and antibiotic production. Genome Res. 14 (5), 893-900 (2004).
  13. Bilyk, B., Weber, S., Myronovskyi, M., Bilyk, O., Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo random mutagenesis of streptomycetes using mariner-based transposon Himar1. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (1), 351-359 (2013).
  14. Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. (2000).
  15. Gust, B., Kieser, T., Chater, K. F. REDIRECT technology: PCR-targeting system in Streptomyces coelicolor. , John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, United Kingdom. (2002).
  16. Gust, B., Chandra, G., Jakimowicz, D., Yuqing, T., Bruton, C. J., Chater, K. F. Lambda red-mediated genetic manipulation of antibiotic-producing Streptomyces. Adv. Appl. Microbiol. 54, 107-128 (2004).
  17. Tong, Y., Charusanti, P., Zhang, L., Weber, T., Lee, S. Y. CRISPR-Cas9 based engineering of Actinomycetal genomes. ACS Synth. Biol. 4 (9), 1020-1029 (2015).
  18. Huang, H., Zheng, G., Jiang, W., Hu, H., Lu, Y. One-step high-efficiency CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Streptomyces. Acta BiochimBiophys. Sin.(Shanghai). 47 (4), 231-243 (2015).
  19. Cobb, R. E., Wang, Y., Zhao, H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS Synth. Biol. 4 (6), 723-728 (2015).
  20. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
  21. Brown, E. D., Wright, G. D. Antibacterial drug discovery in the resistance era. Nature. 529 (7586), 336-343 (2016).
  22. Dodds, D. R. Antibiotic resistance: A current epilogue. Biochem. Pharmacol. 134, 139-146 (2017).
  23. Caruso, J. P., Israel, N., Rowland, K., Lovelace, M. J., Saunders, M. J. Citizen Science: The Small World Initiative improved lecture grades and California critical thinking skills test scores of nonscience major students at Florida Atlantic University. J. Microbiol. Biol. Educ. 17 (1), 156-162 (2016).
  24. Davis, E., et al. Antibiotic discovery throughout the Small World Initiative: A molecular strategy to identify biosynthetic gene clusters involved in antagonistic activity. Microbiology Open. 6 (3), (2017).
  25. van Keulen, G., Dyson, P. J. Production of specialized metabolites by Streptomyces coelicolor A3(2). Adv. Appl. Microbiol. 89, 217-266 (2014).
  26. Aigle, B., et al. Genome mining of Streptomyces ambofaciens. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 41 (2), 251-263 (2014).
  27. Antoraz, S., Santamaria, R. I., Diaz, M., Sanz, D., Rodriguez, H. Toward a new focus in antibiotic and drug discovery from the Streptomyces arsenal. Front. Microbiol. 6, 461 (2015).
  28. Onaka, H. Novel antibiotic screening methods to awaken silent or cryptic secondary metabolic pathways in actinomycetes. J. Antibiot.(Tokyo). 70 (8), 865-870 (2017).
  29. Chen, J., Wu, Q., Hawas, U. W., Wang, H. Genetic regulation and manipulation for natural product discovery. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100 (7), 2953-2965 (2016).
  30. Katz, L., Baltz, R. H. Natural product discovery: past, present, and future. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 155-176 (2016).
  31. Liu, G., Chater, K. F., Chandra, G., Niu, G., Tan, H. Molecular regulation of antibiotic biosynthesis in Streptomyces. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 77 (1), 112-143 (2013).
  32. den Hengst, C. D., Tran, N. T., Bibb, M. J., Chandra, G., Leskiw, B. K., Buttner, M. J. Genes essential for morphological development and antibiotic production in Streptomyces coelicolor are targets of BldD during vegetative growth. Mol. Microbiol. 78 (2), 361-379 (2010).
  33. Tran, N. T., Den Hengst, C. D., Gomez-Escribano, J. P., Buttner, M. J. Identification and characterization of CdgB, a diguanylate cyclase involved in developmental processes in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 193 (12), 3100-3108 (2011).
  34. Anonymous. Lab Safety. Proper Use of Autoclaves. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
  35. Border, B. G., Rice-Spearman, L. Microwaves in the laboratory: effective decontamination. Clin. Lab. Sci. 12 (3), 156-160 (1999).
  36. Bhattacharjee, M. K., Delsol, J. K. Does microwave sterilization of growth media involve any non-thermal effect? J. Microbiol. Methods. 96, 70-72 (2014).
  37. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  38. Anonymous, General Laboratory Techniques. An Introduction to the Micropipettor. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
  39. Baltz, R. H. Genetic manipulation of secondary metabolite biosynthesis for improved production in Streptomyces and other actinomycetes. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 343-370 (2016).
  40. Frohlich, V. C. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. J. Vis. Exp. (18), e844 (2008).
  41. Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Light Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
  42. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory. 3, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
  43. Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
  44. Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat. Rec.(Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
  45. Chater, K. F. Recent advances in understanding Streptomyces. F1000Res. 5, (2016).
  46. Chater, K. F. Regulation of sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2): a checkpoint multiplex? Curr. Opin. Microbiol. 4 (6), 667-673 (2016).
  47. Tschowri, N. Cyclic dinucleotide-controlled regulatory pathways in Streptomyces species. J. Bacteriol. 198 (1), 47-54 (2016).
  48. Bennett, J. A., et al. Medium-dependent phenotypes of Streptomyces coelicolor with mutations in ftsI or ftsW. J. Bacteriol. 191 (2), 661-664 (2009).
  49. Mistry, B. V., Del Sol, R., Wright, C., Findlay, K., Dyson, P. FtsW is a dispensable cell division protein required for Z-ring stabilization during sporulation septation in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190 (16), 5555-5566 (2008).
  50. Bennett, J. A., Aimino, R. M., McCormick, J. R. Streptomyces coelicolor genes ftsL and divIC play a role in cell division but are dispensable for colony formation. J. Bacteriol. 189 (24), 8982-8992 (2007).
  51. Bennett, J. A., McCormick, J. R. Two new loci affecting cell division identified as suppressors of an ftsQ-null mutation in Streptomyces coelicolor A3(2). FEMS Microbiol. Lett. 202 (2), 251-256 (2001).
  52. Dharmatilake, A. J., Kendrick, K. E. Expression of the division-controlling gene ftsZ during growth and sporulation of the filamentous bacterium Streptomyces griseus. Gene. 147 (1), 21-28 (1994).
  53. McCormick, J. R., Losick, R. Cell division gene ftsQ is required for efficient sporulation but not growth and viability in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 178 (17), 5295-5301 (1996).
  54. McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14 (2), 243-254 (1994).
  55. Flärdh, K., Findlay, K. C., Chater, K. F. Association of early sporulation genes with suggested developmental decision points in Streptomyces coelicolor A3(2). Microbiology. 145 (9), 2229-2243 (1999).
  56. van Wezel, G. P., van der Meulen, J., Kawamoto, S., Luiten, R. G., Koerten, H. K., Kraal, B. ssgA is essential for sporulation of Streptomyces coelicolor A3(2) and affects hyphal development by stimulating septum formation. J. Bacteriol. 182 (20), 5653-5662 (2000).
  57. Capstick, D. S., Willey, J. M., Buttner, M. J., Elliot, M. A. SapB and the chaplins: connections between morphogenetic proteins in Streptomyces coelicolor. Mol. Microbiol. 64 (3), 602-613 (2007).
  58. Ma, H., Kendall, K. Cloning and analysis of a gene cluster from Streptomyces coelicolor that causes accelerated aerial mycelium formation in Streptomyces lividans. J. Bacteriol. 176 (12), 3800-3811 (1994).
  59. Xu, Z., et al. Large-scale transposition mutagenesis of Streptomyces coelicolor identifies hundreds of genes influencing antibiotic biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
  60. Dedrick, R. M., Wildschutte, H., McCormick, J. R. Genetic interactions of smc, ftsK, and parB genes in Streptomyces coelicolor and their developmental genome segregation phenotypes. J. Bacteriol. 191 (1), 320-332 (2009).
  61. Pavlopoulos, A. Identification of DNA sequences that flank a known region by inverse PCR. Methods Mol. Biol. 772, 267-275 (2011).

Tags

Phenotyping المورفولوجية الإصابة، العدد 139، متسلسلة، وعلم المناعة، التنمية، الطفرات، طفرات، والمضادات الحيوية، المدرسة الثانوية، الجذعية، التعليم علم الأحياء المجهرية، وتدريس البكتيريا المختبرات، "المبادرة العالمية الصغيرة"،
التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية <em>متسلسلة</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bennett, J. A., Kandell, G. V.,… More

Bennett, J. A., Kandell, G. V., Kirk, S. G., McCormick, J. R. Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants. J. Vis. Exp. (139), e57373, doi:10.3791/57373 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter