Her præsenterer vi protokoller for novice forskere for at indlede fænotyper for farmakologisk vigtigt bakteriel slægten Streptomyces.
Streptomycetes er trådformede jord bakterier tilhører phylum Actinobacteria, der findes i hele verden og producere en bred vifte af antibiotika og andre sekundære metabolitter. Streptomyces coelicolor er et godt karakteriseret, ikke-patogene arter, der er indstillet til en lang række analyser i laboratoriet. Fænotyper metoder beskrevet bruge her S. coelicolor som en model streptomycete; metoderne er dog gældende for alle medlemmer af denne store slægt samt nogle nært beslægtede bakterier. Fænotyper er nødvendigt at karakterisere nye arter af Streptomyces identificeret i miljøet, og det er også et vigtigt første skridt i kendetegner nyligt isolerede mutantstammen af Streptomyces. Duelighedsbevis i fænotyper er vigtigt for mange nye forskere, der går ind i feltet af Streptomyces forskning, som omfatter undersøgelse af bakteriel udvikling, celledeling, kromosom segregation og anden messenger signalering. Den seneste crowdsourcing antibiotika opdagelsesrejse gennem isolation af ny jord mikrober har resulteret i et øget behov for uddannelse i fænotyper for instruktører nye til området i Streptomyces forskning og deres skole eller Gymnasium studerende. Dette manuskript beskriver metoder til bakteriel stamme formering, opbevaring og karakterisering gennem visuelle og mikroskopisk undersøgelse. Efter at have læst denne artikel, skal nye forskere (Mikrobiologi Uddannelse laboratorier og borger forskere) kunne manipulere Streptomyces stammer og begynde visuelle karakterisering eksperimenter.
Streptomycetes er Gram-positive, trådformede jord bakterier kendt for deres evne til at producere en bred vifte af sekundære metabolitter, herunder over to tredjedele af de kommercielt tilgængelige antibiotika, såvel som bekæmpelse tumor, anti-hiv, og anti-parasitære medicin 1. S. coelicolor er de mest genetisk karakteriseret medlem af slægten2,3 og er de arter, der anvendes i de metoder, der beskrives her. S. coelicolor har en kompliceret livscyklus, der begynder med spiring af en enkelt spore, udvikler sig til en omfattende, forgrenede vegetativ mycelium, der vokser i agar-medium. Som livscyklus provenuet, er antenne filamenter dannet, bryde overfladespænding af substrat mycelium og er endelig opdelt i lange kæder af celler, der i sidste ende omdannes til modne, grå-pigmenterede sporer. Spredning af disse nyligt dannede sporer udgør begyndelsen af den næste livscyklus4.
På grund af dens komplekse mønster af differentiering fungerer S. coelicolor som en fremragende model for studiet af bakteriel udvikling. Historisk, mutationer resulterer i blokke i to større faser af udvikling og producere forskellige visuelle fænotyper. Bld (skaldet) mutanter er blokeret for antenne mycelium dannelse og resultatet i mangel af en fuzzy antenne mycelium bibringe en “skaldet” koloni udseende. Mutanter hæmmet i spore dannelse og modning omtales som whi (hvid) mutanter fordi de typisk ikke til at producere vildtype niveauer af grå spore pigment og af antenne mycelium forbliver hvid. Andre interessante mutanter er hæmmede i antibiotisk produktion, celledeling, kromosom segregation eller andre vigtige processer4,5.
På trods af opdagelsen af mange udviklingsmæssige gener i Streptomyces arter, der er mange flere troede at eksistere baseret på manglen på mætning af mutant skærme. Vores laboratorier fortsætte med at identificere nye udviklingsmæssige gener ved hjælp af en mini transposon system, som vi har konstrueret. Roman mutantstammen isoleret i tilfældig mutagenese eksperimenter med vores transposon gennemgå fænotypiske screening for at identificere mulige rolle for hver nye gen opdaget6,7. Metoder for bakteriel fænotyper beskrevet her er relevante for Streptomyces mutanter isoleret af transposon mutagenese8,9,10,11,12, 13 og andre tilfældige metoder, såsom kemiske og ultraviolette (UV) mutagenese14, samt rettet opførelse af mutationer som gen sletninger bruger recombineering15,16 eller CRISPR-Cas9 (grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske gentager) genom-redigering teknologi17,18,19 og punktmutationer20.
Antibiotikaresistens blandt patogene organismer bliver stadig mere udbredt, bliver behovet for nye antibiotika stadig mere presserende21,22. “Lille verden Initiative” (eller SWI) er en effektiv videnskab, teknologi, teknik og matematik (STEM) læring23 og forsknings strategi24 til bekæmpelse af antibiotikaresistens gennem crowdsourcing af college studerende, og mere Seneste high school-elever. Understøttede kurser arbejde omfatter at identificere nye jord mikrober, der producerer nye antibiotika (http://www.smallworldinitiative.org). Det menes, at en væsentlig kilde til uopdagede antibiotika fortsat vil være Streptomyces arter findes i en bred vifte af jord og vand levesteder25,26,27,28, 29,31. For nylig har vores laboratorium og andres arbejde opdaget og karakteriseret signaling gener i Streptomyces arter, der regulerer morfologi og udvikling, herunder antibiotika produktion7,32, 33. Ændringer i udtryk af disse gener kan resultere i en ændring i mængden og timing af antibiotika produceret. Dygtige fænotyper af nye arter og nye antibiotika-produktion mutanter vil fortsat være vigtigt. Som nye instruktører og deres studerende bliver store bidragydere til inden for drug discovery, er uddannelse i bakteriel fænotyper nødvendige for en vellykket gennemførelse af disse uerfarne personer. Disse eksperimenter er desuden tractable for gymnasiet STILK eller universitetslaboratorier Mikrobiologi uddannelse. De repræsenterer en demonstration af grundlæggende mikrobielle genetiske principper i en undervisning lab indstilling.
Her præsenterer vi protokoller til begyndelsen Streptomyces forskere for at indlede undersøgelser ved at inkludere de nødvendige skridt for at udbrede stammer og forberede lagre langtidslageret. Derefter beskriver vi protokollerne for visuelle og mikroskopiske karakterisering af Streptomyces stammer. Nogle typiske indledende skridt i fænotyper udviklingsmæssige mutanter er: 1) visuel undersøgelse af mutant kolonierne i forhold til vildtype kolonier på agarsubstratet; 2) fasekontrast mikroskopi; og 3) Fluorescens mikroskopi af sporogenic antenne hyfer. Baseret på fænotype vises i disse tre trin, kan være ansat en række teknikker til yderligere skelne fænotype for en bestemt stamme.
Indledende fænotyper eksperimenter er almindeligt anvendt til at karakterisere nye arter, identificere mutanter af interesse, delvist karakterisere mutanter og begynde at skimte et bestemt gen baseret på Fænotypen af en identificeret mutant typiske rolle. Metoderne beskrevet her er allerede blevet anvendt i university undervisning laboratorier til at identificere og karakterisere en bred vifte af Streptomyces mutanter, inklusive dem med fejl i celledelingen48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporulering55,56, antenne mycelium dannelse57,58, antibiotika produktion59, second messenger signaling47og kromosom adskillelse 60. disse teknikker er de vigtige første skridt til fastlæggelse af Fænotypen af mutanter i almindelighed og afslører en stor mængde af vigtige oplysninger om rollerne af gener af interesse. Metoderne kan nemt udvides til andre arter af Streptomyces og har allerede været brugt til at beskrive stammer af S. griseus, S. venezuelae, S. fnatog mange andre streptomycetes. De video protokoller er beskrevet her forventes at fungere som en vigtig ressource for nye forskere ind Streptomyces forskningsområder, som inden for drug discovery. Dette omfatter de nye instruktører, der arbejder for at bekæmpe krisen i antibiotikaresistens og uddanne de utallige antal nye bachelor studerende forskere at deltage crowdsourcing indsats af initiativet lille verden.
De teknikker, der beskrives her kan tilpasses nemt til college og high school klasseværelset brug ud over forskningslaboratorier, ved hjælp af de ændringer, der er beskrevet i den video og tekst. Studerende i en første år mikroskopi modul på en lille liberal arts college var købedygtig streak stammer, tage digitale billeder af stammer, der er dyrket på agar medier og udføre fase-kontrast og Fluorescens mikroskopi, der kulminerede i indgivelse af en portefølje af multi paneled tal i slutningen af modulet 3 uge, der repræsenterer 15 h laboratoriearbejde. Cirka 160 førsteårsstuderende var ansvarlig for den indledende fænotyper af 320 roman transposon mutanter. Bachelor forskning studerende på tre institutioner deltog i den oprindelige fænotyper af yderligere mutanter og efterfølgende karakterisering af mange af stammer. Omfattende oplysninger indhentet i en relativt kort periode, illustrerer værdien af de protokoller, der er beskrevet her. Hundredvis af yderligere mutanter er blevet gemt som glycerol mycelial bestande for fremtidige karakterisering.
Efter de indledende eksperimenter beskrevet her, kan være ansat en række metoder til at udvide kvaliteten af oplysninger vedrørende stammer af interesse. Hvis mutation er ukendt, skal en genotypebestemmelse metode anvendes til at bestemme type og/eller placering af mutation. For eksempel, tilfældige transposon mutagenese af vildtype kromosom6,7,8,9,10,11,12,13 resultater i kolonier, der underkastes indledende fænotypiske skærme som disse beskrevet ovenfor. Derefter bør placeringen af transposon identificeres ved hjælp af en teknik som inverse polymerase kæde reaktion (iPCR)61. Bestemmelse af genotype af nyopdagede mutanter er et vigtigt skridt efter første karakterisering.
Nogle almindeligt anvendte avancerede metoder til efterfølgende fænotyper analyse, der kan nævnes i klasseværelset eller udforskes gennem yderligere forskning omfatter grøn fluorescerende proteiner (NGL) kodning for at bestemme lokalisering mønstre for protein af interesse, gen expression analyser som real tid kvantitativ PCR (qPCR) og global gen expression mønstre af vildtype versus mutant via RNA sekventering (RNA-seq). Fænotyper færdigheder er også behov for genetiske komplementering analyse. I en komplementering eksperiment, er wild-type kopi af et gen indført i en muteret stamme til at afgøre, om den nyligt tilføjede allel kan kompensere for tab af funktion af den muterede allel. Sammenligne Fænotypen af suppleret stammen til både den oprindelige mutant og forældreorganismen, er wild-type stamme påkrævet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Cobalt402 Universitet for Undergraduate studerende forskning stipendier og studerende forskning Fund Awards GVK og SGK; og Cobalt402 Professor Gilbert E. Mills Memorial begavet orlov Program Award og Institut for biologi og Earth Science fakultetet forskning og stipendium begavet Award til JAB. Bert og Jane Horn begavet elev Research Fund i videnskaberne blev tildelt GVK og SGK. Forfatterne vil gerne parlamentsarbejdet Duquesne Universitet finansieret Undergraduate Research Program stipendier for GVK og SGK. Tidligere Juniata College bachelor forskning studerende, Ryan Johnson og Lindsey Draper bidraget mikroskopi billeder til figur 2 og 3, henholdsvis.
50% Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Immersion Oil (Type DF) | Cragille | 16482 | |
Lens Paper | Fisherbrand | 11-995 | |
Sterile Water | GeneMate | G-3250-1L | |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Toothpicks (flat) | Target | 081-22-1957 | |
Pipette Tips (10 ml) | GeneMate | P-1240-10 | |
Pipette Tips (200 ml) | GeneMate | P-1240-200Y | |
Pipette Tips (1250 ml) | GeneMate | P-1240-1250 | |
Wooden Applicators 6'' | Solon Care | 070809 | |
Cotton Swabs | Fisherbrand | 23-400-124 | |
Soy Flour | Bob's Red Mill | 1516C164 | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-1KG | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
Glycerol 100% | VWR amresco life science | 0854-1L | |
0.8% NaCl (Saline) | Sigma-Aldrich | SLBB9000V | |
1.2 mL freezer tube | NEST | 606101 | |
Ultra low (-80°C) freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Cryo Safety Gloves | Bel-Art | H13201 | |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
Cover slips #1.5 | Thomas Scientific | 64-0721 | |
Slides | Carolina | 63-2010 | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540E | |
Phase-Contrast Microscope | Olympus | BX40 | |
Forceps | Carolina Biological | 624504 | |
Bunsen Burner | Carolina Biological | 706706 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
PBS (phosphate buffer saline) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
WGA-FITC | Biotium | 29022-1 | |
Clear nail polish | OPI | 22001009000 | |
Image J | NIH | Free Software | |
100 mL beaker | Pyrex USA | 1000-T | |
1 L beaker | Carolina Biological | 721253 | |
1 L flask | Fisherbrand | S63274 | |
250 mL flask | Pyrex USA | 4980 | |
100 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721788 | |
500 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721792 | |
Stir Bar | Fisher Scientific | 22-271825 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Camera for Microscope | Olympus | DP72 | |
Nitrile Examination Gloves (Med) | Bio Excell | 71011002 | |
Vortex Mixer | Carolina Biological | 701077 |