Här presenterar vi protokoll för nybörjare forskare för att initiera fenotypning för farmakologiskt viktiga bakteriell släktet Streptomyces.
Streptomycetes är trådformiga jordbakterier som tillhör stammen Actinobacteria och som förekommer i hela världen och producerar ett brett utbud av antibiotika och andra sekundära metaboliter. Streptomyces coelicolor är en välkarakteriserad, sjukdomsframkallande arter som är mottagliga för en mängd olika analyser i labbet. De fenotypning metoder som beskrivs använder här S. coelicolor som en modell streptomycete; dock är metoderna som tillämpliga på alla medlemmar i detta stora släkte samt vissa närbesläktade aktinomyceter. Fenotypning är nödvändigt att karakterisera nya arter av Streptomyces identifieras i miljön, och det är också ett viktigt första steg i kännetecknar nyligen isolerade mutant stammar av Streptomyces. Kunskaper i fenotypning är viktigt för många nya forskare som går in Streptomyces forskningsområdet, som omfattar studiet av bakteriell utveckling, celldelning, kromosomsegregering och andra messenger signalering. Den senaste crowdsourcing antibiotika upptäcktsfärd genom isolering av ny jord mikrober har resulterat i ett ökat behov av utbildning i fenotypning för instruktörer som är nya på området av Streptomyces forskning och deras college eller high school studenter. Detta manuskript beskriver metoder för bakteriestam förökning, lagring och karakterisering genom visuella och mikroskopiska undersökningar. Efter att ha läst denna artikel, bör nya forskare (mikrobiologi utbildning laboratorier och medborgaren forskare) kunna manipulera Streptomyces stammar och påbörja visuella karaktärisering experiment.
Streptomycetes är grampositiva, fintrådiga jordbakterier kända för sin förmåga att producera en mängd sekundära metaboliter, inklusive mer än två tredjedelar av de kommersiellt tillgängliga antibiotika, samt som anti-tumör, mot HIV, och antiparasitära läkemedel 1. S. coelicolor är mest genetiskt kännetecknas av släktet2,3 och är den art som används i de metoder som beskrivs här. S. coelicolor har en komplicerad livscykel som börjar med groning av en enda spore, utvecklas till en omfattande, förgrenade vegetativa mycel som växer in i agarsubstratet. Som livscykel vinning, bildas antenn filament som bryter ytspänningen av substrat mycel och slutligen är indelade i långa kedjor av celler som omvandlas slutligen till mogen, grå-pigmenterade sporer. Spridning av dessa nybildade sporer utgör i början av nästa livscykel4.
På grund av dess komplexa mönster av differentiering fungerar S. coelicolor som en utmärkt modell för studier av bakteriell utveckling. Historiskt sett mutationer resulterar i block för två stora utvecklingsstadier och producera distinkta visuella fenotyper. Bld (skallig) mutanter blockeras för antenn mycel bildandet och leder avsaknaden av en fuzzy antenn mycel förmedla ett ”skallig” koloni utseende. Mutanter hämmas i spore bildning och mognad benämns som whi (vit) mutanter eftersom de vanligtvis inte vildtyp halter av grå spore pigment och antenn mycelet förblir vit. Andra intressanta mutanter hämmas i antibiotiska produktion, celldelning, kromosomsegregering eller andra viktiga processer4,5.
Trots upptäckten av många utvecklande gener i Streptomyces arter finns det många fler tros existera utifrån avsaknaden av mättnad av muterade skärmar. Våra laboratorier fortsätter att identifiera nya utvecklande gener med en mini transposon-system som vi har konstruerat. Nya mutant stammar isolerade i slumpmässig mutagenes experiment med våra transposon genomgå fenotypiska screening för att identifiera den eventuella betydelsen av varje ny gen upptäckt6,7. Metoderna för bakteriell fenotypning beskrivs här är relevanta för Streptomyces mutanter isolerat av transposon mutagenes8,9,10,11,12, 13 och andra random metoder, såsom kemiska och ultraviolett (UV) mutagenes14, samt riktade byggandet av mutationer som gen strykningar med recombineering15,16 eller CRISPR-Cas9 (klustrade regelbundet mellanliggande kort Palindromic repeteras) genomet redigering teknik17,18,19 och punktmutationer20.
Som antibiotikaresistens hos patogener blir allt vanligare, blir behovet av nya antibiotika alltmer brådskande21,22. Den ”lilla världen Initiative” (eller SWI) är en effektiv vetenskap, teknik, ingenjörsvetenskap och matematik (STEM) lärande23 och forskning strategi24 för att bekämpa antibiotikaresistens genom crowdsourcing av Collegestudenter, och mer Nyligen gymnasieelever. Stöd för kurser i arbetet ingår att identifiera nya jord mikrober som producerar nya antibiotika (http://www.smallworldinitiative.org). Man tror att en viktig källa till oupptäckta antibiotika kommer att fortsätta vara Streptomyces arter Funna i ett brett utbud av jord och vatten livsmiljöer25,26,27,28, 29,31. Nyligen har vårt laboratorium och andras arbete upptäckt och kännetecknas signalering gener i Streptomyces arter som reglerar morfologi och utveckling, inklusive antibiotika produktion7,32, 33. Förändringar i uttryck av dessa gener resultera i en förändring i de belopp och tidpunkten för antibiotika som produceras. Skickliga fenotypning av nya arter och nya antibiotika-producerande mutanter fortsätter att vara viktigt. Som ny lärare och deras elever blivit stora bidragsgivare inom läkemedelsutveckling, är utbildning i bakteriell fenotypning nödvändigt för att lyckas med dessa nybörjare individer. Dessa experiment är dessutom lätthanterlig för gymnasiet STEM eller mikrobiologi utbildning universitetslaboratorier. De representerar en demonstration av mikrobiella genetiska grundprinciperna i en undervisning lab inställning.
Här presenterar vi protokoll för början Streptomyces forskare för att initiera studier av bland annat de steg som behövs för att sprida stammar och förbereda bestånd för långsiktig lagring. Sedan beskriver vi protokollen för visuell och mikroskopisk karakterisering av Streptomyces stammar. Några typiska inledande steg i fenotypning utvecklingsmässiga mutanter är: 1) visuell undersökning av de mutanta kolonier jämfört med vildtyp kolonier på agarsubstrat; (2) faskontrast-mikroskopi; och 3) fluorescensmikroskopi av sporogenic antenn hyfer. Baserat på fenotypen visas i dessa tre steg, kan en mängd olika tekniker användas till ytterligare urskilja fenotypen av en viss stam.
Inledande fenotypning experiment används ofta att karakterisera nya arter, identifiera mutanter av intresse, delvis karakterisera mutanter och börja urskilja en särskild gen baserat på fenotypen av en identifierad mutant typiska roll. Metoderna som beskrivs här har redan använts i universitetsundervisning laboratorier för att identifiera och karaktärisera ett brett utbud av Streptomyces mutanter, inklusive dem med defekter i celldelning48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporulering55,56, antenn mycel bildandet57,58, antibiotika produktion59, andra messenger signalering47och kromosomsegregering 60. dessa tekniker är viktiga första stegen för att fastställa fenotypen av mutanter i allmänhet och avslöjar en stor mängd viktig information om roller i gener av intresse. Metoderna kan enkelt förlängas till andra arter av Streptomyces och har redan använts för att beskriva stammar av S. griseus, S. venezuelae, S. skabboch många andra streptomycetes. De video protokoll som beskrivs här förväntas fungera som en viktig resurs för nya forskare in Streptomyces forskningsområden, såsom i området i läkemedelsutveckling. Detta inkluderar de nya instruktörer som arbetar för att bekämpa antibiotikaresistens krisen och utbilda oräkneligt antal nya grundutbildningsprogram student forskare att gå med crowdsourcing ansträngningar av initiativet för små världen.
De tekniker som beskrivs här kan lätt anpassas till college och gymnasiet användning i klassrummet förutom forskningslaboratorier, med de ändringar som beskrivs i video och text. Studenterna i en första året mikroskopi modul på en liten liberal arts college kunde strimma stammar, ta digitala fotografier av stammar som odlas på agar media och utföra faskontrast och fluorescence mikroskopi, som kulminerade i inlämnandet av en portfölj av flera träpaneler siffror i slutet av den 3 vecka modul, som representerar 15 h i-lab arbete. Cirka 160 första årets studerande var ansvariga för den inledande fenotypning av 320 roman transposon mutanter. Grundutbildning forskarstuderande vid tre lärosäten deltog i den inledande fenotypning av ytterligare mutanter och efterföljande karakterisering av många av stammarna. Omfattande uppgifter som erhållits i en relativt kort tidsperiod, illustrerar värdet av de protokoll som beskrivs här. Hundratals ytterligare mutanter har lagrats som glycerol mycelial lager för framtida karakterisering.
Efter de inledande experiment som beskrivs här, kan en mängd metoder användas för att utvidga kvaliteten på information som rör stammar av intresse. Om mutationen är okänd, bör en genotypning metod användas att avgöra typ och/eller placeringen av mutationen. T ex slumpmässiga transposon mutagenes av vildtyp kromosom6,7,8,9,10,11,12,13 resulterar i kolonier som bör genomgå inledande fenotypiska skärmar såsom de som beskrivs ovan. Då platsen för transposon bör identifieras med hjälp av en teknik såsom omvänd polymerasen kedjar reaktion (iPCR)61. Att bestämma vilken genotyp av nyupptäckta mutanter är ett viktigt steg efter första karakterisering.
Vissa vanliga avancerade metoder för efterföljande fenotypning analys som kan vara i klassrummet utforskas genom ytterligare forskning inkluderar grönt fluorescerande protein (GFP) taggning för att bestämma localizationen mönster för proteinet av intresse, gen uttryck analyser såsom real time kvantitativ PCR (qPCR) och globala gen uttrycksmönster av vildtyp kontra mutant via RNA sekvensering (RNA-seq). Fenotypning kompetens krävs också för genetiska komplettering analys. I ett experiment med komplettering införs den vildtyps-kopian av en gen i en muterad stam att avgöra huruvida den nytillagda allelen kan kompensera för den förlust-av-funktionen av muterade allelen. Jämföra fenotypen av kompletteras stammen som både den ursprungliga muterat och föräldrarorganismen, krävs vildtyp stam.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna Otterbein universitet för grundutbildning forskningsstipendier för Student och Student Research Fund Awards till GVK och SGK; och den Otterbein Professor Gilbert E. Mills Memorial begåvad sabbatsår Program Award och Institutionen för biologi och geovetenskap fakulteten forskning och stipendium begåvad Award till JAB. I Bert och Jane Horn begåvad Student forskningsfond i vetenskaperna tilldelades GVK och SGK. Författarna vill också tacksamt erkänna Duquesne universitet finansieras grundutbildning forskningsstipendier Program för GVK och SGK. F.d. Juniata grundutbildning forskning högskolestudenter, Ryan Johnson och Lindsey Draper bidrog mikroskopi bilderna för figurerna 2 och 3, respektive.
50% Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Immersion Oil (Type DF) | Cragille | 16482 | |
Lens Paper | Fisherbrand | 11-995 | |
Sterile Water | GeneMate | G-3250-1L | |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Toothpicks (flat) | Target | 081-22-1957 | |
Pipette Tips (10 ml) | GeneMate | P-1240-10 | |
Pipette Tips (200 ml) | GeneMate | P-1240-200Y | |
Pipette Tips (1250 ml) | GeneMate | P-1240-1250 | |
Wooden Applicators 6'' | Solon Care | 070809 | |
Cotton Swabs | Fisherbrand | 23-400-124 | |
Soy Flour | Bob's Red Mill | 1516C164 | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-1KG | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
Glycerol 100% | VWR amresco life science | 0854-1L | |
0.8% NaCl (Saline) | Sigma-Aldrich | SLBB9000V | |
1.2 mL freezer tube | NEST | 606101 | |
Ultra low (-80°C) freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Cryo Safety Gloves | Bel-Art | H13201 | |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
Cover slips #1.5 | Thomas Scientific | 64-0721 | |
Slides | Carolina | 63-2010 | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540E | |
Phase-Contrast Microscope | Olympus | BX40 | |
Forceps | Carolina Biological | 624504 | |
Bunsen Burner | Carolina Biological | 706706 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
PBS (phosphate buffer saline) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
WGA-FITC | Biotium | 29022-1 | |
Clear nail polish | OPI | 22001009000 | |
Image J | NIH | Free Software | |
100 mL beaker | Pyrex USA | 1000-T | |
1 L beaker | Carolina Biological | 721253 | |
1 L flask | Fisherbrand | S63274 | |
250 mL flask | Pyrex USA | 4980 | |
100 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721788 | |
500 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721792 | |
Stir Bar | Fisher Scientific | 22-271825 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Camera for Microscope | Olympus | DP72 | |
Nitrile Examination Gloves (Med) | Bio Excell | 71011002 | |
Vortex Mixer | Carolina Biological | 701077 |