Summary
Her præsenterer vi protokoller for novice forskere for at indlede fænotyper for farmakologisk vigtigt bakteriel slægten Streptomyces.
Abstract
Streptomycetes er trådformede jord bakterier tilhører phylum Actinobacteria, der findes i hele verden og producere en bred vifte af antibiotika og andre sekundære metabolitter. Streptomyces coelicolor er et godt karakteriseret, ikke-patogene arter, der er indstillet til en lang række analyser i laboratoriet. Fænotyper metoder beskrevet bruge her S. coelicolor som en model streptomycete; metoderne er dog gældende for alle medlemmer af denne store slægt samt nogle nært beslægtede bakterier. Fænotyper er nødvendigt at karakterisere nye arter af Streptomyces identificeret i miljøet, og det er også et vigtigt første skridt i kendetegner nyligt isolerede mutantstammen af Streptomyces. Duelighedsbevis i fænotyper er vigtigt for mange nye forskere, der går ind i feltet af Streptomyces forskning, som omfatter undersøgelse af bakteriel udvikling, celledeling, kromosom segregation og anden messenger signalering. Den seneste crowdsourcing antibiotika opdagelsesrejse gennem isolation af ny jord mikrober har resulteret i et øget behov for uddannelse i fænotyper for instruktører nye til området i Streptomyces forskning og deres skole eller Gymnasium studerende. Dette manuskript beskriver metoder til bakteriel stamme formering, opbevaring og karakterisering gennem visuelle og mikroskopisk undersøgelse. Efter at have læst denne artikel, skal nye forskere (Mikrobiologi Uddannelse laboratorier og borger forskere) kunne manipulere Streptomyces stammer og begynde visuelle karakterisering eksperimenter.
Introduction
Streptomycetes er Gram-positive, trådformede jord bakterier kendt for deres evne til at producere en bred vifte af sekundære metabolitter, herunder over to tredjedele af de kommercielt tilgængelige antibiotika, såvel som bekæmpelse tumor, anti-hiv, og anti-parasitære medicin 1. S. coelicolor er de mest genetisk karakteriseret medlem af slægten2,3 og er de arter, der anvendes i de metoder, der beskrives her. S. coelicolor har en kompliceret livscyklus, der begynder med spiring af en enkelt spore, udvikler sig til en omfattende, forgrenede vegetativ mycelium, der vokser i agar-medium. Som livscyklus provenuet, er antenne filamenter dannet, bryde overfladespænding af substrat mycelium og er endelig opdelt i lange kæder af celler, der i sidste ende omdannes til modne, grå-pigmenterede sporer. Spredning af disse nyligt dannede sporer udgør begyndelsen af den næste livscyklus4.
På grund af dens komplekse mønster af differentiering fungerer S. coelicolor som en fremragende model for studiet af bakteriel udvikling. Historisk, mutationer resulterer i blokke i to større faser af udvikling og producere forskellige visuelle fænotyper. Bld (skaldet) mutanter er blokeret for antenne mycelium dannelse og resultatet i mangel af en fuzzy antenne mycelium bibringe en "skaldet" koloni udseende. Mutanter hæmmet i spore dannelse og modning omtales som whi (hvid) mutanter fordi de typisk ikke til at producere vildtype niveauer af grå spore pigment og af antenne mycelium forbliver hvid. Andre interessante mutanter er hæmmede i antibiotisk produktion, celledeling, kromosom segregation eller andre vigtige processer4,5.
På trods af opdagelsen af mange udviklingsmæssige gener i Streptomyces arter, der er mange flere troede at eksistere baseret på manglen på mætning af mutant skærme. Vores laboratorier fortsætte med at identificere nye udviklingsmæssige gener ved hjælp af en mini transposon system, som vi har konstrueret. Roman mutantstammen isoleret i tilfældig mutagenese eksperimenter med vores transposon gennemgå fænotypiske screening for at identificere mulige rolle for hver nye gen opdaget6,7. Metoder for bakteriel fænotyper beskrevet her er relevante for Streptomyces mutanter isoleret af transposon mutagenese8,9,10,11,12, 13 og andre tilfældige metoder, såsom kemiske og ultraviolette (UV) mutagenese14, samt rettet opførelse af mutationer som gen sletninger bruger recombineering15,16 eller CRISPR-Cas9 (grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske gentager) genom-redigering teknologi17,18,19 og punktmutationer20.
Antibiotikaresistens blandt patogene organismer bliver stadig mere udbredt, bliver behovet for nye antibiotika stadig mere presserende21,22. "Lille verden Initiative" (eller SWI) er en effektiv videnskab, teknologi, teknik og matematik (STEM) læring23 og forsknings strategi24 til bekæmpelse af antibiotikaresistens gennem crowdsourcing af college studerende, og mere Seneste high school-elever. Understøttede kurser arbejde omfatter at identificere nye jord mikrober, der producerer nye antibiotika (http://www.smallworldinitiative.org). Det menes, at en væsentlig kilde til uopdagede antibiotika fortsat vil være Streptomyces arter findes i en bred vifte af jord og vand levesteder25,26,27,28, 29,31. For nylig har vores laboratorium og andres arbejde opdaget og karakteriseret signaling gener i Streptomyces arter, der regulerer morfologi og udvikling, herunder antibiotika produktion7,32, 33. Ændringer i udtryk af disse gener kan resultere i en ændring i mængden og timing af antibiotika produceret. Dygtige fænotyper af nye arter og nye antibiotika-produktion mutanter vil fortsat være vigtigt. Som nye instruktører og deres studerende bliver store bidragydere til inden for drug discovery, er uddannelse i bakteriel fænotyper nødvendige for en vellykket gennemførelse af disse uerfarne personer. Disse eksperimenter er desuden tractable for gymnasiet STILK eller universitetslaboratorier Mikrobiologi uddannelse. De repræsenterer en demonstration af grundlæggende mikrobielle genetiske principper i en undervisning lab indstilling.
Protocol
1. Forbered instrumenter, kultur medier, løsninger og petriskåle
- Autoklave tandstikker i en 50 mL bægerglas dækket med aluminiumsfolie at holde sterile.
- Sterilisere alle tørt gods, der bliver brugt (tips, sticks, glas, osv.) i en autoklave.
Bemærk: advarsel! Følg alle sikkerheds retninger for autoklave model anvendes. Autoklaver udgøre en fare for eksplosioner, og forbrændinger fra damp og kontakt med varme overflader, materialer og medier. Autoklave sikkerhed, se "Korrekt brug af autoklaver"34. -
Forberede MS agar (Mannitol soja mel (SFM))14 at vokse kulturer.
- Tilføj 5 g af soja mel og 5 g agar til 1 L målekolbe.
- Opløses 5 g af mannitol i 250 mL postevand og dispensere i kolben med indhold af sojamel og agar.
- Tilføje en skum plug og folie til åbningen af kolben og autoklaver ved 121 ° C, 15 psi i mindst 30 min.
Forsigtig: Dette medium nemt koger over. Bruge en kolbe, der kan holde mindst fire gange den faktiske mængde af MS agar der autoklaveres. En standard trykkoger kan bruges i stedet for en autoklave med lignende sikkerhedsmæssige overvejelser. Alternativt, en mikrobølgeovn kan bruges til at sterilisere medier og materialer, hvis adgang til en autoklave ikke er mulige35,36. Gymnasielærere kan også ønsker at samarbejde med lokale skoler og universiteter til at få adgang til autoklaveres forsyninger. - Cool medier indtil komfortabel nok til at håndtere. Pas på at ikke cool det alt for længe, fordi agar størkner ved temperaturer under 50 ° C.
- Hæld MS agar fra kolben i sterile petriskåle, indtil bunden af hver petriskål er ca halvt fuld (ca. 25 mL media pr. petriskål). Tillad for at størkne inden du bruger agar plader. Gemme agar plader i en plasticpose ved stuetemperatur indtil det skal bruges.
Bemærk: Agar plader kan også opbevares i køleskab, især hvis antibiotika er skulle bruge i medierne.
2. streak Streptomyces på plader til formering
- Streak Streptomyces stammer på MS agar plader til enkelt kolonier ved hjælp af en standardmetode, som kvadrant streak metode som vist i Sanders, 201237.
Bemærk: En inoculating loop eller sterile tandstikkere kan bruges. Valgfrit: Andre medier er almindeligt anvendt til Streptomyces arter, såsom R2YE og minimal medier14. - Inkuber plader på 30 ° C.
- Restreak plader af picking en enkelt koloni hver 4-6 dage. Som kolonier alder bliver de udsat for tilfældige mutation.
3. Opret Glycerol Mycelial bestande for bakteriel opbevaring
Bemærk: Mycelial bestande kan oprettes for alle Streptomyces stammer, herunder whi og bld stammer og andre udviklingsmæssige mutanter, der er afskåret fra hel sporedannelse.
- Udblødte 15 – 20 kolonier i 200-500 µL af 20% glycerol ved hjælp af en steril træ dyvel applikator.
- Overføre gylle af udblødt kolonier til en 1,5 mL fryser kultur tube, ved hjælp af en mikropipette eller sterile overførsel pipette.
Bemærk: Grundlæggende i mikropipette brug er dækket andetsteds38. - Tilføje nok 20% glycerol til at gøre det endelige rumfang 1 mL og blandes forsigtigt. Opbevare prøver ved-80 ° C.
Bemærk: advarsel! Brug kryogene beskyttelseshandsker og en lab coat at beskytte huden mod kontakt med ekstrem kulde. Alternativt kan en-20 ° C fryser bruges med potentielle reduktion i lang sigt opbevaringstid. Undgå overdreven nedfrysning og optøning for at udvide levedygtighed.
4. skabe Glycerol Spore bestande for stammer kan sporulering
Bemærk: Spore bestande er at foretrække frem for langsigtede levedygtighed men er kun muligt for stammer, der er i stand til at færdiggøre sporedannelse.
-
Sprede 100 µL af udblødt materiale (fra trin 3.1) på en agar plade til at opnå en sammenflydende græsplæne vækst37.
Bemærk: Spredning plating er vist i Sanders37 (ændring: der kræves ikke en pladespiller.). Pladen kan vendes med den ene hånd mens du bruger anden hånden til at flytte sprederen i en blid frem og tilbage bevægelse på tværs af agar medier.- Afpipetteres 100 µL af udblødt mycelium til midten af en MS agar plade.
- Sterilisere et glas eller metal breder sig værktøj af delvis nedsænkning i 70% ethanol og passerer sprederen engang langsomt gennem en bunsenbrænder flammen til at fremskynde fordampningen af ethanol.
Forsigtig: Ethanol er meget brandfarligt. Ikke placere den flammende sprederen i ethanol eller tillade den flammende drop ethanol til at falde i ethanol parabol. Alternativt kan du bruge en engangs sterile vatpind for at sprede bakterier på den plade, som kræver ingen ethanol eller flamme. - Drej MS-agar plade med den ene hånd, mens du bruger en tilbage og tilbage bevægelse til podes pladen med den sterile sprederen.
- Inkuber i 5 – 7 dage ved 30 ° C, indtil stammen er godt sporeform.
Bemærk: Inkuberingstider vil variere afhængig af art og stamme.
- Der tilsættes 2 mL sterilt saltvand (0,8% NaCl) til midten af en sammenflydende græsplæne af Streptomyces celler, der har undergået sporedannelse.
- Høste sporer af forsigtigt gnide overfladen af mycelium med en steril vaccinere loop (eller en vatpind), langsomt bevægende mod kanten af plænen.
- Med pipette overfoeres saltvand indeholder sporer i en 15 mL konisk slange. Vortex kraftigt til at bryde spore kæder i individuelle celler.
- Der centrifugeres ved stuetemperatur i 5 min på ca 2.500 x g.
- Med pipette overfoeres supernatanten og kassér. Sprede spore pellet ved kraftig vortex agitation i den lille mængde af resterende væske.
- Resuspend sporerne i 1 mL 20% glycerol ved at trække løsningen op og ned med en pipette.
- Overføre glycerol spore materiel til en 1,5 mL fryser tube. Opbevares ved-80 ° C.
Forsigtig: Brug kryogene beskyttelseshandsker og en lab coat at beskytte huden mod kontakt med ekstrem kulde. Alternativt kan en-20 ° C fryser bruges med potentielle reduktion af virksomhedens rentabilitet på lang sigt opbevaringstid. Undgå overdreven nedfrysning og optøning for at udvide levedygtighed.
5. udføre mutagenese
- Udføre mutagenese baseret på de ønskede resultater som der refereres til i indførelsen og har for nylig gennemgået af Baltz, 201639.
Bemærk: Nogle fænotyper eksperimenter vil ikke kræve mutagenese, såsom intentionen om at identificere nye arter fra miljøet. Metoder til tilfældig mutagenese omfatter anvendelse af en transposon8,9,10,11,12,13, UV-stråling, eller kemikalier14. Site-directed mutagenese15,16,17,18,19,20 teknikker kan bruges til at oprette specifikke punktmutationer, sletninger eller andre typer af mutationer.
6. Undersøg og optage det visuelle udseende
- Tage til efterretning af kolonien morfologi for hver mutant sammenlignet med vildtype stamkulturen efter striber alle stammer som i trin 2. Sammenligne den nye isolat som en velundersøgte arter som S. coelicolor og S. venezuelae, når kendetegner nye Streptomyces arter. Bemærk karakteristika (figur 1) som grundlæggende form, overflade af kolonien (fuzzy, skaldet, rynket, etc.), opacitet, elevation, og pigmentering (skelne mellem vegetativ mycelium, antenne myceliet, og/eller omgivende medium).
- Mærke en MS agar plade og streak vildtype og mutante stammer i kile mønstre (figur 1). Pas på at ingen stamme rører en anden stamme for at undgå krydskontaminering. Bemærk datoen og klokkeslættet, stammer er stribede på pladen. Inkuber plader på 30 ° C.
- Sted vokset petriskåle på farvet eller hvidt papir til at homogenisere baggrunden. Skrive på papir stamme-navn, dato, inkubation temperatur og tid fra første plade striber. Tage digitale billeder af pladen med de sidstnævnte oplysninger skrevet på papir baggrunden, så forveksling er minimeret.
Bemærk: Skrivning kan være beskåret fra fotografiet på et senere tidspunkt hvis det skal bruges til figur forberedelse.
7. udføre fasekonstrastmikroskopi
- Sterilisere pincetter af vask i 70% ethanol og derefter passerer gennem en bunsenbrænder flammen til at fordampe ethanol. Lad den køle.
- Sterilisere coverslips ved vask i 70% ethanol og derefter give dem til tørre i en steril petriskål.
-
Forberede en coverslip elevator af bakterievækst skal undersøges.
- Afhente en steril coverslip med sterile pincetter og placere coverslip på en MS agar plade hvor bakterievækst er tætte. Tryk på bagsiden af coverslip forsigtigt med en pincet til at sikre tilstrækkelig overførsel af bakteriesporer og antenne mycelium.
- Hente coverslip fra pladen og placere det, så siden med cellestof vender mod overfladen af et objektglas med et 15 µL dråbe 50% glycerol forberedt i vand til montering. Reducere luftbobler ved at placere coverslip i en 45° vinkel til diaset og lad det falde på 50% glycerol.
- (Valgfrit) Seal med klar neglelak for bevarelse af diaset.
-
Udføre fasekonstrastmikroskopi som beskrevet af Frohlich40 på forskellige tidspunkter i løbet af levetiden.
Bemærk: Gentagne imaging giver mulighed for en mere fuldstændig analyse og evnen til at opdage forsinkelser i udvikling. Selvstændigt gentage observationer for at sikre nøjagtighed og reproducerbarhed.- Placer forberedt diaset på stadiet mikroskop og tilføje en dråbe immersionsolie på midten af forsiden slip. Rotere den 100 X fase mål i placere og angive kondensator tårnet til den korrekte "matchende" fase indstilling. Fokusere den billed benytter kun fine ingsknap når formålet objektivet er i kontakt med olien.
- Undersøge flere felter i visningen for at skelne mærkbar og konsekvente forskelle mellem mutantstammen og de vilde type, såsom evnen til at form sporer, spore størrelse og form og samlede antal sporer (Se figur 2).
Bemærk: Alternativer til fasekonstrastmikroskopi omfatter differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi40 og enkel farvning teknikker til brug med lysfelt mikroskoper41, såsom krystalviolet farvning.
8. udføre Fluorescens mikroskopi
- Sterilisere pincet ved vask i 70% ethanol og derefter køre gennem en bunsenbrænder flamme.
- Afhente en steril coverslip med sterile pincetter og sted på en MS agar plade hvor bakterievækst er indlysende. Tryk på bagsiden af coverslip forsigtigt med en pincet til at sikre tilstrækkelig overførsel af bakteriesporer og antenne filamenter.
- Hente coverslip fra pladen og placere det, så siden med cellestof opad på karton for at lette i manipulation af coverslip.
- Oversvømmelse coverslip med iskold methanol (~ 300 µL for en 20 x 20 mm2 coverslip) og lade det helt tørre luft.
Forsigtig: Methanol er en mutagen. Undgå direkte kontakt med huden. - Vask af coverslip tre gange i phosphat bufferet saltvand (PBS)42 ved forsigtigt udlevering og fjerne løsningen.
- Tilføj 15 µL af 100 μg/ml Propidium Iodid og/eller 10 μg/mL hvede-kim-Agglutinin konjugeret til fluorescein isothiocyanat (WGA-FITC) lavet i 50% glycerol til et mærket objektglas.
Bemærk: Propidium Iodid pletter DNA rød til at opdage kromosomale DNA placering, mens WGA-FITC pletter cellevæggen grøn. - Vend coverslip med forsiden nedad på dråbe af fluorescerende plet på glas dias. (Valgfrit) forsegle med klar neglelak for bevarelse af dias. Da farvestofferne er lysfølsomt, inkuberes i 15 minutter i et mørkelagt eller svagt oplyste rum.
- Observere dias under en 100 X mål linse ved hjælp af et fasekontrast eller DIC mikroskop udstyret med epifluorescensmikroskop excitation kuber til propidium Iodid ('Texas Red' Filter Set eller 535/617 nm excitation/emission maxima) og FITC (FITC filtrere sæt eller 490/525 nm excitation/emission maxima).
- Sted diaset på scenen og fokus ved hjælp af grove og fine justeringsknapperne.
- Observere fluorescens som vist andetsteds43.
- Brug en gratis billede analyse softwarepakke, der kan hjælpe med identifikationen af sporer med lavere fluorescens intensitet44.
Representative Results
Indledende fænotyper eksperimenter er nødvendige for at karakterisere nye arter og stammer og kan bruges som en gratis tilgang til phylogenetics og DNA-DNA hybridisering eksperimenter, der anvendes til karakterisering af nye arter. Streptomyces mutanter skyldes tilfældig mutagenese metoder såsom kemiske, UV, eller transposon mutagenese identificeres typisk gennem direkte, visuelle skærme på agar plader. Kolonier af Streptomyces undersøges for ændringer i fænotype i forhold til den vildtype, forældrekontrol stamme. For eksempel, en lysere farvede antenne mycelium tyde på et lavere niveau af grå pigment forårsaget af en defekt i sporulering, eller manglen på en fuzzy udseende er vejledende en blok på antenne mycelium dannelse (figur 1). Mange streptomycetes producere pigmenteret antibiotika i vegetativ mycelium eller omkringliggende agar. S. coelicolor producerer to pigmenteret antibiotika samt to ikke-pigmenterede ones. Actinorhodin er et antibiotikum, blå-pigmenterede og undecylprodigiosin er en rød-pigmenterede antibiotika45. Stammer, der har gennemgået første visuelle koloni skærme propageres derefter af striber for enkelt kolonier.
Efter visuelle identifikation af potentielt interessant mutanter, udsættes stammer til mikroskopisk undersøgelse. Fasekontrast mikroskopi er særligt velegnet til at undersøge Streptomyces mutanter for udviklingsmæssige defekter, ved hjælp af wild-type belastning som en kontrol (figur 2). Vildtype S. coelicolor kolonier typisk producere en antenne mycelium af omkring to dage af vækst ved 30 ° C på MS agar og lange kæder af sporer af tre dage af vækst. Livscyklus vil udvikle sig lidt langsommere eller hurtigere på andre typer medier. Det er bydende nødvendigt, at mutanter skal analyseres under de samme vækstbetingelser som vildtype når konklusioner om udviklingstoksicitet fejl og forsinkelser. Skaldet mutanter kan producere sporer efter langvarig vækst på agar medier. En klasse af mutanter omtales som hvide mutanter kan enten være forsinket for sporedannelse dannelse, viser en reduktion i overflod af sporer produceret, producerer sporer med form og/eller størrelse defekter, eller blot producere lavere niveauer af moden, grå spore pigment46 . Andre mutanter undersøgt hidtil kan forsinkes eller accelereret i livscyklus progression såsom mutanter påvirket til akkumulering af signalering molekyler (fx, cyklisk-di-GMP47).
En simpel opfølgning lysmikroskopi teknik beskrevet ovenfor er Fluorescens mikroskopi bruger propidium Iodid til at pletten kromosomale DNA Xanthophyta og fluorescently mærket hvedekim agglutinin for at plette cellevæggen af sporulering septa. Sporer mangler et kromosom vil være mangler den røde propidium Iodid farvning, mens sporer, der indeholder mindre DNA end sædvanlige kan identificeres, hvis de synes at være faldet farvning (figur 3). Hvedekim agglutinin kan bruges til at plette cellevæggen og forskelle i cellevæggen farvning mønstre (dvs., celledeling defekter) kan observeres. I figur 4 wild-type stamme af S. venezuelae, en art, der bruges som en anden model for nylig har streptomycete sin hurtigere livscyklus og evnen til at sporulate i flydende45, været farvet med WGA-FITC at belyse stigen-lignende række division septa, der typisk ses tidligt under sporedannelse.
De indledende fænotyper strategier beskrevet her bør resultere i følgende: 1) identifikation af mutantstammen af interesse for yderligere undersøgelse; 2) erhvervede viden om den nyligt identificerede mutant og den potentielle rolle i det gen, der har været muteret; 3) udformningen af en efterfølgende række næste eksperimenterende trin, der kan bruges til yderligere at præcisere rollen, som det pågældende gen. I tilfælde af en nyligt identificerede streptomycete fra miljøet, vil forskeren opnå kendskab til de potentielle nye arter i forhold til allerede karakteriseret arter af Streptomyces.
Figur 1: Fotografi af en repræsentativ agar plade demonstrerer makroskopisk koloni fænotyper af S. coelicolor. Agar plade viser den fuzzy, grå visuelle udseende af den antenne mycelium for vildtype S. coelicolor stamme MT1110 (WT) i forhold til forskellige tilfældige transposon indsættelse mutanter med udviklingsmæssige fænotyper. Mutanter enten mangler en antenne mycelium [skaldet (bld)] eller en antenne mycelium med reduceret spore pigmentering [hvid (whi)]. Transposon mutanter blev genereret ved hjælp af mini-Tn5 til indsættelse mutagenese6,7. Stammer var vokset på MS agar til 5 dage ved 30 ° C. Petriskål diameter 100 mm.
Figur 2: Fasekontrast micrographs viser en repræsentant antenne glødetråd for S. coelicolor hvid mutant stammer indeholdende tilfældige transposon indsættelse mutationer. (A) vist er en repræsentativ vildtype antenne glødetråd, der har undergået synkron, regelmæssigt fordelt celledelinger, producerer jævnt formet og mellemstore sporer (MT1110). (B-F) De resterende paneler viser de vidt forskellige mikroskopiske fænotyper af forskellige hvide mutanter, der blev isoleret via tilfældig transposon mutagenese. Panelet B viser en antenne glødetråd, der ikke har undergået sporulering, men i stedet har produceret svulmende områder inden for glødetråden. Lang pilene i C, Dog F indikerer unormalt store sporer, der er karakteristiske for mutanter MIC42, MIC43 og TH49. Den korte pilen i panelet D viser et eksempel på en mængden spore rum. Panel E viser de delvist sammensnøret mindre rum, der er typiske for sporedannelse kæder produceret af mutant TH10. Stammer var vokset på MS agar til 5 dage ved 30 ° C. Mutanter er ikke relateret til dem vist i figur 1. En vildtype spore er ca 1,1 µm på længdeakse. Skalalinjen = 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentant micrographs viser S. coelicolor mutant kromosom segregation fænotyper. (A) A diagram repræsentation viser den typiske vildtype, regelmæssigt fordelt farvning udseende for en kæde af sporer (hver spore indeholder kromosomale DNA) i forhold til den intermitterende farvning mønster for en mutant, der viser et kromosom segregation defekt. (B) hvert par af paneler viser den samme spore kæde observeret af Differential interferens kontrast (DIC) billede til venstre og en propidium Iodid-farvede fluorescens billede er vist til højre. Wild-type fænotype (en, b) er i forhold til to tilfældige transposon indsættelse mutanter (c, d og e, f). Pilene angiver sporer blottet for DNA. Stammer var vokset på MS agar til 5 dage ved 30 ° C. Mutanter vist er uden tilknytning til de i figur 1 og figur 2. Skalalinjen = 1 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fluorescens Mikrograf af S. venezuelae vildtype stamme farves med WGA-FITC. (A) A diagram af en antenne glødetrådens vises glat med ingen fordybninger og ingen synlige tegn på sporulering bruger fasekonstrastmikroskopi sammenlignet med stigen-lignende matrix af cellevæggen farvning, der angiver et tidligt stadium af sporulering har begyndt i den samme glødetrådens benytter WGA-FITC under Fluorescens mikroskopi. (B) Micrographs af vildtype S. venezuelae. (en) glat antenne filamenter er til stede blandt kæder af sporer. (b) inden for mycelium vist i panelet en, en antenne glødetråden på et tidligt tidspunkt i udviklingen besidder en stigen-lignende vifte af cellevæggen deposition. Pilene angiver den regelmæssigt fordelt dannelsen af cross-vægge plettet af WGA-FITC, der udvikler synkront inden for en enkelt antenne glødetråd, som gennemgår udviklingshæmmede forbundet sporulering. Stammen var vokset på MYM (Maltose, Yøst ekstrakt, Malt ekstrakt) MYM agar i 38 timer ved 30 ° C. Skalalinjen = 2 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her præsenterer vi protokoller til begyndelsen Streptomyces forskere for at indlede undersøgelser ved at inkludere de nødvendige skridt for at udbrede stammer og forberede lagre langtidslageret. Derefter beskriver vi protokollerne for visuelle og mikroskopiske karakterisering af Streptomyces stammer. Nogle typiske indledende skridt i fænotyper udviklingsmæssige mutanter er: 1) visuel undersøgelse af mutant kolonierne i forhold til vildtype kolonier på agarsubstratet; 2) fasekontrast mikroskopi; og 3) Fluorescens mikroskopi af sporogenic antenne hyfer. Baseret på fænotype vises i disse tre trin, kan være ansat en række teknikker til yderligere skelne fænotype for en bestemt stamme.
Indledende fænotyper eksperimenter er almindeligt anvendt til at karakterisere nye arter, identificere mutanter af interesse, delvist karakterisere mutanter og begynde at skimte et bestemt gen baseret på Fænotypen af en identificeret mutant typiske rolle. Metoderne beskrevet her er allerede blevet anvendt i university undervisning laboratorier til at identificere og karakterisere en bred vifte af Streptomyces mutanter, inklusive dem med fejl i celledelingen48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporulering55,56, antenne mycelium dannelse57,58, antibiotika produktion59, second messenger signaling47og kromosom adskillelse 60. disse teknikker er de vigtige første skridt til fastlæggelse af Fænotypen af mutanter i almindelighed og afslører en stor mængde af vigtige oplysninger om rollerne af gener af interesse. Metoderne kan nemt udvides til andre arter af Streptomyces og har allerede været brugt til at beskrive stammer af S. griseus, S. venezuelae, S. fnatog mange andre streptomycetes. De video protokoller er beskrevet her forventes at fungere som en vigtig ressource for nye forskere ind Streptomyces forskningsområder, som inden for drug discovery. Dette omfatter de nye instruktører, der arbejder for at bekæmpe krisen i antibiotikaresistens og uddanne de utallige antal nye bachelor studerende forskere at deltage crowdsourcing indsats af initiativet lille verden.
De teknikker, der beskrives her kan tilpasses nemt til college og high school klasseværelset brug ud over forskningslaboratorier, ved hjælp af de ændringer, der er beskrevet i den video og tekst. Studerende i en første år mikroskopi modul på en lille liberal arts college var købedygtig streak stammer, tage digitale billeder af stammer, der er dyrket på agar medier og udføre fase-kontrast og Fluorescens mikroskopi, der kulminerede i indgivelse af en portefølje af multi paneled tal i slutningen af modulet 3 uge, der repræsenterer 15 h laboratoriearbejde. Cirka 160 førsteårsstuderende var ansvarlig for den indledende fænotyper af 320 roman transposon mutanter. Bachelor forskning studerende på tre institutioner deltog i den oprindelige fænotyper af yderligere mutanter og efterfølgende karakterisering af mange af stammer. Omfattende oplysninger indhentet i en relativt kort periode, illustrerer værdien af de protokoller, der er beskrevet her. Hundredvis af yderligere mutanter er blevet gemt som glycerol mycelial bestande for fremtidige karakterisering.
Efter de indledende eksperimenter beskrevet her, kan være ansat en række metoder til at udvide kvaliteten af oplysninger vedrørende stammer af interesse. Hvis mutation er ukendt, skal en genotypebestemmelse metode anvendes til at bestemme type og/eller placering af mutation. For eksempel, tilfældige transposon mutagenese af vildtype kromosom6,7,8,9,10,11,12,13 resultater i kolonier, der underkastes indledende fænotypiske skærme som disse beskrevet ovenfor. Derefter bør placeringen af transposon identificeres ved hjælp af en teknik som inverse polymerase kæde reaktion (iPCR)61. Bestemmelse af genotype af nyopdagede mutanter er et vigtigt skridt efter første karakterisering.
Nogle almindeligt anvendte avancerede metoder til efterfølgende fænotyper analyse, der kan nævnes i klasseværelset eller udforskes gennem yderligere forskning omfatter grøn fluorescerende proteiner (NGL) kodning for at bestemme lokalisering mønstre for protein af interesse, gen expression analyser som real tid kvantitativ PCR (qPCR) og global gen expression mønstre af vildtype versus mutant via RNA sekventering (RNA-seq). Fænotyper færdigheder er også behov for genetiske komplementering analyse. I en komplementering eksperiment, er wild-type kopi af et gen indført i en muteret stamme til at afgøre, om den nyligt tilføjede allel kan kompensere for tab af funktion af den muterede allel. Sammenligne Fænotypen af suppleret stammen til både den oprindelige mutant og forældreorganismen, er wild-type stamme påkrævet.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Cobalt402 Universitet for Undergraduate studerende forskning stipendier og studerende forskning Fund Awards GVK og SGK; og Cobalt402 Professor Gilbert E. Mills Memorial begavet orlov Program Award og Institut for biologi og Earth Science fakultetet forskning og stipendium begavet Award til JAB. Bert og Jane Horn begavet elev Research Fund i videnskaberne blev tildelt GVK og SGK. Forfatterne vil gerne parlamentsarbejdet Duquesne Universitet finansieret Undergraduate Research Program stipendier for GVK og SGK. Tidligere Juniata College bachelor forskning studerende, Ryan Johnson og Lindsey Draper bidraget mikroskopi billeder til figur 2 og 3, henholdsvis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immersion Oil (Type DF) | Cragille | 16482 | |
| Lens Paper | Fisherbrand | 11-995 | |
| Sterile Water | GeneMate | G-3250-1L | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Toothpicks (flat) | Target | 081-22-1957 | |
| Pipette Tips (10 mL) | GeneMate | P-1240-10 | |
| Pipette Tips (200 mL) | GeneMate | P-1240-200Y | |
| Pipette Tips (1,250 mL) | GeneMate | P-1240-1250 | |
| Wooden Applicators 6'' | Solon Care | 070809 | |
| Cotton Swabs | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| Soy Flour | Bob's Red Mill | 1516C164 | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-1KG | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Glycerol 100% | VWR amresco life science | 0854-1L | |
| 0.8% NaCl (Saline) | Sigma-Aldrich | SLBB9000V | |
| 1.2 mL freezer tube | NEST | 606101 | |
| Ultra low (-80 °C) freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Cryo Safety Gloves | Bel-Art | H13201 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
| Cover slips #1.5 | Thomas Scientific | 64-0721 | |
| Slides | Carolina | 63-2010 | |
| Autoclave | Tuttnauer | 2540E | |
| Phase-Contrast Microscope | Olympus | BX40 | |
| Forceps | Carolina Biological | 624504 | |
| Bunsen Burner | Carolina Biological | 706706 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| PBS (phosphate buffer saline) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| WGA-FITC | Biotium | 29022-1 | |
| Clear nail polish | OPI | 22001009000 | |
| ImageJ | NIH | Free Software | |
| 100 mL beaker | Pyrex USA | 1000-T | |
| 1 L beaker | Carolina Biological | 721253 | |
| 1 L flask | Fisherbrand | S63274 | |
| 250 mL flask | Pyrex USA | 4980 | |
| 100 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721788 | |
| 500 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721792 | |
| Stir Bar | Fisher Scientific | 22-271825 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Camera for Microscope | Olympus | DP72 | |
| Nitrile Examination Gloves (Med) | Bio Excell | 71011002 | |
| Vortex Mixer | Carolina Biological | 701077 |
References
- Barka, E. A., et al. Taxonomy, physiology, and natural products of Actinobacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 1-43 (2015).
- Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (2), 141-147 (2002).
- Redenbach, M., et al. A set of ordered cosmids and a detailed genetic and physical map for the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3(2) chromosome. Mol. Microbiol. 21 (1), 77-96 (1996).
- McCormick, J. R., Flardh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36 (1), 206-231 (2012).
- Flardh, K., Buttner, M. J. Streptomyces morphogenetics: dissecting differentiation in a filamentous bacterium. Nat. Rev. Microbiol. 7 (1), 36-49 (2009).
- Bennett, J. A. Molecular Genetic analysis of division and development in Streptomyces coelicolor. , Ph.D. Dissertation (2007).
- Hull, T. D., et al. Cyclic Di-GMP phosphodiesterases RmdA and RmdB are involved in regulating colony morphology and development in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 194 (17), 4642-4651 (2012).
- Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo Tn5-based transposon mutagenesis of streptomycetes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 83 (5), 979-986 (2009).
- Xu, Z., et al. Large-Scale Transposition Mutagenesis of Streptomyces coelicolor Identifies Hundreds of Genes Influencing Antibiotic Biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
- Fernandez-Martinez, L. T., et al. A transposon insertion single-gene knockout library and new ordered cosmid library for the model organism Streptomyces coelicolor A3(2). Antonie Van Leeuwenhoek. 99 (3), 515-522 (2011).
- Gehring, A. M., Nodwell, J. R., Beverley, S. M., Losick, R. Genomewide insertional mutagenesis in Streptomyces coelicolor reveals additional genes involved in morphological differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (17), 9642-9647 (2000).
- Bishop, A., Fielding, S., Dyson, P., Herron, P. Systematic insertional mutagenesis of a streptomycete genome: a link between osmoadaptation and antibiotic production. Genome Res. 14 (5), 893-900 (2004).
- Bilyk, B., Weber, S., Myronovskyi, M., Bilyk, O., Petzke, L., Luzhetskyy, A. In vivo random mutagenesis of streptomycetes using mariner-based transposon Himar1. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (1), 351-359 (2013).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. (2000).
- Gust, B., Kieser, T., Chater, K. F. REDIRECT technology: PCR-targeting system in Streptomyces coelicolor. , John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, United Kingdom. (2002).
- Gust, B., Chandra, G., Jakimowicz, D., Yuqing, T., Bruton, C. J., Chater, K. F. Lambda red-mediated genetic manipulation of antibiotic-producing Streptomyces. Adv. Appl. Microbiol. 54, 107-128 (2004).
- Tong, Y., Charusanti, P., Zhang, L., Weber, T., Lee, S. Y. CRISPR-Cas9 based engineering of Actinomycetal genomes. ACS Synth. Biol. 4 (9), 1020-1029 (2015).
- Huang, H., Zheng, G., Jiang, W., Hu, H., Lu, Y. One-step high-efficiency CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Streptomyces. Acta BiochimBiophys. Sin.(Shanghai). 47 (4), 231-243 (2015).
- Cobb, R. E., Wang, Y., Zhao, H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS Synth. Biol. 4 (6), 723-728 (2015).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Brown, E. D., Wright, G. D. Antibacterial drug discovery in the resistance era. Nature. 529 (7586), 336-343 (2016).
- Dodds, D. R. Antibiotic resistance: A current epilogue. Biochem. Pharmacol. 134, 139-146 (2017).
- Caruso, J. P., Israel, N., Rowland, K., Lovelace, M. J., Saunders, M. J. Citizen Science: The Small World Initiative improved lecture grades and California critical thinking skills test scores of nonscience major students at Florida Atlantic University. J. Microbiol. Biol. Educ. 17 (1), 156-162 (2016).
- Davis, E., et al. Antibiotic discovery throughout the Small World Initiative: A molecular strategy to identify biosynthetic gene clusters involved in antagonistic activity. Microbiology Open. 6 (3), (2017).
- van Keulen, G., Dyson, P. J. Production of specialized metabolites by Streptomyces coelicolor A3(2). Adv. Appl. Microbiol. 89, 217-266 (2014).
- Aigle, B., et al.
- Antoraz, S., Santamaria, R. I., Diaz, M., Sanz, D., Rodriguez, H. Toward a new focus in antibiotic and drug discovery from the Streptomyces arsenal. Front. Microbiol. 6, 461 (2015).
- Onaka, H. Novel antibiotic screening methods to awaken silent or cryptic secondary metabolic pathways in actinomycetes. J. Antibiot.(Tokyo). 70 (8), 865-870 (2017).
- Chen, J., Wu, Q., Hawas, U. W., Wang, H. Genetic regulation and manipulation for natural product discovery. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100 (7), 2953-2965 (2016).
- Katz, L., Baltz, R. H. Natural product discovery: past, present, and future. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 155-176 (2016).
- Liu, G., Chater, K. F., Chandra, G., Niu, G., Tan, H. Molecular regulation of antibiotic biosynthesis in Streptomyces. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 77 (1), 112-143 (2013).
- den Hengst, C. D., Tran, N. T., Bibb, M. J., Chandra, G., Leskiw, B. K., Buttner, M. J. Genes essential for morphological development and antibiotic production in Streptomyces coelicolor are targets of BldD during vegetative growth. Mol. Microbiol. 78 (2), 361-379 (2010).
- Tran, N. T., Den Hengst, C. D., Gomez-Escribano, J. P., Buttner, M. J. Identification and characterization of CdgB, a diguanylate cyclase involved in developmental processes in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 193 (12), 3100-3108 (2011).
- Anonymous. Lab Safety. Proper Use of Autoclaves. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Border, B. G., Rice-Spearman, L. Microwaves in the laboratory: effective decontamination. Clin. Lab. Sci. 12 (3), 156-160 (1999).
- Bhattacharjee, M. K., Delsol, J. K. Does microwave sterilization of growth media involve any non-thermal effect? J. Microbiol. Methods. 96, 70-72 (2014).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. An Introduction to the Micropipettor. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Baltz, R. H. Genetic manipulation of secondary metabolite biosynthesis for improved production in Streptomyces and other actinomycetes. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 43 (2-3), 343-370 (2016).
- Frohlich, V. C. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. J. Vis. Exp. (18), e844 (2008).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Light Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory. 3, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
- Anonymous, General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2017).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anat. Rec.(Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Chater, K. F. Recent advances in understanding Streptomyces. F1000Res. 5, (2016).
- Chater, K. F. Regulation of sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2): a checkpoint multiplex? Curr. Opin. Microbiol. 4 (6), 667-673 (2016).
- Tschowri, N. Cyclic dinucleotide-controlled regulatory pathways in Streptomyces species. J. Bacteriol. 198 (1), 47-54 (2016).
- Bennett, J. A., et al. Medium-dependent phenotypes of Streptomyces coelicolor with mutations in ftsI or ftsW. J. Bacteriol. 191 (2), 661-664 (2009).
- Mistry, B. V., Del Sol, R., Wright, C., Findlay, K., Dyson, P. FtsW is a dispensable cell division protein required for Z-ring stabilization during sporulation septation in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190 (16), 5555-5566 (2008).
- Bennett, J. A., Aimino, R. M., McCormick, J. R. Streptomyces coelicolor genes ftsL and divIC play a role in cell division but are dispensable for colony formation. J. Bacteriol. 189 (24), 8982-8992 (2007).
- Bennett, J. A., McCormick, J. R. Two new loci affecting cell division identified as suppressors of an ftsQ-null mutation in Streptomyces coelicolor A3(2). FEMS Microbiol. Lett. 202 (2), 251-256 (2001).
- Dharmatilake, A. J., Kendrick, K. E. Expression of the division-controlling gene ftsZ during growth and sporulation of the filamentous bacterium Streptomyces griseus. Gene. 147 (1), 21-28 (1994).
- McCormick, J. R., Losick, R. Cell division gene ftsQ is required for efficient sporulation but not growth and viability in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 178 (17), 5295-5301 (1996).
- McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14 (2), 243-254 (1994).
- Flärdh, K., Findlay, K. C., Chater, K. F. Association of early sporulation genes with suggested developmental decision points in Streptomyces coelicolor A3(2). Microbiology. 145 (9), 2229-2243 (1999).
- van Wezel, G. P., van der Meulen, J., Kawamoto, S., Luiten, R. G., Koerten, H. K., Kraal, B. ssgA is essential for sporulation of Streptomyces coelicolor A3(2) and affects hyphal development by stimulating septum formation. J. Bacteriol. 182 (20), 5653-5662 (2000).
- Capstick, D. S., Willey, J. M., Buttner, M. J., Elliot, M. A. SapB and the chaplins: connections between morphogenetic proteins in Streptomyces coelicolor. Mol. Microbiol. 64 (3), 602-613 (2007).
- Ma, H., Kendall, K. Cloning and analysis of a gene cluster from Streptomyces coelicolor that causes accelerated aerial mycelium formation in Streptomyces lividans. J. Bacteriol. 176 (12), 3800-3811 (1994).
- Xu, Z., et al. Large-scale transposition mutagenesis of Streptomyces coelicolor identifies hundreds of genes influencing antibiotic biosynthesis. Appl. Environ. Microbiol. 83 (6), (2017).
- Dedrick, R. M., Wildschutte, H., McCormick, J. R. Genetic interactions of smc, ftsK, and parB genes in Streptomyces coelicolor and their developmental genome segregation phenotypes. J. Bacteriol. 191 (1), 320-332 (2009).
- Pavlopoulos, A. Identification of DNA sequences that flank a known region by inverse PCR. Methods Mol. Biol. 772, 267-275 (2011).
