यहां हम नौसिखिए शोधकर्ताओं के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल को औषधीय महत्वपूर्ण जीवाणु जीनस Streptomycesके लिए phenotyping शुरू करते हैं ।
Streptomycetes जाति Actinobacteria है कि दुनिया भर में पाया जाता है और एंटीबायोटिक दवाओं और अन्य माध्यमिक चयापचयों की एक विस्तृत सरणी का उत्पादन करने के लिए संबंधित रेशा मिट्टी बैक्टीरिया हैं । Streptomyces coelicolor एक अच्छी तरह से विशेषता है, गैर रोगजनक प्रजातियों कि लैब में विश्लेषण की एक किस्म के लिए उत्तरदायी है । phenotyping तरीके यहां वर्णित एक मॉडल streptomycete के रूप में एस coelicolor का उपयोग करें; हालांकि, तरीके इस बड़े जीनस के सभी सदस्यों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ बारीकी से संबंधित actinomycetes के लिए लागू कर रहे हैं । Phenotyping Streptomyces की नई प्रजातियों के वातावरण में पहचान की विशेषता आवश्यक है, और यह भी निस्र्पक में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है Streptomycesके नए अलग उत्परिवर्ती उपभेदों । phenotyping में प्रवीणता कई नए शोधकर्ताओं जो Streptomyces अनुसंधान के क्षेत्र में प्रवेश कर रहे हैं, जो जीवाणु विकास के अध्ययन, कोशिका विभाजन, गुणसूत्र अलगाव, और दूसरा दूत संकेतन शामिल है के लिए महत्वपूर्ण है । नई मिट्टी रोगाणुओं के अलगाव के माध्यम से एंटीबायोटिक खोज के हाल के crowdsourcing प्रशिक्षकों के लिए phenotyping में प्रशिक्षण के लिए एक वृद्धि की जरूरत Streptomyces अनुसंधान और उनके कॉलेज या उच्च विद्यालय के छात्रों के क्षेत्र के लिए नए के परिणामस्वरूप है । इस पांडुलिपि दृश्य और सूक्ष्म परीक्षा के माध्यम से बैक्टीरियल तनाव प्रचार, भंडारण, और लक्षण वर्णन के लिए तरीके बताता है । इस लेख को पढ़ने के बाद, नए शोधकर्ताओं (माइक्रोबायोलॉजी शिक्षा प्रयोगशालाओं और नागरिक वैज्ञानिकों) Streptomyces उपभेदों में हेरफेर और दृश्य लक्षण वर्णन प्रयोगों शुरू करने में सक्षम होना चाहिए.
Streptomycetes ग्राम पॉजिटिव, रेशा मिट्टी के लिए अपने माध्यमिक चयापचयों की एक किस्म, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबायोटिक दवाओं के दो तिहाई से अधिक, साथ ही विरोधी ट्यूमर, विरोधी एचआईवी, और विरोधी परजीवी दवाओं के उत्पादन की क्षमता के लिए जाना जाता बैक्टीरिया हैं 1. S. coelicolor जीनस2,3 की सबसे आनुवंशिक रूप से विशेषता सदस्य है और यहां वर्णित तरीकों में इस्तेमाल प्रजातियों है । एस coelicolor एक जटिल जीवन चक्र है कि एक एकल बीजाणु के अंकुरण के साथ शुरू होता है, एक व्यापक, वनस्पति mycelium शाखाओं में बढ़ता है कि आगर माध्यम में बढ़ रही है । के रूप में जीवन चक्र आय, हवाई तंतुओं का गठन कर रहे है कि सब्सट्रेट mycelium की सतह तनाव को तोड़ने और अंततः कोशिकाओं है कि अंततः परिपक्व, भूरे रंग के बीजाणुओं में बदल रहे है की लंबी श्रृंखला में विभाजित हैं । इन नवगठित बीजाणुओं के फैलाव का गठन अगले जीवन चक्र की शुरुआत4.
भेदभाव के अपने जटिल पैटर्न के कारण, एस coelicolor बैक्टीरियल विकास के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में कार्य करता है । ऐतिहासिक, उत्परिवर्तनों विकास के दो प्रमुख चरणों के लिए ब्लॉकों में परिणाम और अलग दृश्य phenotypes का उत्पादन । bld (गंजा) म्यूटेंट हवाई mycelium गठन और एक फजी हवाई mycelium की कमी में परिणाम के लिए अवरुद्ध कर रहे है एक “गंजा” कॉलोनी उपस्थिति बीटेक । म्यूटेंट बीजाणु गठन और परिपक्वता में हिचक whi (सफेद) म्यूटेंट के रूप में जाना जाता है क्योंकि वे आम तौर पर भूरे बीजाणु वर्णक के जंगली प्रकार के स्तर का उत्पादन करने में विफल और हवाई mycelium सफेद रहता है । अन्य रोचक म्यूटेंट एंटीबायोटिक उत्पादन, सेल डिवीजन, गुणसूत्र अलगाव, या अन्य महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में हिचक रहे हैं4,5.
Streptomyces प्रजातियों में कई विकासात्मक जीन की खोज के बावजूद, वहां के उत्परिवर्ती स्क्रीन के संतृप्ति की कमी के आधार पर मौजूद करने के लिए कई और अधिक विश्वास कर रहे हैं । हमारी प्रयोगशालाओं के लिए एक मिनी transposon प्रणाली है कि हम का निर्माण किया है का उपयोग कर नए विकास जीन की पहचान जारी है । उपंयास उत्परिवर्ती हमारे transposon के साथ यादृच्छिक mutagenesis प्रयोगों में अलग उपभेदों phenotypic स्क्रीनिंग से गुजरना करने के लिए प्रत्येक नए जीन की संभावित भूमिका की पहचान6,7की खोज की । यहां वर्णित बैक्टीरियल phenotyping के लिए तरीके transposon mutagenesis8,9,10,11,12द्वारा पृथक Streptomyces म्यूटेंट के लिए प्रासंगिक हैं, 13 और अंय ऐसे रासायनिक और अल्ट्रा वायलेट (यूवी) mutagenesis14के रूप में यादृच्छिक तरीके, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से recombineering का उपयोग कर जीन विलोपन के रूप में उत्परिवर्तनों का निर्देशन निर्माण15,16 या CRISPR-Cas9 (संकुल नियमित रूप से अंतराल लघु Palindromic दोहराता) जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी17,18,19 और अंक उत्परिवर्तनों20।
रोगजनकों के बीच एंटीबायोटिक प्रतिरोध के रूप में तेजी से प्रचलित हो जाता है, नई एंटीबायोटिक दवाओं के लिए की जरूरत तेजी से21,22अत्यावश्यक हो जाता है । “लघु विश्व पहल” (या SWI) एक प्रभावी विज्ञान है, प्रौद्योगिकी, इंजीनियरिंग और गणित (स्टेम) सीखने23 और अनुसंधान रणनीति24 कॉलेज के छात्रों के crowdsourcing के माध्यम से एंटीबायोटिक प्रतिरोध का मुकाबला करने के लिए, और अधिक हाल ही में हाई स्कूल के छात्र । समर्थित पाठ्यक्रमों काम नई मिट्टी रोगाणुओं कि उपंयास एंटीबायोटिक दवाओं (http://www.smallworldinitiative.org) का उत्पादन की पहचान भी शामिल है । यह माना जाता है कि अनदेखा एंटीबायोटिक दवाओं का एक प्रमुख स्रोत Streptomyces प्रजातियों मिट्टी और पानी के निवास की एक विस्तृत श्रृंखला में पाया जारी रहेगा25,26,27,28, 29,31. हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों के काम की खोज की है और Streptomyces प्रजातियों में संकेतन जीन विशेषता है कि, एंटीबायोटिक उत्पादन7,३२सहित आकृति विज्ञान और विकास को विनियमित, ३३. इन जीनों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की मात्रा और एंटीबायोटिक दवाओं के समय में परिवर्तन का उत्पादन किया । नई प्रजातियों और नए एंटीबायोटिक उत्पादक म्यूटेंट के कुशल phenotyping के लिए महत्वपूर्ण रहेंगे । के रूप में नए प्रशिक्षकों और उनके छात्रों को दवा की खोज के क्षेत्र में प्रमुख योगदान हो, बैक्टीरियल phenotyping में प्रशिक्षण इन नौसिखिए व्यक्तियों की सफलता के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, इन प्रयोगों उच्च विद्यालय स्टेम या विश्वविद्यालय माइक्रोबायोलॉजी शिक्षा प्रयोगशालाओं के लिए परित्याग कर रहे हैं. वे एक शिक्षण प्रयोगशाला सेटिंग में बुनियादी माइक्रोबियल आनुवंशिक सिद्धांतों के प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
यहां हम शुरुआत Streptomyces शोधकर्ताओं के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए उपभेदों प्रचार और लंबी अवधि के भंडारण के लिए शेयरों को तैयार करने की जरूरत है सहित द्वारा अध्ययन शुरू । हम तो Streptomyces उपभेदों के दृश्य और सूक्ष्म लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । phenotyping विकासात्मक म्यूटेंट में कुछ ठेठ प्रारंभिक कदम हैं: 1) आगर माध्यम पर जंगली प्रकार की कालोनियों की तुलना में उत्परिवर्ती कालोनियों के दृश्य परीक्षा; 2) चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी; और ३) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ऑफ sporogenic एरियल hyphae. इन तीन चरणों में प्रदर्शित phenotype पर आधारित है, तकनीक की एक किस्म के आगे एक विशेष तनाव के phenotype विचार नियोजित किया जा सकता है ।
प्रारंभिक phenotyping प्रयोगों आमतौर पर नई प्रजातियों की विशेषता के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, ब्याज की म्यूटेंट की पहचान, आंशिक रूप से म्यूटेंट विशेषताएं, और एक विशेष जीन की विशिष्ट भूमिका एक पहचान उत्परिवर्ती के phenotype के आधार पर विचार शुरू करते हैं । यहां वर्णित तरीके पहले से ही विश्वविद्यालय शिक्षण प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है की पहचान करने और कोशिका विभाजन ४८,४९में दोषों के साथ उन सहित Streptomyces म्यूटेंट, की एक विस्तृत विविधता की विशेषता, ५० , ५१ , ५२ , ५३ , ५४, sporulation५५,५६, हवाई mycelium गठन५७,५८, एंटीबायोटिक उत्पादन५९, दूसरा दूत संकेतन४७, और गुणसूत्र अलगाव ६०. इन तकनीकों में सामान्य रूप से म्यूटेंट के phenotype का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण पहला कदम है और ब्याज की जीन की भूमिकाओं के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी की एक बड़ी राशि का पता चलता है. तरीकों को आसानी से Streptomyces की अंय प्रजातियों के लिए बढ़ाया जा सकता है और पहले से ही एस griseus, एस वेनेजुएला, एस खुजली, और कई अंय streptomycetes के उपभेदों का वर्णन किया गया है । वीडियो प्रोटोकॉल यहां वर्णित नए शोधकर्ताओं Streptomyces अनुसंधान के क्षेत्रों में प्रवेश करने के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन के रूप में सेवा की उंमीद कर रहे हैं, जैसे दवा खोज के क्षेत्र में । यह नए प्रशिक्षकों जो एंटीबायोटिक प्रतिरोध संकट से निपटने और नए स्नातक छात्र छोटे दुनिया की पहल के crowdsourcing प्रयासों में शामिल होने के शोधकर्ताओं के अनगिनत संख्या को शिक्षित करने के लिए काम कर रहे है शामिल हैं ।
यहां वर्णित तकनीकों को आसानी से कॉलेज और अनुसंधान प्रयोगशालाओं के अलावा उच्च विद्यालय कक्षा उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, वीडियो और पाठ में वर्णित संशोधनों का उपयोग कर । एक छोटे से लिबरल आर्ट्स कॉलेज में एक प्रथम वर्ष माइक्रोस्कोपी मॉड्यूल में छात्रों लकीर उपभेदों करने में सक्षम थे, आगर मीडिया पर बड़े उपभेदों के डिजिटल तस्वीरें ले, और चरण-कंट्रास्ट और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जो एक के प्रस्तुतीकरण में समापन प्रदर्शन 3 सप्ताह के मॉड्यूल के अंत में बहु पैनल आंकड़े के पोर्टफोलियो, में प्रयोगशाला काम के 15 एच का प्रतिनिधित्व । लगभग १६० प्रथम वर्ष के छात्रों को ३२० उपंयास transposon म्यूटेंट के प्रारंभिक phenotyping के लिए जिंमेदार थे । तीन संस्थानों में स्नातक अनुसंधान छात्रों अतिरिक्त म्यूटेंट के प्रारंभिक phenotyping और उपभेदों के कई के बाद के लक्षण वर्णन में भाग लिया । व्यापक डेटा एक अपेक्षाकृत कम समय में प्राप्त की, यहां वर्णित प्रोटोकॉल का मूल्य वर्णन । अतिरिक्त म्यूटेंट के सैकड़ों भविष्य के लक्षण वर्णन के लिए ग्लिसरॉल mycelial स्टॉक के रूप में संग्रहित किया गया है ।
प्रारंभिक प्रयोगों के बाद यहां वर्णित है, तरीकों की एक किस्म के लिए ब्याज की उपभेदों से संबंधित जानकारी की गुणवत्ता का विस्तार नियोजित किया जा सकता है । यदि उत्परिवर्तन अज्ञात है, एक genotyping विधि के प्रकार और/या उत्परिवर्तन के स्थान निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, यादृच्छिक transposon mutagenesis के जंगली प्रकार गुणसूत्र6,7,8,9,10,11,12,13 कालोनियों में परिणाम है कि इस तरह के ऊपर वर्णित के रूप में प्रारंभिक phenotypic स्क्रीन से गुजरना चाहिए । फिर transposon का स्थान विलोम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (iPCR)६१जैसी तकनीक का प्रयोग करके पहचाना जाना चाहिए । नव खोजा म्यूटेंट के जीनोटाइप का निर्धारण प्रारंभिक लक्षण वर्णन के बाद एक महत्वपूर्ण कदम है ।
कुछ आमतौर पर बाद में phenotyping विश्लेषण है कि कक्षा में उल्लेख किया जा सकता है या आगे अनुसंधान के माध्यम से पता लगाया के लिए उंनत तरीकों का इस्तेमाल हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) टैगिंग के लिए ब्याज की प्रोटीन के लिए स्थानीयकरण पैटर्न निर्धारित शामिल हैं, इस तरह के वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) और विश्व जीन के रूप में जंगली-प्रकार बनाम उत्परिवर्ती का एक आरएनए अनुक्रमण के माध्यम से (आरएनए-seq) के रूप में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण । Phenotyping कौशल भी आनुवंशिक पूरक विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं । एक पूरक प्रयोग में, एक जीन की जंगली प्रकार की नकल एक रूपांतरित तनाव में पेश किया है निर्धारित करने के लिए कि क्या नव जोड़ा एलील के नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते है–के रूपांतरित एलील के समारोह । दोनों मूल उत्परिवर्ती और पैतृक, जंगली प्रकार के तनाव की है कि करने के लिए पूरित तनाव के phenotype की तुलना की आवश्यकता है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक जीवीके और SGK को स्नातक छात्र अनुसंधान फैलोशिप और छात्र अनुसंधान निधि पुरस्कार के लिए Otterbein विश्वविद्यालय को स्वीकार करना चाहते हैं; और Otterbein के प्रोफेसर गिल्बर्ट ई. मिल्स मेमोरियल संपंन विश्राम कार्यक्रम पुरस्कार और जीव विज्ञान और पृथ्वी साइंस संकाय अनुसंधान और छात्रवृत्ति संपंन पुरस्कार के लिए विभाग । विज्ञान में बर्ट व जेन हॉर्न संपन्न छात्र शोध कोष में जीवीके व SGK को सम्मानित किया गया । लेखकों को भी कृतज्ञता स्वीकार Duquesne विश्वविद्यालय वित्त पोषण जीवीके और SGK के लिए स्नातक अनुसंधान कार्यक्रम फैलोशिप पोषित करना चाहूंगा । पूर्व Juniata कॉलेज स्नातक अनुसंधान छात्रों, रयान जॉनसन और Lindsey ड्रेपर 2 और 3, क्रमशः आंकड़े के लिए सूक्ष्म छवियों का योगदान दिया ।
50% Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Immersion Oil (Type DF) | Cragille | 16482 | |
Lens Paper | Fisherbrand | 11-995 | |
Sterile Water | GeneMate | G-3250-1L | |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Toothpicks (flat) | Target | 081-22-1957 | |
Pipette Tips (10 ml) | GeneMate | P-1240-10 | |
Pipette Tips (200 ml) | GeneMate | P-1240-200Y | |
Pipette Tips (1250 ml) | GeneMate | P-1240-1250 | |
Wooden Applicators 6'' | Solon Care | 070809 | |
Cotton Swabs | Fisherbrand | 23-400-124 | |
Soy Flour | Bob's Red Mill | 1516C164 | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-1KG | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
Glycerol 100% | VWR amresco life science | 0854-1L | |
0.8% NaCl (Saline) | Sigma-Aldrich | SLBB9000V | |
1.2 mL freezer tube | NEST | 606101 | |
Ultra low (-80°C) freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Cryo Safety Gloves | Bel-Art | H13201 | |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
Cover slips #1.5 | Thomas Scientific | 64-0721 | |
Slides | Carolina | 63-2010 | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540E | |
Phase-Contrast Microscope | Olympus | BX40 | |
Forceps | Carolina Biological | 624504 | |
Bunsen Burner | Carolina Biological | 706706 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
PBS (phosphate buffer saline) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
WGA-FITC | Biotium | 29022-1 | |
Clear nail polish | OPI | 22001009000 | |
Image J | NIH | Free Software | |
100 mL beaker | Pyrex USA | 1000-T | |
1 L beaker | Carolina Biological | 721253 | |
1 L flask | Fisherbrand | S63274 | |
250 mL flask | Pyrex USA | 4980 | |
100 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721788 | |
500 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721792 | |
Stir Bar | Fisher Scientific | 22-271825 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Camera for Microscope | Olympus | DP72 | |
Nitrile Examination Gloves (Med) | Bio Excell | 71011002 | |
Vortex Mixer | Carolina Biological | 701077 |