Her presenterer vi protokoller for nybegynner forskere for å starte phenotyping for farmakologisk viktig bakteriell slekten Streptomyces.
Streptomycetes er trådformede jord bakterier tilhører rekken Actinobacteria som finnes over hele verden og produserer en rekke antibiotika og andre sekundære metabolitter. Streptomyces coelicolor er et godt karakterisert, ikke-patogene som passer til en rekke analyser i laboratoriet. Phenotyping-metodene som er beskrevet bruker her S. coelicolor som en modell streptomycete; men gjelder metodene for alle medlemmer av denne store gruppen som noen nært beslektede actinomycetes. Phenotyping er nødvendig å karakterisere nye arter av Streptomyces identifisert i miljøet, og det er også et viktig første steg i karakteriserer nylig isolert mutant stammer av Streptomyces. I phenotyping er viktig for mange nye forskerne som inn i feltet av Streptomyces forskning, som omfatter studiet av bakteriell utvikling, celledeling, kromosom segregering og andre messenger signalering. Den siste crowdsourcing av antibiotika funnet isolering av ny jord mikrober har ført til økt behov for opplæring i phenotyping for instruktører nye feltet på Streptomyces forskning og deres skole eller høy studenter. Dette manuskriptet beskriver metoder for bakterielle belastningen forplantning, lagring og karakterisering gjennom visuelle og mikroskopisk undersøkelse. Etter å ha lest denne artikkelen, bør nye forskere (mikrobiologi utdanning laboratorier og borger forskere) kunne manipulere Streptomyces stammer og begynne visuelle karakterisering eksperimenter.
Streptomycetes er Gram-positive, trådformede jord bakterier kjent for sin evne til å produsere en rekke sekundære metabolitter, inkludert over to tredeler av kommersielt tilgjengelig antibiotika, så vel som anti-svulst, anti-HIV og anti-parasittiske medisiner 1. S. coelicolor er mest genetisk preget av slekten2,3 og er arten brukes i metodene som er beskrevet her. S. coelicolor har en kompleks livssyklus som starter med spiring om en enkelt spore, videre til en omfattende, forgrening vegetative mycel som vokser til agar medium. Som livssyklusen provenyet, dannes antenne filamenter som bryter overflatespenning av underlaget mycel og endelig er delt inn i lange kjeder som konverteres til slutt til modne, grå-pigmentert sporer. Spredning av disse nyopprettede sporer utgjør begynnelsen av neste livssyklus4.
På grunn av sin komplekse mønster av differensiering fungerer S. coelicolor som en utmerket modell for studiet av bakteriell utvikling. Historisk mutasjoner resultere i blokker for to store stadier av utvikling og produsere forskjellige visuelle fenotyper. Bld (skallet) mutanter blokkeres for antenne mycel dannelse og resultere i mangel på en god antenne mycel formidle en “skallet” kolonien utseende. Mutanter hemmet i spore formasjon og modning kalles whi (hvit) mutanter fordi de vanligvis ikke klarer å produsere vill-type nivåer av grå spore pigment og antenne mycel forblir hvit. Andre interessante mutanter er hemmet i antibiotika produksjon, celledeling, kromosom segregering eller andre viktige prosesser4,5.
Til tross for oppdagelsen av mange utviklingsmessige gener i Streptomyces arter, det er mange mer antas å eksistere basert på mangel på metning av mutant skjermer. Våre laboratorier fortsette å identifisere nye utviklingsmessige gener bruke Mini transposon system som vi har konstruert. Romanen mutant stammer isolert i tilfeldig mutagenese eksperimenter med våre transposon gjennomgå fenotypiske screening for å identifisere mulige rolle hver nye gen oppdaget6,7. Metodene for bakteriell phenotyping beskrevet her gjelder Streptomyces mutanter isolert av transposon mutagenese8,9,10,11,12, 13 og andre tilfeldige metoder, som kjemisk og ultrafiolette (UV) mutagenese14, samt rettet konstruksjonen av mutasjoner som gene slettinger med recombineering15,16 eller CRISPR-Cas9 (gruppert regelmessig Interspaced kort Palindromic gjentar) genomet redigering teknologi17,18,19 og punkt mutasjoner20.
Som antibiotikaresistens blant patogener blir stadig mer utbredt, blir behovet for nye antibiotika stadig mer påtrengende21,22. “Liten verden initiativ” (eller Sveitsisk) er en effektiv vitenskap, teknologi, ingeniørfag og matematikk (STEM) lære23 og forskning strategi-24 for å bekjempe antibiotikaresistens gjennom crowdsourcing studenter, og mer nylig high school-elever. Støttet kurs arbeid inkluderer identifisere nye jord mikrober som produserer romanen antibiotika (http://www.smallworldinitiative.org). Det antas at en viktig kilde til uoppdagede antibiotika vil fortsette å Streptomyces arter finnes i en rekke jord og vann habitater25,26,27,28, 29,31. Nylig, vårt laboratorium og andres arbeid har oppdaget og preget signalnettverk gener i Streptomyces arter som regulerer morfologi og utvikling, inkludert antibiotika produksjon7,32, 33. Endringer i uttrykket av disse genene medføre en endring i mengden og timing av antibiotika produsert. Dyktige phenotyping av nye arter og nye antibiotika-produserende mutanter vil fortsette å være viktig. Som ny instruktører og elevene blir store bidragsytere til feltet i stoffet funnet, er opplæring i bakteriell phenotyping nødvendig for at disse nybegynner individer. Videre er disse eksperimentene medgjørlig for videregående STEM universitetet mikrobiologi utdanning laboratorier. De representerer en demonstrasjon av grunnleggende mikrobiell genetisk prinsipper i en undervisning lab innstilling.
Her presenterer vi protokoller for begynnelsen Streptomyces forskere for å starte studier ved å inkludere trinnene for å overføre stammer og forberede aksjer for langtidslagring. Vi beskriver protokollene for visuell og mikroskopiske karakterisering av Streptomyces stammer. Noen typiske første trinnene i phenotyping utviklingsmessige mutanter er: 1) visuell undersøkelse mutant koloniene sammenlignet med vill type kolonier på agar medium; 2) kontrast mikroskopi; og 3) fluorescens mikroskopi av sporogenic antenne hyfer. Basert på fenotypen vises i disse tre trinnene, kan en rekke teknikker være ansatt lenger skjelne fenotypen av en bestemt stamme.
Første phenotyping eksperimenter brukes vanligvis til å beskrive nye arter, identifisere mutanter rundt, delvis karakterisere mutanter og begynner å skjelne typisk rollen som et bestemt gen basert på fenotypen av en identifisert mutant. Metodene som er beskrevet her er allerede brukt i university undervisning laboratorier for å identifisere og karakterisere en rekke Streptomyces mutanter, inkludert de med feil i celledeling48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54, sporulation55,56, antenne mycel formasjon57,58, antibiotika produksjon59, andre messenger signalnettverk47og kromosom segregering 60. disse teknikkene er de avgjørende første skrittene å bestemme fenotypen av mutanter generelt og avsløre mye viktig informasjon om rollene av gener av interesse. Metoder kan enkelt utvides til andre arter av Streptomyces og har allerede blitt brukt til å beskrive stammer av S. griseus, S. venezuelae, S. scabiesog mange andre streptomycetes. Video protokollene beskrevet her forventes å tjene som en viktig ressurs for nye forskere inn Streptomyces forskningsfelt, som i området i stoffet funnet. Dette inkluderer nye instruktører som arbeider for å bekjempe antibiotikaresistens krisen og utdanne utallige nye en student forskere med crowdsourcing innsats av Small World initiativ.
Teknikkene som beskrives her kan lett tilpasses college og high school klasserommet bruk i tillegg til forskningslaboratorier, bruke endringene beskrevet i video og tekst. Studenter i en første år mikroskopi modul på en liten liberal arts college kunne strek stammer, ta digitale bilder av stammer dyrket på agar media og utføre fase kontrast og fluorescens mikroskopi, som kulminerte i sending av et portefølje av flere paneled tall på slutten av modulen 3 ukers representerer 15t-lab arbeid. Ca 160 første års studenter var ansvarlig for den første phenotyping 320 romanen transposon mutanter. Undergraduate research studenter på tre institusjonene deltok i den første phenotyping av flere mutanter og påfølgende karakterisering av mange av stammene. Omfattende dataene innhentet i en relativt kort tidsperiode, viser verdien av protokollene beskrevet her. Hundrevis av ekstra mutanter er lagret som glyserol mycelial aksjer for fremtidige karakterisering.
Etter initial eksperimenter beskrevet her, kan en rekke metoder benyttes til å forlenge kvaliteten på informasjonen gjelder stammer av interesse. Hvis mutasjon er ukjent, bør genotyperingteknologi metode benyttes til å bestemme type og/eller plasseringen av mutasjon. For eksempel tilfeldige transposon mutagenese av vill-type kromosom6,7,8,9,10,11,12,13 resulterer i koloniene som skal gjennomgå første fenotypiske skjermer som beskrevet ovenfor. Deretter bør plasseringen av transposon identifiseres ved hjelp av en teknikk som inverse utvalg kjedereaksjon (iPCR)61. Avgjøre genotype nyoppdagede mutanter er et viktig skritt etter første karakterisering.
Noen brukte avanserte metoder for påfølgende phenotyping analyse som kan være nevnt i klasserommet eller utdypet videre forskning omfatter grønne fluorescerende protein (GFP) merking for å avgjøre lokaliseringen mønstre for protein av interesse, Gene expression analyser som virkelig tid kvantitative PCR (qPCR) og global gene expression mønstre av vill-type versus mutant via RNA sekvensering (RNA-seq). Phenotyping ferdigheter er også nødvendig for genetiske complementation analyse. I et complementation eksperiment, er vill-type kopi av et gen introdusert i en mutert stamme å fastslå om de nylig tillagte allelet kan kompensere for tap av funksjon av det muterte allelet. Sammenligne fenotypen av complemented belastningen for både den opprinnelige mutant og foreldrekontrollkoden, er vill-type belastning nødvendig.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å erkjenne Otterbein universitetet Undergraduate stipendiatstillinger Student og Student Research Fund priser til GVK og SGK; Otterbein Professor Gilbert E. Mills minnesmerket utstyrt sabbatsår programmet prisen og Institutt for biologi og Geovitenskap fakultet forskning og stipend utstyrt prisen til JAB. Bert og Jane Horn begavet Student Research Fund i realfag ble tildelt GVK og SGK. Forfatterne vil også takknemlig anerkjenner Duquesne University finansiert Undergraduate stipendiatstillinger programmet GVK og SGK. Tidligere Juniata undergraduate research studenter, Ryan Johnson og Lindsey Draper bidratt mikroskopi bilder for tall 2 og 3, henholdsvis.
50% Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Immersion Oil (Type DF) | Cragille | 16482 | |
Lens Paper | Fisherbrand | 11-995 | |
Sterile Water | GeneMate | G-3250-1L | |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Toothpicks (flat) | Target | 081-22-1957 | |
Pipette Tips (10 ml) | GeneMate | P-1240-10 | |
Pipette Tips (200 ml) | GeneMate | P-1240-200Y | |
Pipette Tips (1250 ml) | GeneMate | P-1240-1250 | |
Wooden Applicators 6'' | Solon Care | 070809 | |
Cotton Swabs | Fisherbrand | 23-400-124 | |
Soy Flour | Bob's Red Mill | 1516C164 | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-1KG | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
Glycerol 100% | VWR amresco life science | 0854-1L | |
0.8% NaCl (Saline) | Sigma-Aldrich | SLBB9000V | |
1.2 mL freezer tube | NEST | 606101 | |
Ultra low (-80°C) freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Cryo Safety Gloves | Bel-Art | H13201 | |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5856-500EA | |
Cover slips #1.5 | Thomas Scientific | 64-0721 | |
Slides | Carolina | 63-2010 | |
Autoclave | Tuttnauer | 2540E | |
Phase-Contrast Microscope | Olympus | BX40 | |
Forceps | Carolina Biological | 624504 | |
Bunsen Burner | Carolina Biological | 706706 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
PBS (phosphate buffer saline) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
WGA-FITC | Biotium | 29022-1 | |
Clear nail polish | OPI | 22001009000 | |
Image J | NIH | Free Software | |
100 mL beaker | Pyrex USA | 1000-T | |
1 L beaker | Carolina Biological | 721253 | |
1 L flask | Fisherbrand | S63274 | |
250 mL flask | Pyrex USA | 4980 | |
100 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721788 | |
500 mL graduated cylinder | Carolina Biological | 721792 | |
Stir Bar | Fisher Scientific | 22-271825 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Camera for Microscope | Olympus | DP72 | |
Nitrile Examination Gloves (Med) | Bio Excell | 71011002 | |
Vortex Mixer | Carolina Biological | 701077 |